As bactérias do gênero Aeromonas são importantes microrganismos aquáticos e agentes causais de doenças infecciosas em animais, inclusive o homem. Sua ampla distribuição em ambientes aquáticos continentais e marinhos é indicativa da sua capacidade de adaptação a distintos níveis de salinidade, fato por sua vez relevante na contaminação de alimentos. A tolerância bacteriana ao estresse salino está associada à manutenção da homeostase celular através de sistemas de transporte de íons e acúmulo de solutos orgânicos, como betaína, prolina, entre outros. A betaína é um osmoprotetor encontrado em plantas, animais e microrganismos sendo transportado em bactérias através de um sistema de transporte do tipo ABC específico codificado pelo operon ProU. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram: avaliar a tolerância ao estresse salino em Aeromonas, incluindo determinar o crescimento e a viabilidade celular em Aeromonas em estresse salino, avaliar a expressão dos genes de transporte de betaína após estresse salino e realizar uma análise in silico do operon proU em bactérias Gram negativas. Os resultados mostram que Aeromonas trota apresenta mais tolerância à salinidade do que Aeromonas hydrophila, sendo que algumas espécies de Aeromonas podem crescer em meio mínimo contendo até 0,42M de NaCl, concentração utilizada como agente de preservação de alimentos. A betaína atua como osmoprotetor em Aeromonas, determinando a sua capacidade de sobrevivência e crescimento em concentrações mais elevadas de cloreto de sódio (0,51 a 0,68M). Por outro lado, a colina, considerada importante precursor da betaína em algumas bactérias, não apresenta efeito osmoprotetor em Aeromonas. Avaliação de pré-crescimento com betaína mostram que este osmoprotetor é acumulado mesmo na ausência de estresse, determinando uma pré-adaptação bacteriana a mudanças de osmolaridade. Análise in silico do operon proU, responsável pelo transporte de betaína, mostra elevada conservação do mesmo em bactérias, indicando a importância deste transportador ABC. Experimentos de expressão do operon proU em A. hdydrophila mostraram expressão constitutiva basal e aumento significativo da expressão do operon proU em bactérias submetidas a estresse osmótico, mesmo na ausência do osmoprotetor. Assim sendo, a expressão do operon proU em A. hydrophila é modulada pelo estresse intracelular, de tal forma que a mesma volta a níveis próximos do basal quando a célula atinge a homeostase. / The bacteria from the Aeromonas genus are important aquatic microorganisms and causative agents of infectious diseases in animals, and even to mankind. Its wide distribution in continental aquatic and marine environments is an indicative of its ability to adapt to different levels of salinity, which is a relevant fact concerning food contamination. The bacterial tolerance to saline stress is associated with the maintenance of cellular homeostasis through ion transportation systems and the accumulation of organic solutes, such as betaine, proline, among others. Betaine is an osmoprotectant found in plants, animals and microorganisms, transported in bacteria by a transportation system of the ABC specific type, encoded by operon ProU. In this context, the objectives of this study were: to measure the tolerance to saline stress in Aeromonas, including determining the growth and cell viability in Aeromonas in saline stress, evaluate the expression of betaine transport genes after saline stress and create an in silico analysis of the proU operon in Gram negative bacteria. The results demonstrate that Aeromonas trota present more salinity tolerance than Aeromonas hydrophila, and that some Aeromonas species can grow in minimal environment containing up to 0.42 M of NaCl, concentration used as a food preservative agent. The betaine acts as an osmoprotectant in Aeromonas, determining their capacity to survive and grow in higher concentrations of sodium chloride (0.51 to 0.68 M). On the other hand, the choline, considered as an important betaine precursor in some bacteria, presents no osmoprotectant effect on Aeromonas. The evaluation of pre-growth with betaine show that this osmoprotectant is accumulated even in the absence of stress, determining a bacterial pre-adaptation to changes in osmolarity. The in silico analysis of the operon proU, responsible for betaine transportation, shows their high conservation in bacteria, indicating the importance of this ABC transporter. Expression experiments of the operon proU in A. hdydrophila showed constitutive basal expression and significant increase of the operon proU expression in bacteria exposed to osmotic stress, even in the absence of the osmoprotectant. Therefore, the operon proU expression in A. hydrophila is modulated by intracellular stress, in such manner, that it returns to close baseline levels when the cell reaches homeostasis.

A piplartina ou piperlongumina (PPLGM) é uma amida isolada de plantas do gênero Piper, da qual se obtêm as pimentas. As plantas desse gênero encontram-se distribuídas pelo mundo inteiro e têm sido utilizadas medicinalmente em diferentes culturas há muitos anos. A piplartina é o composto isolado desta espécie que mais se destaca, mostrando diferentes atividades biológicas e promissoras propriedades anticancerígenas. A resistência adquirida ao tratamento convencional é muito comum no câncer colorretal, na maioria dos casos devido à perda de função nas vias de apoptose e proteínas relacionadas ao ciclo celular. Sendo assim, buscou-se avaliar a capacidade da piplartina de induzir a morte celular na linhagem celular de carcinoma colorretal HCT 116. As células de HCT 116 selvagem e deficientes para as proteínas Bax, p21 e p53 foram tratadas com diferentes concentrações de piplartina, bem como a linhagem celular não tumoral Hek-293. Observou-se uma redução importante na viabilidade celular das células HCT 116, independentemente do estado de Bax, p21 e p53. As alterações morfológicas características de apoptose foram evidenciadas por coloração de Giemsa, microscopia eletrônica de varredura e coloração de laranja de acridina e brometo de etídeo. Para confirmar a indução de apoptose, foi realizado o ensaio de Anexina-V/PI, que evidenciou um aumento no percentual de células apoptóticas após o tratamento com piplartina, com o aumento da concentração relacionado ao aumento de células em apoptose tardia e pequeno aumento no número de células necróticas. A análise do ciclo celular mostrou alteração na distribuição tanto na linhagem selvagem quanto nas deficientes após o tratamento com a piplartina. Neste ensaio, o resultado mais expressivo foi o aumento de células na fase Sub-G0/G1, o que está relacionado à diminuição do conteúdo de DNA devido à fragmentação e indução de apoptose. Para avaliar a interação da piplartina com o DNA foram realizados ensaios com DNA plasmidial. Nesses ensaios, não foi observada interação direta da piplartina com o DNA, evidenciando sua ação indireta sobre o mesmo, que pode estar associado ao aumento de espécies reativas de oxigênio. Os dados aqui apresentados sugerem que PPLGM trata-se de uma molécula promissora na terapia de câncer colorretal. / Universidade de Caxias do Sul, UCS / Piplartine or piperlongumine is an amide isolated from plants of the genus Piper, from which the peppers is obtained. Plants of this genus are distributed all over the world, and have been used medicinally in different cultures for many years. From the isolated compounds found in these species, piperlongumine is the most outstanding, showing different biological activities and promising anticancer properties. Acquired resistance to conventional treatment is very common in colorectal cancer, in most cases due to loss of function in apoptotic methabolism and cell cycle protein regulation. Therefore, we sought to evaluate the ability of piperlongumine to induce cell death in HCT 116 colorectal carcinoma cell line. HCT 116 wild-type and lines deficient in Bax, p21 and p53 were treated with different concentrations of piperlongumine, as well as the non-tumor cell line Hek-293. A significant reduction in the cell viability of HCT 116 cells was observed, independent from Bax, p21 and p53 status. The morphological alterations from apoptosis were evidenced by Giemsa staining, scanning electron microscopy and acridine orange and ethidium bromide staining. To confirm apoptosis induction, Annexin-PI assay was performed, which evidentiate an increasing percentage of apoptotic cells after PPLGM treatment, with increasing concentrations related with higher percentage of late apoptosis stage and small increase of necrotic cells number. Cell cycle analysis showed altered distribution in both proficient and deficient cells after PPLGM treatment. In this assay, the most expressive result was the increase of Sub-G0/G1 cells phase, which is related to decrease DNA content due to fragmentation and apoptosis induction. To evaluate direct interaction of PPLGM with DNA, plasmidial DNA assays were performed. In this trials, there were no direct interaction of PPLGM with DNA observed, evidencing the indirect action of PPLGM through the increase of reactive oxygen species. The data presented here suggest that PPLGM should be a promising molecule in colorectal cancer therapy

O cultivo de Aspergillus oryzae IPT-301 em meio líquido foi estudado para avaliar a influência do pH e do suprimento de oxigênio sobre o crescimento fúngico e a formação de pectinases. Definiuse um meio limitante para o crescimento com as seguintes concentrações: farelo de trigo em extrato aquoso, 40g/L; glicose, 5g/L; sulfato de amônio, 5g/L; pectina cítrica (indutor), 20g/L. O indutor foi estudado quanto ao momento de adição ao meio. Com adição em 24h de cultivo, a máxima concentração de biomassa foi atingida em cerca de 70h, quase 48h depois do observado no ensaio controle. A atividade enzimática máxima (27U/mL) foi semelhante à condição de referência (24U/mL), mas a ausência da pectina no início do processo facilitou a mistura e o controle do pH e do oxigênio dissolvido. No caso, reduziram-se a máxima frequência dos agitadores do biorreator (650 para 600rpm) e o período de tempo em que este nível de agitação precisou ser mantido para possibilitar a oxigenação do meio (30h para 12h), o que favoreceria a preservação do micélio. Valores constantes e variáveis de pH do meio foram comparados em ensaios com adição de pectina em 24h e sem controle de oxigênio dissolvido. Verificou-se que o pH constante de 4,0 favoreceu o crescimento, que atingiu 4,5g/L, porém a atividade enzimática foi insignificante (1,4U/mL). Quando o pH decresceu naturalmente até o mínimo de 2,7, foram atingidos concentração de biomassa de 4,0g/L e atividade de pectinases de 24U/mL; na sequência, porém, a atividade baixou para 2U/mL, acompanhando o aumento do pH após 96h de processo. Entretanto, em cultivo em que o pH foi controlado em 2,7 nas horas finais do processo, a atividade enzimática foi preservada. Estes resultados, juntamente com os de ensaios enzimáticos, demonstraram que as pectinases de A. oryzae perdem a estabilidade à medida que o pH aumenta. O ensaio com pH constante em 2,7 foi o único em que a atividade pectinolítica foi superior quando a pectina esteve presente desde o início do cultivo. Possivelmente, a limitação do crescimento celular (máximo de 3,5g/L) favoreceu os mecanismos de transferência e mistura, prolongando a viabilidade celular. Cultivos com pH controlado em 4,0 no período de intenso crescimento celular e em 2,7 para a produção de pectinases (Ensaios T5 e T10) resultaram em elevadas atividades enzimáticas, especialmente quando a pectina foi adicionada em 24h (43U/mL). No caso, as mais efetivas condições de transferência de oxigênio e mistura, aliadas ao pH adequado ao crescimento, permitiram que a biomassa atingisse 6,3g/L e, após a redução do pH a 2,7, a atividade pectinolítica foi incrementada. Ensaios com oxigênio dissolvido em mínimo de 30% da saturação foram conduzidos em duas condições: Ensaio B5 - pH inicial 4,0 e controlado em 2,7 após atingir este valor; Ensaio B6 - pH constante em 4,0 até 24h, seguido de redução para 2,7 e controle neste valor. As concentrações celulares atingidas em B5 (6,0g/L) e em B6 (6,8g/L) foram semelhantes à de T10, mas suas máximas atividades pectinolíticas – 106 e 120U/mL, respectivamente – foram as maiores deste estudo. Estes resultados se deveram, provavelmente, à intensificação do metabolismo fúngico associado à disponibilidade ilimitada de oxigênio. Apesar de o tempo para atingir os picos de biomassa e atividade enzimática ter sido aumentado, a produtividade do Ensaio B6 foi 3,7 vezes maior que a do controle. Os resultados deste trabalho confirmaram que o pH e o suprimento de oxigênio em cultivos de A. oryzae afetam decisivamente tanto o crescimento quanto a produção de pectinases. As condições operacionais definidas possibilitaram a redução do crescimento celular – permitindo, entretanto, a obtenção de atividades enzimáticas elevadas – e, em decorrência, um controle eficiente dos parâmetros estudados. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The cultivation of Aspergillus oryzae IPT-301 in liquid medium was studied to assess the influence of pH and oxygen supply on the fungal growth and the formation of pectinases. A growthlimiting medium was defined with the following concentrations: wheat bran in aqueous extract, 40g/L; glucose, 5g/L; ammonium sulphate, 5g/L; citric pectin (inducer), 20g/L. The inducer was evaluated with respect to the time of addition to the medium. With the addition in 24h of cultivation, maximum biomass concentration was achieved in 70h, almost 48h after reaching the cell growth peak of the control experiment. The maximum enzyme activity (27U/mL) was similar to that of the reference run (24U/mL), but the absence of pectin at the beginning of the process favoured mixing and the control of pH and dissolved oxygen concentration. In this case, the maximum impeller speed in the bioreactor (650 to 600rpm) and the time period that this level of agitation was maintained to provide the best possible medium oxygenation were reduced (30 to 12h), a condition that could favour the preservation of mycelium. Constant and varied medium pH values were evaluated in experiments with the addition of pectin in 24h and without dissolved oxygen concentration control. It was found that a constant pH of 4.0 favoured biomass growth, but the enzyme activity was insignificant (1.4U/mL). When the pH naturally decreased up to a minimum of 2.7, biomass concentration of 4.0g/L and pectinase activity of 24U/mL were attained; in the sequence, however, the activity fell to 2U/mL following the increase of pH observed after 96h. Nevertheless, in the cultivation in which the pH 2.7 was maintained though the final hours of process, the enzyme activity was preserved. These results together with those from enzymatic tests have shown that A. oryzae pectinases loose stability as pH rises. The experiment with constant pH at 2.7 was the only that results in superior pectinase activity with pectin present in the medium from the beginning of the cultivation. Possibly, cell growth limitation (maximum of 3.5g/L) favoured mass transfer and mixing mechanisms and the biomass viability was extended. Cultivations with the pH controlled at 4.0 when the cell growth was more intense and, afterwards, at 2.7 for pectinase production (Experiments T5 and T10) result in high enzyme activities, especially when pectin was added in 24h (43U/mL). In the case, the more effective conditions of oxygen transfer and mixing, allied to the adequate pH for cell growth, allowed that biomass concentration achieved 6.3g/L and, after reducing the pH to 2.7, pectinolytic activity as increased. Experiments with dissolved oxygen concentration at a minimum of 30% of saturation were carried out at two conditions: Experiment B5 - initial pH 4.0 and controlled at 2.7 after reaching this value; Experiment B6 – constant pH up to 24h, followed by reduction to 2.7 and control at this value. The cell concentrations achieved in B5 (6.0g/L) and in B6 (6.8g/L) were similar to that of T10, but their maximum pectinase activities – 106 and 120U/mL, respectively – were the largest in this study. Such results were probably due to the raising fungal metabolism which is associated to the unlimited oxygen availability. Although the time to reach the peaks of biomass and enzyme activity has been increased, the productivity of Experiment B6 was 3.7 times larger than that of the control run. The results of this work have confirmed that, in cultivations of A. oryzae, the pH and the oxygen supply decisively affect both cell growth and pectinase production. The defined operational conditions provided the reduction of cell growth – allowing, however, the achievement of high enzyme activities – and, consequently, an efficient control of the studied parameters.

Na presença de lactose e frutose, ácido lactobiônico e sorbitol são formados equimolarmente em reações catalisadas por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glicono--lactonase (GL), enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis. O ácido lactobiônico tem alto valor comercial e, como o sorbitol, importantes aplicações industriais. Este trabalho objetivou estudar a cinética de produção de ácido lactobiônico e sorbitol por células de Z. mobilis permeabilizadas com brometo de cetil trimetil amônio, livres ou imobilizadas em alginato de cálcio. As constantes de saturação de Michaelis-Menten de GFOR/GL para lactose e frutose foram estimadas em 0,39 e 0,050mol/L, respectivamente, e Vmáx em 7,69 unidades de GFOR/GL por grama de células secas (U/g), em que U corresponde a mmol de produto formado por hora. A imobilização de Z. mobilis foi avaliada com suspensões celulares de 30, 50 e 70g/L, observando-se redução do fluxo de massa dos solutos através das esferas de alginato de cálcio com maiores massas de células. Como na bioconversão de lactose/frutose em ácido lactobiônico/sorbitol, um considerável volume do reator é ocupado pelas esferas, o uso da suspensão celular de 70g/L para a imobilização se mostrou favorável devido à menor quantidade do suporte para ter-se a concentração de células/enzimas desejada para o processo. Assim, os problemas operacionais associados à mistura e ao controle de pH foram minimizados. No processo de bioconversão, concentrações de biocatalisador, livre ou imobilizado, entre 5 a 20g/L resultaram em teores de ácido lactobiônico semelhantes, em torno de 170g/L, com rendimento de cerca de 70% e produtividades proporcionalmente crescentes. A velocidade específica de formação de produto calculada nas primeiras horas de processo com células imobilizadas ( 0,76g/g/h) foi menor que a medida com células livres (  2,0g/g/h) em razão de o suporte de imobilização atuar como uma barreira física para o transporte de massa. Na sequência, porém, constatou-se uma maior estabilidade do sistema imobilizado e, em consequência, produtividades semelhantes ( 7,1g/L/h) foram alcançadas em ambas as condições. Para avaliar-se possibilidade de reutilização das células imobilizadas, foram realizadas oito bioconversões seguidas – 193h de operação –, constatando-se a preservação de 85% da atividade inicial. Na bioconversão, o pH foi controlado em 6,4 com NaOH, sendo formado lactobionato de sódio. Este sal foi precipitado com etanol e, em seguida, convertido à forma ácida – ácido lactobiônico por cromatografia de troca iônica. O produto purificado apresentou características físico-químicas semelhantes às da substância padrão comercial. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Na presença de lactose e frutose, ácido lactobiônico e sorbitol são formados equimolarmente em reações catalisadas por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glicono--lactonase (GL), enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis. O ácido lactobiônico tem alto valor comercial e, como o sorbitol, importantes aplicações industriais. Este trabalho objetivou estudar a cinética de produção de ácido lactobiônico e sorbitol por células de Z. mobilis permeabilizadas com brometo de cetil trimetil amônio, livres ou imobilizadas em alginato de cálcio. As constantes de saturação de Michaelis-Menten de GFOR/GL para lactose e frutose foram estimadas em 0,39 e 0,050mol/L, respectivamente, e Vmáx em 7,69 unidades de GFOR/GL por grama de células secas (U/g), em que U corresponde a mmol de produto formado por hora. A imobilização de Z. mobilis foi avaliada com suspensões celulares de 30, 50 e 70g/L, observando-se redução do fluxo de massa dos solutos através das esferas de alginato de cálcio com maiores massas de células. Como na bioconversão de lactose/frutose em ácido lactobiônico/sorbitol, um considerável volume do reator é ocupado pelas esferas, o uso da suspensão celular de 70g/L para a imobilização se mostrou favorável devido à menor quantidade do suporte para ter-se a concentração de células/enzimas desejada para o processo. Assim, os problemas operacionais associados à mistura e ao controle de pH foram minimizados. No processo de bioconversão, concentrações de biocatalisador, livre ou imobilizado, entre 5 a 20g/L resultaram em teores de ácido lactobiônico semelhantes, em torno de 170g/L, com rendimento de cerca de 70% e produtividades proporcionalmente crescentes. A velocidade específica de formação de produto calculada nas primeiras horas de processo com células imobilizadas ( 0,76g/g/h) foi menor que a medida com células livres (  2,0g/g/h) em razão de o suporte de imobilização atuar como uma barreira física para o transporte de massa. Na sequência, porém, constatou-se uma maior estabilidade do sistema imobilizado e, em consequência, produtividades semelhantes ( 7,1g/L/h) foram alcançadas em ambas as condições. Para avaliar-se possibilidade de reutilização das células imobilizadas, foram realizadas oito bioconversões seguidas – 193h de operação –, constatando-se a preservação de 85% da atividade inicial. Na bioconversão, o pH foi controlado em 6,4 com NaOH, sendo formado lactobionato de sódio. Este sal foi precipitado com etanol e, em seguida, convertido à forma ácida – ácido lactobiônico por cromatografia de troca iônica. O produto purificado apresentou características físico-químicas semelhantes às da substância padrão comercial.

Orientador: Elias Basile Tambourgi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-28T03:32:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hirose_AndreLuisSakaguchi_M.pdf: 3299228 bytes, checksum: 5d6c0fe1dc897fb8c952d6febe4c979c (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A viabilidade da produção e comercialização de substâncias obtidas por meio de processos biotecnológicos depende de técnicas de separação empregadas na purificação dos compostos desejados. Algumas características das misturas envolvidas nesses processos, tais como baixa concentração inicial, necessidade de produtos de alto grau de pureza, sensibilidade térmica e necessidade de preservar as propriedades dos compostos, fazem com que esta etapa de purificação exija um processo econômico e que seja biologicamente compatível com os produtos envolvidos. Neste sentido, a extração líquido-líquido por sistemas aquosos bifásicos se apresenta como uma técnica de separação extremamente interessante. Tendo-se em vista o desenvolvimento de extratores mais eficientes, é fundamental o estudo da hidrodinâmica e dos mecanismos de transferência de massa no interior dos extratores. Este trabalho teve como objetivo principal o estudo de uma micro-coluna agitada por campânulas perfuradas pulsantes que foi usada para extração da proteína. O sistema de agitação formado por campânulas pulsadas tem como objetivo promover uma melhor mistura dos líquidos no interior da coluna e assim, aumentar a transferência de massa. Os estudos foram realizados com sistemas de duas fases aquosas formadas por PEG (polietileno glicol) e sal (fosfato de potássio mono e bibásico). Realizou-se o estudo da extração em descontínuo, a fim de encontrar-se as concentrações de equilíbrio e os melhores sistemas de extração (concentrações de PEG e de sal e massa molecular de PEG). A melhor condição obtida foi usada na operação contínua da micro-coluna. Pôde-se concluir que a coluna de extração testada teve um rendimento superior de proteína extraída que os encontrados nos tubos de ensaio, e é adequada para utilização em sistemas biotecnológicos / Abstract: The production and commercialization suitability of substance obtained by means of biotechnological processes depend on the separation techniques used for the purification of the desired compounds. Some features of the mixtures involved in these processes, such as low initial concentration, high purity level products desired, thermal sensitivity and the need of preserving the compounds properties, require a purification step that must be economical and biologically compatible with the chemicals involved. As a matter of fact, liquid-liquid extraction by aqueous two-phase systems is presented as an outstanding separation technique. The hydrodynamics and the mass transfer mechanism in the interior of the extractors are fundamental for the development of more efficient equipment. The more goai of this work was the study of a micro-column stirred by bell-shaped meshes for the extraction of a protein. The stirring system composed by the bell-shaped meshes promotes a better mixture of the fluids in the inner side of the column and, as a result, increase the mass transfer. The aqueous two-phase systems studied were formed by PEG (polyethyiene glycol) and salts (Potassium Phosphate monobasic and dibasic). It was done bath experiments, for finding the equilibrium concentrations and the better system for the extraction (PEG and salt concentrations and polymer molecular weight). The better condition obtained was used in the continuous extraction in the micro-column. As a conclusion, the extraction apparatus tested here had a much better yield of protein recovery than the observed in the batch system, what makes it suitable for use in biotechnologicai systems / Mestrado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Mestre em Engenharia Química

Orientador : Luzia Koike / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-28T17:35:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_ArildoJoseBrazde_D.pdf: 5836789 bytes, checksum: 4b0ab44ea695f126653235856b1fb6b3 (MD5) Previous issue date: 1999 / Doutorado

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T11:19:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MarcosAntoniode_D.pdf: 10137881 bytes, checksum: 489ef8cb6fa0b7dc1c2ef0cc841b23d3 (MD5) Previous issue date: 2003 / Doutorado

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:42:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SousaNeto_Roselide_D.pdf: 30860041 bytes, checksum: 3f5d868db4444903016efb1ad4544030 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Foram estudadas cinco lipases de microrganismos isolados no Laboratório de Bioquímica da Faculdade de Engenharia de Alimentos-FEA/UNICAMP sendo caracterizadas quanto à capacidade de hidrolisar óleo de mamona e diferentes substratos tais como: óleo de milho, soja, oliva e girassol e liberar ácidos graxos livres como produtos finais de reação. A lipase de Alcaligenes sp, foi selecionada neste estudo como a enzima de melhor capacidade hidrolítica frente aos diversos substratos utilizados. Os ácidos graxos liberados na reação de hidrólise, foram utilizados em meio de cultivo de fermentação submersa, composto por: 1% de glicose, 1% de autolisado de levedura como precursor na síntese de 'gama'decalactona. As amostras de meio de cultura foram analisadas através de extração líquido-líquido, utilizando acetato de etila como solvente de extração e padrão interno beta-ionona e posterior análise em cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama-FID. Duas linhagens de levedura, Geotrichum sp e Geotrichum fragans foram selecionadas como potencialmente produtoras de y-decalactona e estudos em relação aos parâmetros de produção de 'gama'-decalactona como: temperatura, pH, substratos e composição do meio de cultura foram realizados. A linhagem de Geotrichum sp e Geotrichum fragans, apresentou máxima produção de 'gama'-decalactona de 370 mg/L e 650 mg/L respectivamente, quando cultivadas em meio de cultura composto por óleo hidrolisado de mamona na concentração 5% e 1% de autolisado de levedura em 96 horas de cultivo a temperatura de 30°C, com agitação de 200 rpm em pH 6,0. / Abstract: Five lipases obtained ftom microorganisms isolated in the Biochemistry Laboratory of the Food Engineering Faculty-FEA-UNICAMP were studied and characterized for their hydrolytic capacity using castor oil and different substrates such as: com oil, soybean, olive and sunflower releasing of free fatty acids as the final reaction products. The lipase from Alcaligenes sp was selected as the enzyme that showed the best hydrolytic capacity using the different substrates evaluated. The fatty acids released by the hydrolytic reaction were used in a culture medium for submersed fermentation with the following composition: 1% glucose, 1% yeast as precursor for gamma-decalactone synthesis. The culture medium samples were analysed by liquid-liquid extraction using ethyl acetate as the extraction solvent and beta-iononeas the internal standard, followed by gas chromatography equipped with a tlame ionization detector (FID). Two yeast strains, Geotrichum sp and Geotrichum fragans were selected as potential gamma-decalactone producers and studies related to their production parameters performed such as: temperature, pH, substrate and culture medium composition. The strain of Geotrichum sp and Geotrichum fragans, showed maximum production of gamma-decalactone of 370 mg/L and 650 mg/L respectively, when cultivated on a culture medium containing 5% hydrolyzed castor-oil and 1% autolyzed yeast after 96 hours of cultivation at 30°C, 200 rpm and pH 6.0. / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:21:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_AndersonFerreirada_D.pdf: 5063595 bytes, checksum: a89c27e54c655a6c573bb69bd87d1ca2 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os microorganismos comumente usados na fermentação alcoólica são as leveduras, fundamentalmente a espécie Saccharomyces cerevisiae. Linhagens destas leveduras são utilizadas na produção de álcool para ser empregado como carburante em automóveis e para uso industrial na produção de perfumes e outros cosméticos, além de diversas bebidas fermentadas como cerveja vinho e destilados como cachaça. O álcool carburante tem grande importância para o Brasil, sendo produzido um volume de aproximadamente 170 bilhões de litros/ano. Em sua produção, o processo de centrifugação é o passo mais dispendioso e consome grande parte da energia utilizada pela usina. Na indústria vinícola e nas destilarias de produção de cachaça o passo crucial para a qualidade do vinho é o de decantação de leveduras, sendo que um tempo muito longo causa variações indesejáveis ao sabor pela liberação de compostos secundários das leveduras que permanecem em suspensão. Neste trabalho foi desenvolvido um protótipo com linhagens de levedura para torná-Ias floculantes condicionais. O gene FL05 foi colocado sob o controle de promotores reprimíveis por glicose e esta construção foi usada para transformar linhagens de laboratório. Desta maneira as células se tornaram capazes de se separar do meio de cultura por sedimentação após a exaustão do açúcar. Esta é uma tecnologia promissora que visa substituir a centrifugação na produção de etanol carburante e melhorar a qualidade das bebidas produzidas com base em fermentação. Este processo foi objeto de uma patente depositada no INPI sob o nº0001122 e negociado com a empresa GeneSearch, sendo uma das 7 patentes já negociadas na história da UNICAMP / Abstract: The most common microorganisms used in alcohol fermentation are yeast, especially of the Saccharomyces cerevisiae species. Strains of this yeast are used in fuel ethanol production, for industrial use and in production of many kinds of beverages such as wine, beer and sugar cane spirits (Brazilian cachaça). Ethanol fuel has a great importance in Brazil, being produced in a volume of 170 billions of liters per year. During production, the centrifugation process is the most expensive step and consumes a significant amount of the energy employed in this industry. In the wine industry and distilleries, the crucial step for the quality of the wine and sugar cane spirits resides in the yeast decantation. Longer decantation times cause undesirable variations in the flavor due to the release of secondary yeast metabolites, which remain in suspension. In this stufdy, we developed a prototype of conditional flocculent yeast. The FLO5 gene was placed under the control of glucose repressible promoters in plasmids, which were used to transform laboratory strains. Cells were then able to separate from the bulk medium by sedimentation after sugar exhaustion. This proved to be a promising technology for the substitution of centrifugation in industrial plants. Our process has been registered for patent receipt in the INPI under the number 0001122 and negotiated with the GeneSearch company, being one of just 7 patents negotiated in the history of UNICAMP / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Nelson Eduardo Duran Caballero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T00:39:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MachucaHerrera_AngelaElena_M.pdf: 4768752 bytes, checksum: bbfe2e28c845d51b2f793118e54a226e (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: A cepa brasileira de Thermoascus aurantiacus,. um fungo termófilo. foi estudada quanto as condiçeies de crescimento. produção de enzimas e ação sobre materiais lignocelulósicos. O fungo mostrou capacidade para crescer em meios de cul tivo que continham materiais lignocelulósicos como bagaço de cana, casca de arroz e serragem de Eucaliptus grandis. como únicas fontes de carbono. O crescimento do fungo nestes substratos foi melhor do que em substratos celulósicos. As condições ótimas de crescimento do fungo foram determinadas através de métodos estatisticos de otimização. As condiçõs ótimas obtidas em meio Czapek modificado foram: 0.8% (8.0 g/l) de glicose como fonte de carbono, 37.8 mEq/l (3.2 g/l) de NaN03 como fonte de nitrogênio em pH 6,0 a 48C. Nestas condições o fungo alcançou uma velocidade máxima de crescimento ae 4.74 -0.02 (mm/h). Um teor de 27.4% (p/p) de proteina foi obtida do micélio de Thermoascus aurantiacus aos 10 dias de crescimento em meio contendo 1,5% de glicose sob condições estacionárias. A proteina micelial foi hidrolisada e sua composição em aminoácidos foi determinada. A qualidade da proteina de T.aurantiacus é semelhante à proteína da soja e à sugerida pela FAO. Apresentando uma alta concentração de aminoácidos essenciais Na cultura contendo 1,5% de glicose, sob condições estacionárias e de agitação foi detectada a presença de etanol e metanol provavelmente produtos da fermentação de glicose pelo fungo. O fungo produzi enzimas celuloliti cas, hemiceluloliticas e ligninoliticas em maior ou menor quantidade, quando cultivado em meios que continham diferentes substratos de crescimento. As máximas atividades de endo-glicanase (1.49 UI/ml) e xilanase (1.20 UI/ml), foram obtidas em meio contendo 1.5% de glicose. Os máximos valores foram obtidos quando a glicose alcançou uma concentração de 0.3%. no sexto dia de crescimento. sob condições estacionárias. A atividade celulolitica de Thermoascus aurantiacus foi comparável à do fungo Trichoderma reesei (cepa selvagem), o fungo apresentou, atividade enzimática capaz de descolorir Remazol brilliant blue R. sendo que a máxima descoloração ocorreu quando foram adicionados ao meio 1.5% de glicose e 0.5% de serragem de Eucaliptus grandis, simultaneamente. Uma ligeira descoloração ocorreu quando o meio continha somente glicose. Uma alta atividade fenol oxidase foi obtida quando o fungo foi culivado em meio que continha 1,5% de serragem de Eucaliptus grandis e 0,5% de glicose. Nenhuma atividade foi obtida utilizou-se apenas glicose como fonte de carbono. Foi estudada a biodegradação dos componentes da madeira de Eucaliptus grandis (serragem e cavacos) . Após 21 dias de tratamento da madeira com Thermoascus aurantiacus, sob condições estacionárias e 50°C. obteve-se uma perda de peso de 6,7% para serragem e de 6,2% para cavacos, em cultura contendo 0.5% de glicose. Em ambos os casos (serragem e cavacos), o fungo atacou, principalmente, os componentes extraiveis em etanol/benzeno, provovando uma perda em peso de 64.4% na serragem e 59.0% nos cavacos / Abstract: Growth conditions, enzime production and lignocellulosic materials degradation by Brazilian strain of Thermoascus aurantiacus, were studied. The fungus showed ability to grow on lignocellulosic materials such as sugar cane bagasse, rice hull and Eucaliptus grandis sawdust, as single carbon sources. Growth of the fungus in these subtrates was better than cellulosic one. Statistical methods were applied for optimization of the growth conditions in Czapek-glucose (0,8%) modified medium in ph 6.0 at 48 degree degree and a NaN09 concentration of 37.8 mEq/1 (3.2 g/1) were observed. The growth rate value obtained in these conditions was 4.74 +- 0.02mm/h. Cultures of Thermoascus aurantiacus using glucose (1.50%) showed a 27.4% (w/w) of mycelila protein after 10 days incubation. Mycelial protein showed essential amino acids content similar to soybean protein and FAO standard requirements. Ethanol and methanol were detected in the extracellular medium of Thermoascus aurantiacus agitated as well as in stationary cultures using glucose 1.5%. Cellulolytic, hemicellilolytic and ligninolytic activities were produced when the fungus grown on a variety of substrates High endo-glucanase (1.49 UI/ml) and xylanase (1.20 UI/ml) activities were detected on glucose 1.5%. A higher enzyme activity was reached when the glucose concentration was reduced to 0.3% (sixth day) Thermoascus aurantiacus exhibits cellulolytic similar to Trichoderma reesei (wild strain). The higher decoloriation of Remazol brilliant blue (RBB-R) by cultures of Thermoascus aurantiacus in the presence of glucose (0.5% ) and Eucaliptus grandis sawdust (1.5%) simultaneously was observed. A light decolorization was observed when glucose was used as single carbon source. High phenol-oxidase activirty was reached when the fungal growth was on Eucaliptus grandis sawdust (1.5%) plus glucose (0.5%). No phenol-oxidase activity was observed when glucose was used as single carbon source. Sawdust and chips of Eucaliptus grandis biodegradation was studied. Growth of Theromoascus aurantiacus on Eucaliptus grandis resulted in a weight loss of 6.7% and 6.2%, for sawdust and chips respectively after 21 days of incubation at 50 degree on glucose 0.5% Fungal attack was more efficient on the extractives than other wood components. An extractive loss of 64.4% in sawdust and 59.0% in chips was obtained. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas