Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-15Bitstream added on 2014-06-13T19:01:10Z : No. of bitstreams: 1 barbosa_lcb_dr_araiq.pdf: 1542454 bytes, checksum: 327a840d830dd6df24f9ee9a47d53cff (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O sistema ParE-ParD é um sistema toxina-antitoxina bacteriano, sendo ParE a toxina e ParD a antitoxina. ParD é capaz de neutralizar a ação de ParE formando um complexo com o mesmo, o qual é eficaz na autorregulação do operon parDE. Estudos têm mostrado que a atividade tóxica de ParE ocorre inibindo a atividade da DNA girase, mas nenhum efeito desta proteína sobre a atividade da topoisomerase IV foi observado até hoje. Baseando-se na estrutura primária da toxina ParE de Escherichia coli, bem como nos escassos dados em relação a esta toxina, a meta deste trabalho foi a obtenção de peptídeos sintéticos baseados nesta proteína a fim de avaliar as sequências de aminoácidos responsáveis pela interação com as diferentes topoisomerases bacterianas, além de tentar isolar uma sequência polipeptídica com potencial atividade inibitória sobre essas enzimas. Utilizando modelagem molecular por homologia, um modelo tridimensional para toxina ParE de E. coli foi obtido e validado. Com base nos dados estruturais inferidos a partir do modelo da estrutura tridimensional de ParE, 12 peptídeos foram racionalmente desenhados e sintetizados pela metodologia da fase sólida. Ensaios de inibição in vitro da atividade de superenovelamento de DNA pela girase e de relaxamento de DNA pela topoisomerase IV foram realizados e indicaram que os peptídeos ParE3 (ParE 80-100), ParE8 (ParE 61-105), ParE10 (ParE 61-87) e ParE12 (ParE 61-79) atuam como bons inibidores de ambas enzimas. Ensaios de fluorescência intrínseca e anisotropia de fluorescência, empregando peptídeos sintéticos derivados de ParE, evidenciaram que o processo de inibição da atividade da DNA girase pela toxina ParE deve ocorrer por interação com a proteína GyrA da enzima. Foi iniciado neste trabalho os primeiros testes usando lipossomas como veículos... / The operon parDE encode a toxin-antitoxin system formed by ParE toxin and its antitoxin ParD. ParD is able to neutralize ParE action and is effective in autoregulation of the operon. Studies have shown that the toxic activity of the ParE occurs by inhibiting the activity of DNA gyrase, but no effect of this protein on the activity of topoisomerase IV has been observed yet. Based on the primary structure of the Escherichia coli ParE toxin, as well as the scarce data of this toxin, the aim of this work was to obtain synthetic peptides based on this protein in order to assess the amino acid sequences responsible for interaction with the bacterial topoisomerases, besides trying to isolate a polypeptide sequence with potential inhibitory activity against these enzymes. Using molecular homology modeling, a three-dimensional model for E. coli ParE toxin was obtained and validated. Based on structural data inferred from ParE threedimensional model, 12 peptides were rationally designed and synthesized by solid-phase method. Tests of inhibition of the supercoiling reaction of the DNA gyrase and inhibition of DNA relaxation by topoisomerase IV were performed and indicated that the peptides ParE3 (ParE 80-100), ParE8 (ParE 61-105), ParE10 (ParE 61 -87) and ParE12 (ParE 61-79) act as good inhibitors of both enzymes. Intrinsic fluorescence and fluorescence anisotropy assays, using synthetic peptides derived from ParE showed that inhibition process of activity of the DNA gyrase by ParE toxin must occur by interaction with the GyrA protein. In this work was started the first tests using liposomes as carrier vehicles for bioactive peptides derived from ParE. The peptides were efficiently encapsulated in soybean phosphatidyl choline liposomes. It was observed, although reduced, inhibition of bacterial growth when peptides encapsulated in liposomes were... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-23Bitstream added on 2014-06-13T19:19:49Z : No. of bitstreams: 1 rossetto_db_dr_araiq_parcial.pdf: 291749 bytes, checksum: ae8637199d26161742ff3d85e6251821 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-08-22T14:57:08Z: rossetto_db_dr_araiq_parcial.pdf,Bitstream added on 2014-08-22T15:02:09Z : No. of bitstreams: 1 000713136.pdf: 2398877 bytes, checksum: 8df0c65c21bdaeccecb3792c6d29b28f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Ácido retinóico (AR) regula a transcrição de uma série de genes envolvidos em proliferação celular, diferenciação celular e apoptose através de sua ligação com o receptor de ácido retinóico (RAR) ligado com o receptor de retinóide X (RXR) na forma de heterodímero. A proteína ligante de ácido retinóico celular (CRABP2) é envolvida no transporte do AR do citoplasma para o núcleo, atuando assim como uma proteína coativadora dos receptores retinóides nucleares. Com o objetivo de melhor entender o mecanismo de sinalização celular por ácido retinóico envolvendo CRABP2, foi utilizado o sistema de duplo-híbrido em levedura como uma ferramenta para identificação de interações físicas proteína-proteína. Um total de 20 proteínas candidatas ligantes de CRABP2 foram identificadas no rastreamento de duplo-híbrido, das quais cinco são relacionadas com regulação da transcrição, mais especificamente com o processo de remodelagem da cromatina: polipeptídeo do complexo T (TCP1), histona H3/família 3A (H3F3A), histona H3/família 3B (H3F3B), tubulina beta (TUBB) e fator associado ao CTD relacionado com SR (SCAF1). Esses resultados sugerem um papel mais direto de CRABP2 na remodelagem de cromatina e poderá revelar novos aspectos da regulação da transcrição mediada por receptores de ácido retinóico. Além disso, também foi abordado neste trabalho um estudo dos níveis de expressão dos receptores de ácido retinóico em resposta a agentes desmetilantes / Retinoic acid (RA) regulates the transcription of a series of genes involved in cell proliferation, differentiation and apoptosis by binding to RA Receptor (RAR) and Retinoid X Receptor (RXR) heterodimers. The cellular retinoic acid-binding protein 2 (CRABP2) is involved in the transport of RA from the cytosol to specific RA receptors in the nucleus, acting as a coactivator of nuclear retinoid receptors. In order to have a better understanding of the mechanism of cellular signaling by retinoic acid involving CRABP2, we used the yeast two-hybrid system as a tool for the identification of physical protein-protein interactions. A total of twenty putative CRABP2-interacting proteins were identified in the two-hybrid screen, out of which five are related to transcription regulation, more specifically to the process of chromatin remodeling: t-complex 1 (TCP1); H3 histone, family 3A (H3F3A); H3 histone, family 3B (H3F3B); tubulin beta (TUBB) and SR-related CTD-associated factor 1 (SCAF1). These results suggest a more direct role for CRABP2 in chromatin remodeling and may reveal new aspects of the control of transcription by RA receptors. Furthermore, we have also investigated the expression levels of the retinoic acid receptors, in mammalian cells in response to demethylating agents

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-15Bitstream added on 2014-06-13T18:41:24Z : No. of bitstreams: 1 aragon_cc_dr_araiq_parcial.pdf: 352399 bytes, checksum: 4041cfc92fd5c40daad9f3969d15d31d (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-23T17:35:46Z: aragon_cc_dr_araiq_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-02-23T17:36:21Z : No. of bitstreams: 1 000718951.pdf: 1019999 bytes, checksum: b74f94cf1bb93fd6c428e6e6426f5372 (MD5) / As xilanases são glicosidases que catalisam a hidrólise das ligações 1,4-β-xilosídicas da xilana e que possuem potencial biotecnológico em vários processos industriais, como na clarificação de sucos e vinhos, na fabricação de pães, na filtração da cerveja e no tratamento das polpas celulósicas. Recentemente, recebem atenção pela produção dos xilooligossacarídeos como ingredientes prebióticos. Embora possuam diversas vantagens sobre os métodos químicos, as enzimas são, geralmente, limitadas para uso industrial. A imobilização em suportes sólidos melhora a estabilidade dos biocatalisadores e o controle operacional, promovendo a recuperação do produto sem a contaminação pela enzima. Assim, os objetivos deste trabalho foram: produzir e caracterizar a xilanase de Aspergillus niger; imobilizar covalentemente, em suportes sólidos, a xilanase de A. niger e quatro outras, provenientes de diferentes fontes (Aspergillus versicolor, Trichoderma longibrachiatum, Thermomyces lanuginosus e Streptomyces halstedii); caracterizar os derivados obtidos; analisar o produto de hidrólise da xilana pelos derivados. A xilanase de A. niger mostrou ótima estabilidade até 55°C, com meia-vida de 15 minutos a 60°C, e sua produção foi induzida por pequenas concentrações de xilose. O fungo secretou pelo menos duas isoformas com atividade xilanolítica. A xilanase I foi purificada em uma única etapa, por adsorção em suporte ativado com quelatos, assim como a enzima de S. halstedii, contendo cauda de histidina. A xilanase de T. longibrachiatum (comercial) foi parcialmente purificada com suportes iônicos, e as de T. lanuginosus (comercial) e A. versicolor já apresentavam alto grau de pureza. As enzimas foram imobilizadas em agarose ativada com diferentes grupos reativos, com fatores de estabilização entre 12 (T. lanuginosus) e 600... / Xylanases are glycosidases that catalyze the hydrolytic cleavage of β-1,4-linked polymers of D-xylose and they have biotechnological potential in various industrial processes such as in the clarification of juices and wines, in the manufacturing of breads, in beer filtration and in the treatment of cellulose pulps. Recently, attention is given to the production of xylo-oligosaccharides as prebiotic ingredients. While enzymes have several advantages over chemical methods, they are generally limited for industrial use. Immobilization on solid supports improves the stability of the biocatalyst and the operational control, and promotes the easy recovery of the product without contamination by the enzyme. The objectives of this study were: to produce and characterize xylanases from Aspergillus niger; to immobilize the xylanase of Aspergillus niger and four others from different sources (Aspergillus versicolor, Trichoderma longibrachiatum, Thermomyces lanuginosus and Streptomyces halstedii) covalently on solid supports; to characterize the derivatives obtained; to analyze the products profile of xylan hydrolysis by the derivatives. The xylanase of A. niger showed excellent stability up to 55°C, with a half-life of 15 minutes at 60°C, and its production was induced by low concentrations of xylose. The fungus produced at least two isoforms with xylanolytic activity. Xylanase I was purified in one step by adsorption on support activated with chelates, as well as the histidine-tagged enzyme of S. halstedii. The xylanase of T. longibrachiatum (commercial) was partially purified with ionic supports, and those from T. lanuginosus (commercial) and A. versicolor already showed high degree of purity. The xylanases were then immobilized on agarose activated with different reactive groups, and presented stabilization factors between 12 (T. lanuginosus)... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-24Bitstream added on 2014-06-13T20:41:04Z : No. of bitstreams: 1 batistote_m_dr_araiq.pdf: 1258136 bytes, checksum: f9f580d2a88ef74edcdd73a29908a401 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente trabalho teve como objetivo principal realizar estudos do efeito da complexidade estrutural de fontes de nitrogênio no fluxo metabólico do carbono em leveduras industriais utilizadas nas indústrias de panificação, de produção de vinhos e cervejas. Os resultados obtidos com os carboidratos trealose e glicogênio estão de acordo com o comportamento esperado para o acúmulo destes compostos, uma vez que foi observado que a quantidade destes carboidratos de reserva nas células sofrem acentuadas variações em resposta a diferentes alterações nutricionais experimentadas pelas leveduras durante o processo fermentativo, e isto ocorre como conseqüência do complexo sistema regulatório que controla a produção dos carboidratos. A maioria dos dados indica que a quantidade de trealose e glicogênio foram sempre maiores na suplementação com amônio e menor com peptona. A concentração de trealose e glicogênio produzidas pelas linhagens talvez reflita o processo de seleção a que foram submetidas as linhagens, o tipo a e concentração da fonte de carbono, o tempo de fermentação e também com a natureza estrutural da fonte de nitrogênio. / The present work had as main objective to carry out studies of effects of the structural complexity of nitrogen sources in the metabolic flux of carbon in industrial yeasts used in the production of bread, wines, and beers. The results obtained with the carbohydrates trehalose and glycogen are in accordance with the expected behavior for the accumulation of these compounds, once it was observed that the amount of these reserve carbohydrates of in the cells suffers accented variations in response to the different nutritional alterations experienced by the yeasts during the fermentative process. This may occurs as consequence of the complex regulatory system that controls the production of the carbohydrates. The majority of the data indicates that the amount of trehalose and glycogen was always higher under ammonium and casamino acids supplementation than with peptone. Perhaps the concentration of trehalose and glycogen produced by the strains reflects the process of selection that the strains were submitted, the type and concentration of the carbon source, the time of fermentation and also with the structural nature of the nitrogen source.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-25Bitstream added on 2014-06-13T18:41:25Z : No. of bitstreams: 1 cano_vsp_dr_araiq.pdf: 7066563 bytes, checksum: 8a9c3624091ccc481f0a5993a6d2b85a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Em um rastreamento por duplo-híbrido, dois parceiros físicos de eIF5A foram identificados: Dys1 e Lia1 (Ligante de eIF5A). Lia1 foi identificada mais tarde como desoxihipusina hidroxilase. As interações físicas evidenciadas por duplo-híbrido foram confirmadas por copurificação. Mapeamento do sítios de ligação de eIF5A revelou que ambos os domínios N- e C-terminal podem ligar-se a Dys1, enquanto que o domínio Cterminal é suficiente para a ligação com Lia1. Pela primeira vez foi demonstrado in vivo que a estrutura secundária em -hélice, presente na extremidade N-terminal da proteína Dys1, pode modular a atividade da enzima através do impedimento estérico da entrada do substrato eIF5A no sítio ativo. Experimentos de inativação gênica mostraram que, em contraste com eIF5A e Dys1, Lia1 não é essencial para a viabilidade celular. Superexpressão do gene LIA1 não suprime o fenótipo temperatura-sensível de mutantes condicionais de eIF5A. Além disso, os alelos de TIF51A não são sinteticamente letais com a deleção de LIA1. Assim como previamente demonstrado para a enzima humana DOHH, o ferro também é essencial para a atividade hidroxilásica de Lia1. O sítio ativo de Lia1 é compreendido pelos resíduos de aminoácidos H79, E80, H112, E113, E116, H237, E238, H270 e E271. A proteína recombinante é uma mistura de formas ligada e não ligada ao metal, as quais foram separadas por gel nativo ou gel filtração, sugerindo um raio hidrodinâmico maior para a apoenzima. A forma mais alongada adotada por Lia1 na ausência do metal foi confirmada por ensaios de “quenching” da fluorescência do triptofano por acrilamida e SAXS. Além da alteração conformacional e inativação da enzima, a perda do metal levou à maior instabilidade de Lia1 na desnaturação térmica ou química. Os resultados obtidos em conjunto mostram que, além de manter a estabilidade da proteína... / In a two-hybrid screen, two eIF5A binding partners were identified: Dys1 and Lia1 (Ligand of eIF5A). Lia1 was further identified as deoxyhypusine hydroxylase. The two-hybrid interactions were confirmed by GST pulldown. Mapping binding sites for these proteins revealed that both eIF5A domains can bind to Dys1, whereas the C-terminal domain is sufficient to bind Lia1. We demonstrate for the first time in vivo that the N-terminal α-helix of Dys1 can modulate enzyme activity by impairing eIF5A interaction. Gene disruption studies showed that, in contrast to the essential nature of eIF5A and Dys1, Lia1 is not essential for cell viability. Overexpression of LIA1 gene does not suppress temperature-sensitivity of eIF5A mutants. Moreover, these TIF51A alleles are not synthetically lethal with a knockout strain of LIA1. Recently, It was shown that LIA1 encodes the enzyme responsible for the final step of hypusine formation, the metalloenzyme deoxyhypusine hydroxylase. As the hydroxylation step in hypusine synthesis is not required for eIF5A activity, lack of genetic interactions between these two genes is expected. As previously demonstrated for the human enzyme DOHH, iron is also essential for Lia1 hydroxylase activity. Lia1 active site is formed by aminoa cid residues H79, E80, H112, E113, E116, H237, E238, H270 and E271. The recombinat protein is a mixture of iron-bound and iron-free forms, which were separated by native gel or gel filtration, suggesting a bigger hydrodynamic radius for the apoenzyme. The elongated shape adopted by Lia1 in the absence of the metal was confirmed by acrylamide quenching of tryptophan intrinsic fluorescence and SAXS. In addition to the conformational change and enzyme inactivation, loss of iron led to higher instability of Lia1 during thermal or chemical unfolding. Taken together, the results show that, besides the ability of iron to keep the stability of the protein...(Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-07-24Bitstream added on 2014-06-13T20:41:05Z : No. of bitstreams: 1 novello_apf_dr_araiq.pdf: 2183203 bytes, checksum: 27042c5ec8d4993548db395a201c8898 (MD5) / Outros / Acidithiobacillus ferrooxidans (A. ferrooxidans) é uma bactéria quimioautotrófica capaz de oxidar íon ferroso ou sulfetos minerais para a obtenção de energia. Bornita e calcopirita são dois sulfetos de cobre que possuem a mesma composição elementar, mas diferem na susceptibilidade para a biolixiviação. Este trabalho teve por objetivo a análise proteômica diferencial de A. ferrooxidans em resposta à mudança do substrato íon ferroso para os sulfetos minerais calcopirita ou bornita. Comparativamente a outras doze linhagens de A. ferrooxidans, a linhagem LR apresentou uma das maiores velocidades de oxidação sobre ambos os minerais em experimentos de respirometria, sendo selecionada para ser utilizada na análise proteômica. Respostas de células de A. ferrooxidans LR à bornita ou calcopirita foram investigadas utilizando-se 2D-PAGE e espectrometria de massas. O perfil de proteínas totais de células livres expostas aos minerais por 24 ou 48 horas foi comparado com o perfil das células não expostas (controle). Para bornita, detectou-se indução na síntese das proteínas chaperonina (groEL), antioxidante da família AhpC/Tsa e aldeído desidrogenase, enquanto que proteína de domínio radical SAM, frutose-1-6-bifosfatase, proteína de choque térmico HslU, carboidrato quinase, ribulose bifosfato carboxilase e proteínas ribossomais S2 e L25 tiveram sua síntese reprimida. Alterações opostas na expressão protéica foram detectadas para duas formas da fructose-bifosfato aldolase, as quais apresentaram valores distintos de ponto isoelétrico, sugerindo o envolvimento de modificações pós-traducionais desta proteína em A. ferrooxidans em resposta à bornita. Todas as alterações detectadas para a bornita não foram observadas na presença de calcopirita, não sendo detectada pela abordagem utilizada qualquer alteração significativa em células expostas a este mineral... / Acidithiobacillus ferrooxidans (A.ferrooxidans) is a chemoautotrophic bacterium able to oxidize ferrous iron or mineral sulfides to obtain energy. Bornite and chalcopyrite are two copper sulfides having the same elemental composition but differ in relation to the susceptibility for bioleaching process. The aim of this work was to perform a differential proteomic analysis of the A. ferrooxidans response to the exchange of ferrous ion as an energetic substrate to the mineral sulfides chalcopyrite or bornite. Among twelve A. ferrooxidans strains, the LR strain presented one of the highest oxidative rates on both minerals by respirometric assays, and was chosen for the proteomic analysis studies. The bacterium responses to bornite or chalcopyrite were investigated by 2D-PAGE and mass spectrometry. The total protein profiles of cells exposed to bornite or chalcopyrite for 24 or 48 hours were compared to the one of control not exposed to minerals. For bornite, were detected an induction for the proteins chaperonin (groEL), AhpC/Tsa family antioxidant and aldehyde dehydrogenase, whereas the proteins radical SAM domain, fructose-1-6- bisphosphatase, carbohydrate kinase, HslU heat shock protein, ribulose bisphosphate carboxylase and the ribosomal proteins S2 and L25 were repressed. For the protein fructosebisphosphate aldolase two forms having distinct isoelectric points were observed suggesting pos-translational modification of this protein in the A. ferrooxidans response to bornite. No significant alteration of the protein expression was detected for cells exposed to chalcopyrite. Therefore, the proteomic analyses show that these minerals lead to distinct cellular responses in A. ferrooxidans. Distinct responses were detected by proteomic analysis of the periplasmic fraction for chalcopyrite-attached cells in relation to non-attached cells. The analysis by 2D showed four proteins that presented... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-30Bitstream added on 2014-06-13T20:21:38Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_hb_me_araiq.pdf: 1598700 bytes, checksum: 9f31d3b16656a31ddf594835f3745ebf (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A tanase (EC 3.1.1.20) é uma enzima induzível que age sobre os taninos hidrolisando suas ligações éster e depsídicas obtendo-se como produtos a glicose e o ácido elágico ou ácido gálico, sendo este último, um importante substrato para as indústrias farmacêutica e química. Entre os diferentes organismos capazes de produzir tanases, os microorganismos, de modo especial os fungos filamentosos, vêm se destacando uma vez que são mais versáteis na degradação de diferentes tipos de taninos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar as tanases intra e extracelulares do fungo filamentoso Emericella nivea produzidas em Fermentação Submersa (FSbm) e em Fermentação em Substrato Sólido (FSS), purificando-as e caracterizando-as bioquimicamente, além de imobilizá-las em suportes de agarose. Em princípio, foi realizada a seleção da melhor cepa produtora de tanases, submetendo-se 42 linhagens fúngicas a FSbm em meio de cultura Khanna com 2% de ácido tânico como fonte de carbono, por 3 a 4 dias a 30ºC, tendo sido o fungo Emericella nivea selecionado para prosseguimento do trabalho. Para este microorganismo os maiores nívies enzimáticos extracelulares foram obtidos em 3 dias de cultivo em FSbm e 8 dias em FSS, sendo para esta última utilizados produtos agroindustriais e folhas de vegetais de diferentes espécies secas trituradas umedecidas com água de torneira (1:1; p/v). As tanases extra e intracelular foram purificadas 61 e 2,5 vezes com recuperação de 30% e 8,8%, respectivamente. Eletroforese em condições não desnaturantes (PAGE 7%) mostrou a presença de uma única banda protéica revelada por prata e para atividade tanásica com a mesma mobilidade relativa. A forma extracelular possui massa molecular nativa de aproximadamente 322kDa com 50% de conteúdo de carboidratos. Já a enzima intracelular apresentou massa molecular nativa de 258kDa e 17% de... / Tannases (EC 3.1.1.20) are inducible enzymes that catalyze the hydrolysis of ester and depside bonds in hydrolysable tannins releasing glucose and ellagic acid or gallic acid, which is an important compound used in pharmaceutical and chemical industries. Among different organisms able to produce these enzymes, the microorganisms, especially filamentous fungi deserve attention since they can act on different tannins degradation ways. In this context, the aim of this work was to study the intra and extracellular tannases from the filamentous fungus Emericella nivea produced in Submerged Fermentation (SbmF) and Solid Substrate Fermentation (SSF), purifying and characterizing them biochemically, as well to immobilize the extracellular enzyme in agarose supports. First of all, it was selected the best tannase producer among 42 strains, in Khanna culture medium with 2% tannic acid as carbon source for 3-4 days at 30°C, and the fungus Emericella nivea was selected. This fungus produced high levels of extracellular enzyme at 3 and 8 days when cultivated in SbmF and SSF at 30°C, respectivally. FSS was performed with agroindustrial products or crushed dried leaves of different plants umidified with tap water (1:1, w/v). The extra and intracellular tannases were purified 61 times and 2.5-times, with recovery of 30% and 8.8%, respectivally. Non-denaturing electrophoresis (PAGE 7%), showed a unique proteic band stained by silver and for activity, both with the same relative mobility. The extracellular enzyme, probably, is a hetero-dimeric protein with native molecular mass of 322 kDa with 50% of carbohydrate content and the intracellular with native molecular mass of 258 kDa and 17% of carbohydrate. The optimum temperature were 45ºC and 50°C for the extra and intracellular enzymes, respectively and the optimum pH for both enzymes was 5.0. The soluble tannases were thermostable with... (Complete abstract click electronic access below)

Memorial apresentado ao Instituto de Química do campus de Araraquara da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", para a obtenção do título de Livre Docente junto ao Departamento de Bioquímica e Tecnologia Química. / Resumo: Não disponivel. / Abstract: Not available.

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Marcio Hipolito / Resumo: Durante a metamorfose dos anuros, além da natação, a cauda tem como função fornecer nutrientes necessários para as transformações morfofisiológicas da fase larval aquática em adultos terrestres, pois os animais não se alimentam durante esse período. A fosfatase alcalina é uma enzima importante na mobilização do fosfato necessário para o anabolismo de biomoléculas essenciais à vida, enquanto a fosfatase ácida é uma marcadora lisossomal. Nesse sentido, o objetivo desse estudo foi avaliar a atividade das fosfatases ácida e alcalina obtidas da cauda de girinos de rã-touro (Lithobates catesbeianus), visando fornecer informações acerca do processo de mobilização de nutrientes durante o desenvolvimento e a metamorfose. Os animais foram mantidos em aquários a 27 °C, e separados por estádios de desenvolvimento. As caudas foram coletadas de animais em cada estádio e homogeneizadas em tampões acetato, TRIS.HCl ou 2-amino-2-metil-1-propanol, contendo MgCl2 2 mM e ZnCl2 1 μM, centrifugadas a 10000 g, durante 10 minutos, a 4°C, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -70 °C. A atividade de p-nitrofenilfosfatase foi estável quando as amostras homogeneizadas foram armazenadas em diferentes valores de pH, contudo, a atividade da fosfatase alcalina reduziu aproximadamente 70% após 12 horas de armazenamento no pH 4. O pH ótimo aparente para a hidrólise do p-nitrofenilfosfato pelas fosfatases ácida e alcalina foi 5,0 e 10,5, respectivamente, enquanto a hidrólise do pirofosfato de sódio e do ATP para as atividades de pirofosfatase e ATPase foram de 7,5 e 7,0. A temperatura ótima para a atividade das fosfatases ácida e alcalina foi 45°C por 15 minutos de reação. O estudo da ação de compostos sobre a atividade da fosfatase alcalina revelou que o arsenato, EDTA, metavanadato, teofilina, levamisol, íons fosfato e o p-hidroximercuriobenzoato agem... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: During anurans metamorphosis, besides swimming, the tail has the function to supply with nutrients the morphophysiological changes of the larval aquatic stage to terrestrial adults, because the animals do not eat during this period. Alkaline phosphatase is an important enzyme in phosphate mobilization required to the anabolism of essential biomolecules, whereas the acid phosphatase is a lysosomal marker. Thus, the aim of this study was to evaluate the activity of acid and alkaline phosphatase obtained from the tail of bullfrog tadpoles (Lithobates catesbeianus), to provide information about the process of nutrients mobilization during development and metamorphosis. The animals were kept in aquaria at 27 °C, and separated by stages. The tails were collected from animals at each stage and homogenized in acetate buffers, Tris.HCl or 2-amino-2-methyl-1-propanol, containing 2 mM MgCl2 and 1 mM ZnCl2, centrifuged at 10000 g for 10 minutes at 4 °C, frozen in liquid nitrogen and stored at -70 °C. The activity of p-nitrophenylphosphatase was stable when the homogenized samples were stored at different pH values, however, alkaline phosphatase activity decreased about 70% after 12 hours of storage at pH 4. The apparent optimum pH for the hydrolysis of p-nitrophenylphosphate by acid and alkaline phosphatase was 5.0 and 10.5, respectively, while the hydrolysis of sodium pyrophosphate and ATP by the activities of pyrophosphatase and ATPase were 7.5 and 7.0. The optimum temperature for the activity of acid and alkaline phosphatases was 45 ° C for 15 minutes of reaction. The study of the action of compounds on the activity of alkaline phosphatase revealed that arsenate, EDTA, metavanadate, theophylline, levamisole, phosphate ions and p-hydroxymercurybenzoate act as inhibitors, and arsenate showed greater inhibition... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A família das serino proteases inclui diversas proteínas envolvidas em uma variedade de processos fisiológicos, como digestão protéica, regulação da pressão arterial e da coagulação sanguínea, entre outros. Quando disfuncionais, relacionam-se à condições patológicas graves como trombose vascular, embolismo pulmonar, infarto agudo do miocárdio, isquemia cerebral, bem como com o quadro da hemofilia B, ocasionada pela deficiência de fator IX. A investigação dos mecanismos de ação e a compreensão do funcionamento de serino proteases e de seus inibidores, as serpinas, é essencial para desvendar mecanismos de doenças e para a modelagem de fármacos mais específicos e eficientes. A pesquisa de fármacos anti-trombóticos busca desenvolver produtos capazes de interferir no processo hemostático que pode resultar no grave quadro trombo-embólico. A nitroforina-2 (NP-2), produzida na secreção salivar do inseto barbeiro Rhodnius prolixus, é uma proteína dotada de potente ação anti-hemostática, atuando como um inibidor específico do complexo tenase intrínseco (TF/FVIIa/FIX). Em trabalho anterior, nosso grupo identificou que o fragmento correspondente ao segmento 90-110 de NP-2 possui atividade anticoagulante. Um modelo do complexo fator IXa (fIXa)-NP-2 foi gerado a partir do “docking” do peptídeo de NP-2 na provável região de ligação com fIXa. Este complexo foi usado como ponto de partida para a simulação por dinâmica molecular e refinamento da estrutura. Novos peptídeos foram propostos como o objetivo de gerar estruturas com maior afinidade por fIXa. Identificamos o hexapeptídeo LKEADE como apresentando melhor afinidade por fIXa, o qual sugerimos como “template” para o planejamento racional de fármacos com ação anticoagulante e anti-trombótica. Numa outra vertente de nosso trabalho, estudamos a superfamília de proteínas denominada serpinas (serpins, ou “SERine Protease INhibitors”) que engloba um grande conjunto de proteínas dotadas de estruturas similares e provenientes de vários e distintos organismos. A função inicialmente identificada para as serpinas foi de inibição de serino proteases da coagulação sangüínea; entretanto, muitas serpinas perderam esta função.Nestes estudos foram usados modelos ocultos de Markov para criar modelos e descrições possibilitando classificar as serpinas em relação à sua função biológica. Foram criadas assinaturas para cada grupo: seqüências consenso e padrões de aminoácidos distintos para cada modelo/função correspondente. Um modelo específico para serpinas da coagulação sangüínea foi criado. Para este modelo, foi gerada a expressão regular [IVTLM]-[FLVA]- F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV] que descreve tal função. Além disso, ela codifica a seqüência de uma importante região envolvida na mudança conformacional e no funcionamento da serpina. Tanto esta seqüência quanto a estrutura secundária correspondente podem ser melhor investigadas, por sugerirem um alvo para inibição ou ativação. / The protein family of serine proteases comprises molecules involved in a wide range of physiological processes, such as regulation of blood pressure and coagulation. Dysfunctional serine proteases are related to pathological conditions such as embolism, heart failure, cerebral ischemia and also hemophilia B (the latter being a consequence of factor IX deficiency). The understanding of serine proteases mechanism of action, as well as of their inhibitors is a key step to the discover and develop new drugs. In the study of homeostasis, the search for anti-thrombotic drugs seek to avoid thrombosis and related conditions. The protein nitrophorin-2 (NP-2), found in the salivary glands of the hematophagous insect Rodnius prolixus, is a specific inhibitor of the intrinsic tenase complex (TF/fVIIa/fIX). In previous studies, we identified the NP-2 fragment (amino acid sequence 90-110) showing anticoagulant activity. Models of the complex factor IXa (fIXa) – NP-2 were created. This complex was used as a starting point for the molecular dynamic simulations and structure refinement. New NP-2 peptides were suggested, in order to achieve higher affinity complexes. We identified the hexapeptide LKEADE as showing higher affinity for fIXa, which we suggest to be used on rational drug design studies for anticoagulant drugs. The superfamily of proteins known as serpins (“Serine Protease Inhibitors”) involve a number of similar structures, found in a wide variety of organisms. Its function was initially identified as an inhibitor of blood clotting serine proteases. However, many serpins have lost that function in the course of natural evolution. Hidden Markov models were then used to create profiles classifying those proteins due to their biological function. We created signatures for each group of functional serpins in the form of consensus sequences and distinct amino acid patterns. A blood clotting-specific model was generated, which has yielded the regular expression [IVTLM]-[FLVA]-F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV]. Such pattern also codes for a region of the structure involved in an extensive conformational change. The change is related to the activation of the serpin, and, therefore, both pattern and sequence should be investigated. Combined, these information suggest a powerful target for blood clotting inhibition.