Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-11-14T03:23:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348747.pdf: 2500699 bytes, checksum: 37158baf64bce270811a31f04240c949 (MD5) Previous issue date: 2017 / Nas últimas décadas, a disseminação de bactérias patogênicas e resistentes, tornou-se uma preocupação a nível mundial. As metodologias fenotípicas e moleculares tradicionais são laboriosas, requerem muito treinamento técnico e possuem altos custos. O sistema MALDI-TOF/MS, metodologia emergente da espectrometria de massas aplicada à microbiologia, é utilizado na rotina como método de identificação por inoculação direta de bactérias e mostrou-se promissor na determinação precoce da relação epidemiológica de isolados. Os Staphylococcus spp. resistentes à meticilina (MRS) e Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) são importantes patógenos oportunistas que causam Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS). Assim sendo, o nosso trabalho tem como objetivo analisar biomarcadores proteicos para estudos de identificação, resistência e variabilidade de isolados de MRS e VRE. Os isolados são provenientes do Hospital Universitário (HU/UFSC, Florianópolis/SC, Brasil), coletados entre abril de 2015 e março de 2016 de pacientes, profissionais da saúde, e ambiente hospitalar de cinco alas do hospital: Emergência (EMG), Unidade de Terapia Intensiva (UTI), Centro Cirúrgico (CCR), Clínica Médica I (CMI) e Clínica Cirúrgica I (CRI). Das 1.759 amostras coletadas, foram isolados 17 VRE e 72 MRS. Desses, catorze foram identificados como S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) e quinze como E. faecium resistentes à vancomicina. Nossos resultados apontam que o protocolo de MALDI-TOF validado neste trabalho para análises microbiológicas mostrou poder discriminatório para identificação dos isolados a nível de gênero, tanto para VRE quanto para MRS, analisando-se proteínas na faixa de 2.000 a 20.000 Da. Para Staphylococcus spp., os biomarcadores proteicos identificados permitiram uma análise robusta para identificação das espécies, mas não mostraram poder discriminatório suficiente para análises de marcadores de resistência à oxacilina e vancomicina ou de variabilidade e clonalidade. Para a identificação dos Staphylococcus coagulase negativa (SCoN) foram encontrados quatro picos exclusivos para S. sciuri resistentes à oxacilina (MRSCi), quatro para S. haemolyticus resistentes à oxacilina (MRSH) e dezessete para S. warneri resistentes à oxacilina (MRSW). Na tentativa de diferenciar MRSA dos MSSA, foram obtidos nove picos com especificidade e sensibilidade consideráveis, mas somente dois, m/z 2302±2 Da e 3073±2 Da possuem valores relevantes da área sob a curva (AUC) para futuras pesquisas. No caso do VRE, o pico m/z 4430±3 Da foi comum para todas as amostras, entretanto não foi possível identificar picos comuns para identificação das espécies nem para estudos de prospecção de resistência bacteriana. Finalmente, apesar de bem estabelecido para identificação bacteriana, nossos dados sugerem cautela na interpretação dos resultados de MALDI-TOF/MS para estudos de resistência e variabilidade até que modelos computacionais estejam bem validados. / Abstract : Within the last decade, the characterization of pathogenic and resistant bacteria has become a worldwide concern. The conventional microbiology and molecular biology methods are time-consuming, require technical skills training and are costly. Matrix-assisted laser-desorption-ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), an emerging methodology of mass spectrometry applied to microbiology, is a method routinely used for bacterial identification using a whole cell of bacteria and has shown promise in the prompt determination of epidemiological relatedness of clinical isolates. Methicillin-resistant Staphylococcus spp. (MRS) and vancomycin-resistant Enterococci (VRE) are important opportunistic pathogens that cause Healthcare-associated Infections (HAI). The aim of this study was to analyze protein biomarkers for bacterial identification, resistance and variability of MRS and VRE isolates compared to standard strains and control strains. The isolates were collected from the University Hospital (HU/UFSC, Florianópolis/SC, Brazil), between April 2015 and March 2016 from patients, health workers and the hospital environment of five hospital units: Emergency Department (ED), Intensive Care Unit (ICU), Surgical Center (SC), Medical Clinical Unit (MCU) and Surgical Clinical Unit (SCU). From the 1,759 samples that were obtained, 17 VRE and 72 MRS were isolated. Among then, fourteen were identified as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and seventeen as vancomycin-resistant Enterococcus faecium. Here we show that the MALDI-TOF protocol validated in the study conditions for microbiological analysis showed discriminatory power for the identification of the isolates at the genus level, for both VRE and MRS, analyzing proteins in the range of 2,000 to 20,000 Da. The identified protein biomarkers to Staphylococcus spp. allowed a robust analysis for species identification. However, they did not show sufficient discriminatory power for analyzes of oxacillin and vancomycin resistance markers or of variability and clonality. For the identification of coagulase-negative staphylococci (CoNS), four unique peaks were found for methicillin-resistant S. sciuri (MRSCi), four for methicillin-resistant S. haemolyticus (MRSH) and seventeen for methicillin-resistant S. warneri (MRSW). In an attempt to differentiate MRSA from MSSA, nine peaks with considerable specificity and sensitivity were obtained, but only two, m/z 2302±2 and 3073±2 have relevant area under the curve (AUC) values for future research. In the case of VRE, the peak m/z 4430±3 was common for all samples; however it was not possible to identify common peaks for identification of the species or for prospective studies of bacterial resistance. Finally, although well established for bacterial identification, our data suggest caution in the interpretation of MALDI-TOF/MS results for studies of resistance and variability until computational models are well validated.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-11-14T03:25:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348745.pdf: 3945904 bytes, checksum: ddf577110c8eedff4520ef61978e6a0e (MD5) Previous issue date: 2017 / As bactérias da família Enterobacteriaceae estão entre os micro-organismos de maior relevância nas infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), devido à alta prevalência e à facilidade de adquirir e transmitir genes de resistência aos antimicrobianos. O objetivo do presente trabalho foi identificar e caracterizar enterobactérias coletadas entre abril-setembro/2015 no HU-UFSC. Um total de 180 pontos de coleta foram monitorados mensalmente em cinco unidades hospitalares, incluindo pacientes, profissionais de saúde e ambiente hospitalar, o que totalizou 1.080 amostras, que foram semeadas em ágar MacConkey. Obteve-se 210 amostras positivas para enterobactérias (76,9%) e 284 isolados. Os isolados foram identificados por método automatizado (Vitek2®) e sequenciamento de um fragmento do gene 16S rRNA (MiSeq System, Illumina). MALDI-TOF (Vitek MS) e sequenciamento do gene rpoB também foram aplicados para alguns isolados. A resistência das enterobactérias foi determinada pelo TSA (Vitek2®) e pela pesquisa de genes codificadores de ß-lactamases (qPCR). As maiores proporções de amostras positivas foram em pacientes (44,4%), seguidas de ambiente (16,1%) e profissionais (6,9%). As maiores taxas foram nos swabs retais dos pacientes (89,4%) e nas áreas de repouso e alimentação dos profissionais (40,5%). Os métodos de identificação Vitek2® e 16S rRNA tiveram excelente concordância a nível de gênero (82,8%) e de espécie (90,8%), apesar de algumas discordâncias, principalmente para o gênero Enterobacter spp., que foi melhor identificado pelo rpoB. As enterobactérias mais abundantes foram E. coli (20,1%), K. pneumoniae (19,4%), Pantoea spp. (19%) e E. cloacae complex (17,3%). Um total de 35% das enterobactérias foram classificadas como MDR, 30,9% foram resistentes às cefalosporinas de espectro estendido (ESC-R) e 14,5% resistentes aos carbapenêmicos (CARB-R). O gene de resistência mais frequente foi blaSHV (20,1%), seguido de blaCTX-M-1 (10,2%), blaCTX-M-8 (8,7%), blaCTX-M-9 (4,6%), blaKPC (4,6%) e blaCTX-M-2 (0,4%). A distribuição de bactérias MDR, ESC-R e CARB-R foi homogênea entre pacientes, profissionais e ambiente, indicando ampla disseminação pelo hospital. Esse estudo contribuiu com informações relevantes sobre a distribuição, abundância e caracterização do perfil de resistência das enterobactérias circulantes no HU-UFSC, podendo ser utilizado para o delineamento de novas estratégias para redução de IRAS. / Abstract : Some of the most concerning microorganisms found in HAI (Health-care Associated Infections) belong to the Enterobacteriaceae family, due to their high prevalence and risk of acquiring resistance genes. The aim of this study was to identify and characterize enterobacteria collected between Apr-Sep/2015 at HU-UFSC. Monthly, a total of 180 collection points were monitored in five hospital units, including samples from patients (PT), healthcare workers (HCW) and hospital environment (HEV). The 1,080 samples were seeded in MacConkey agar. A total of 210 samples were positive for enterobacteria (76.9%) and 284 isolates were obtained. The isolates were identified by an automated system (Vitek2®) and by 16S rRNA sequencing (MiSeq System, Illumina). MALDI-TOF (Vitek® MS) and rpoB sequencing were also applied for some isolates. The resistance profile was determined by AST (Vitek2®) and by the presence of ß-lactamases encoding genes (qPCR). The samples that presented higher proportion of enterobacteria were from PT (44.4%), followed by HEV (16,1%) and HCW (6.9%). The highest rates were from PT rectal swabs (89.4%) and rest/dinning areas of the HCW (40.5%). The identification methods Vitek2® and 16S rRNA presented excellent concordance rates at genera (82.8%) and species level (90.8%). Although there were some discordances, especially for Enterobacter spp., that was better identified by the rpoB gene. The most abundant enterobacteria were E. coli (20.1%), K. pneumoniae (19.4%), Pantoea spp. (19%) and E. cloacae complex (17.3%). A total of 35% of the enterobacteria were classified as multi-drug resistant (MDR), 30.9% were resistant to extended spectrum cephalosporins (ESC-R) and 14.5% were resistant to carbapenems (CARB-R). The most frequent resistance gene was blaSHV (20.1%), followed by blaCTX-M-1 (10.2%), blaCTX-M-8 (8.7%), blaCTX-M-9 (4.6%), blaKPC (4.6%) and blaCTX-M-2 (0.4%). The MDR, ESC-R and CARB-R enterobacteria distribution was homogeneous between PT, HCW and HEV, highlighting their wide distribution in the hospital. This study gave relevant information about the distribution, abundance and resistance profile of the HU-UFSC circulating enterobacteria. These findings could play an important role in developing new strategies for HAI control.

Submitted by Juliana Carvalho (juma.andrade@gmail.com) on 2018-08-16T12:56:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Digital.pdf: 1627062 bytes, checksum: 67f59becf12b9f50517eaaff5f564782 (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Reis (vanessa.jamile@ufba.br) on 2018-08-27T11:51:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Digital.pdf: 1627062 bytes, checksum: 67f59becf12b9f50517eaaff5f564782 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-27T11:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Digital.pdf: 1627062 bytes, checksum: 67f59becf12b9f50517eaaff5f564782 (MD5) / FAPESB/CNPq / Atualmente, as microalgas são consideradas uma fonte promissora de energia para a produção de biocombustíveis pelo fato de apresentarem rápido crescimento, não necessitarem de terras aráveis para seu cultivo e não contribuírem para o aquecimento global ou a emissão de gases de efeito estufa. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho é desenvolver uma metodologia para a produção de bioetanol a partir de biomassa da microalga Euglena gracilis (espécie ainda não estudada). Alguns parâmetros foram avaliados com intuito de aumentar a produção de paramylon como, meio de cultivo (mineral e lactato), métodos de separação da biomassa (centrífuga e rotaevaporador) e estresse com FeCl2. Além disso, tipos de hidrólise (ácida e enzimática) foram avaliadas visando o aumento da produção de bioetanol. A etapa de hidrólise foi importante para a produção de açúcares redutores. Ácido sulfúrico diluído (0,06% (v/v)) foi utilizado na hidrólise ácida e a mesma aconteceu em uma autoclave vertical a 127 °C e 10 minutos. Já a hidrólise enzimática foi realizada pela Cellulase (50 mL/L) por 72 h. As amostras hidrolisadas foram fermentadas pela levedura Saccharomyces cerevisiae e avaliou-se a produção de bioetanol em diferentes tempos de fermentação (3h, 1h e 30 min). O bioetanol foi caracterizado e quantificado por cromatografia gasosa (CG-FID). A centrifugação como método de separação de biomassa resultou em maiores concentrações de açúcar redutor. O tempo de fermentação de 30 minutos gerou maiores concentrações de etanol e, o maior rendimento da fermentação (50%) foi obtido partindo-se de um cultivo mixotrófico e hidrólise enzimática a partir de uma concentração inicial cerca de 15g/L de biomassa seca. Estes resultados podem tornar E. gracilis uma matéria-prima potencial para a produção de bioetanol.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2015-12-17T16:50:21Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_EstudoCinéticaFormação.pdf: 5105360 bytes, checksum: a4b1b10b0acee43cc1c416afd0e6612f (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-01-15T16:13:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_EstudoCinéticaFormação.pdf: 5105360 bytes, checksum: a4b1b10b0acee43cc1c416afd0e6612f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-15T16:13:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_EstudoCinéticaFormação.pdf: 5105360 bytes, checksum: a4b1b10b0acee43cc1c416afd0e6612f (MD5) Previous issue date: 2015 / As radiodermatites são efeitos secundários que podem comprometer a dose e a adesão à radioterapia, em pacientes com câncer. Substâncias radioprotetoras não tóxicas, capazes de prevenir ou minimizar esses danos, são necessárias. A espécie Melaleuca leucadendron e a pilocarpina possivelmente apresentam essa capacidade. O objetivo da pesquisa foi desenvolver e avaliar nanoemulsões com extrato etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron e cloridrato de pilocarpina para o uso potencial como radioprotetor tópico. O extrato de M. leucadendron foi obtido e apresentou conteúdo fenólico de 10,23%. O cloridrato de pilocarpina não apresentou capacidade antioxidante. O extrato e o óleo de girassol foram altamente antioxidantes, apresentando CE50 de 17,0 ±0,59 μg/mL e 6,39 ±0,27 mg/mL, respectivamente, pelo método DPPH. Nanoemulsões estáveis foram obtidas combinando óleo de girassol, monoestearato de sorbitano e óleo de rícino hidrogenado e etoxilado, através do método de inversão de fases. Boa incorporação do extrato às nanoemulsões foi obtida ultrassonicando o mesmo com o tensoativo hidrofílico previamente ao aquecimento da fase oleosa. O cloridrato de pilocarpina foi adicionado durante o processo de resfriamento das formulações. A nanoemulsão base e as nanoemulsões com extrato, pilocarpina ou ambos ativos apresentaram tamanho de partícula entre 70 e 80 nm, com baixo índice de polidispersão. Essas quatro emulsões apresentaram pH e temperatura de inversão de fases característicos de sistemas estáveis e condizentes com o método de obtenção utilizado. O potencial zeta dessas nanoemulsões foi superior a 30 mV em módulo, conferindo estabilidade eletrostática às mesmas. As formulações permaneceram inalteradas em até 60 dias de armazenamento, mesmo após os ensaios de estabilidade. Foi observada citotoxicidade dependente das concentrações do extrato e/ou pilocarpina, sendo que nanoemulsões com quantidades totais de ativos inferiores a 500μg/ mL apresentaram viabilidade celular superior a 80%. As nanoemulsões foram capazes de manter, com certa redução, os potenciais antioxidantes do extrato e do óleo de girassol e um possível sinergismo entre os dois foi observado. As formulações com pilocarpina apresentaram atividade antioxidante decorrente do óleo na composição. As concentrações eficazes foram bastante inferiores às com toxicidade acima do aceitável. As nanoemulsões obtidas foram caracterizadas como potenciais radioprotetores para uso tópico, sendo necessário confirmar essa ação em estudos posteriores. _______________________________________________________________________ / ABSTRACT : Radiodermatites are side effects that may compromise dose and adherence to radiotherapy in cancer patients. Non-toxic radioprotectors, to prevent or minimize these damages, are necessary. Melaleuca leucadenron specie and pilocarpine possibly present this ability. The aim of this study was to develop and evaluate nanoemulsions containing crude ethanol extract of Melaleuca leucadendron’s leaves and pilocarpine hydrochloride for potential use as a radioprotective topic. Extract of M. leucadendron was obtained and presented phenolic content of 10.23%. Pilocarpine hydrochloride did not show antioxidant activity. Extract and sunflower oil were highly antioxidant, with IC50 of 17.0 ± 0.59 μg / mL and 6.39 ± 0.27 mg / mL, respectively, by DPPH method. Stable nanoemulsions were obtained by combining sunflower oil, sorbitan monostearate, and ethoxylated hydrogenated castor oil, by phase inversion method. Good incorporation of the extract in nanoemulsion was obtained by sonication with the hydrophilic surfactant before heating the oil phase. Pilocarpine hydrochloride was added during the cooling process of the formulations. Free nanoemulsion and nanoemulsions with extract, pilocarpine or both, presented particle size in the range of 70 and 80 nm, with low polydispersity. These four emulsions showed pH and phase inversion temperature characteristic of stable systems, consistent with the method of production used. Zeta potential of these nanoemulsions was more than 30 mV in magnitude, giving them electrostatic stability. Formulations have not changes during the period of 60 days, even after stability tests. Depending on the concentrations of the extract and / or pilocarpine cytotoxicity was observed, and nanoemulsions with total quantities of active lower 500 μg / mL showed a 80% cell viability. Nanoemulsions were able to maintain, with just a sligth reduction, the antioxidant potential of the extract and sunflower oil, and possible synergism between the two was observed. Formulations with pilocarpine showed antioxidant activity due to the oil in its composition. Effective concentrations were much lower than concentrations with toxicity above the acceptable. Nanoemulsions obtained were characterized as potential radioprotective for topical use, being necessary to confirm this action in subsequent studies.

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2016-04-12T18:33:25Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ProduçãoPurificaçãoCaracterização.pdf: 1800894 bytes, checksum: 81ba847b0ec8fcfae1907bb11bb2a53e (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-04-12T19:06:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ProduçãoPurificaçãoCaracterização.pdf: 1800894 bytes, checksum: 81ba847b0ec8fcfae1907bb11bb2a53e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-12T19:06:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ProduçãoPurificaçãoCaracterização.pdf: 1800894 bytes, checksum: 81ba847b0ec8fcfae1907bb11bb2a53e (MD5) Previous issue date: 2016 / Os objetivos deste trabalho foram cultivar o fungo Chrysoporthe cubensis em diferentes fontes de carbono de baixo custo, para induzir a produção da poligalacturonase, purificar e caracterizar a enzima, para identificar propriedades funcionais interessantes para possíveis aplicações biotecnológicas. O fungo foi cultivado em meio semi sólido (67% de umidade), com farelo de trigo, casca de maracujá e casca de laranja, além disso os resíduos de frutas foram misturados ao farelo nas proporções 1:1, 3:1 e 9:1 (farelo: resíduo de fruta). O fungo apresentou maior produção da poligalacturonase em meio composto por farelo de trigo e casca de maracujá (3:1), com atividade de 41.49 U/g de substrato, sendo 1,32 vezes maior do que no cultivo em farelo de trigo puro. O extrato enzimático bruto foi purificado a partir da cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose, seguida por cromatografia em gel filtração em coluna Sephacryl S-200, exibindo atividade específica de 1117,45U/mg, com aumento de 28,34 vezes e rendimento final de 29,2 %. A massa molecular da poligalacturonase, obtida através de SDS-PAGE 12% foi de, aproximadamente, 40,74Kd. A enzima apresentou pH e temperatura ótimos de 3,5 e 50°C, repectivamente, e meia vida de 4,05 minutos a 50°C. A enzima se manteve estável na faixa de pH de 2,5 a 8,5, apresentando acima de 80% da atividade após 1h. O substrato preferencial da enzima foi o ácido poligalacturônico e o km e Vmax foi de 0,766 mg.mL-1 e 1,88U/mL, respectivamente. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a PG de C. cubensis é uma enzima importante dentro do complexo hidrolítico secretado pelo fungo quando cultivado em SSF, em meio contendo resíduos agroindustriais. __________________________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT : The aims of this study were to cultivate the fungi Chrysoporthe cubensis on differents inexpensive carbon sources, to induce polygalacturonase production, purify and characterize the enzyme to identify interesting functional properties for potential biotechnological applications. The fungi was grown in semi solid (67% moisture) with wheat bran, passion fruit peel and orange peel, in addition, the waste fruits were mixed with the meal in the ratios 1: 1, 3: 1 and 9: 1 (bran: fruit residue). The fungus showed increased production of polygalacturonase in medium composed of wheat bran and passion fruit peel (3: 1), activity of 41.49 U / g substrate, being 1.32 times higher than that in pure culture in wheat bran. The crude extract enzyme was purified from the ion exchange chromatography DEAE-Sepharose, followed by gel filtration chromatography on Sephacryl S200 column exhibiting specific activity 1117,45U / mg, an increase of 28.34 fold and final yield of 29 ,2 %. The molecular weight of the polygalacturonase obtained by SDS-12% PAGE was approximately 40,74Kd. The enzyme showed pH 3.5 and temperature to 50 ° C, respectively, and a half life of 4.05 minutes at 50 ° C. The enzyme remained stable in the pH range of 2.5 to 8.5, with over 80% of activity after one hour of incubation. The preferred enzyme substrate was polygalacturonic acid and the Km and Vmax was 0.766 mg.mL-1and 1,88 U/mL, respectively. The results of this study indicate that C. cubensis PG is an important enzyme in the hydrolytic complex secreted by the fungus when grown in SSF, in medium containing organic residues.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-26T10:40:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 302478.pdf: 1631379 bytes, checksum: a3c3cfd874fb540789246fcf12ef6437 (MD5) / A via UPR (do inglês Unfolded Protein Response) é uma resposta celular ao acúmulo de proteínas desenoveladas no lúmen do retículo endoplasmático, possuindo três braços (PERK, IRE1 e ATF6) que atuam sinergicamente em controles traducionais e transcricionais com o objetivo de restabelecer a homeostase celular. Os vírus, ao induzirem a célula a produzir proteínas virais, aumentam a carga de proteínas que devem ser dobradas no retículo endoplasmático, frequentemente causando a ativação da via UPR. O presente trabalho teve como objetivo estudar o impacto da infecção do HIV sobre a via UPR em células de indivíduos HIV positivos submetidos a diferentes esquemas terapêuticos. Lisados proteicos provenientes de linfócitos B, linfócitos T CD4+ e monócitos de indivíduos sadios e de pacientes HIV positivos virgens de tratamento, sob tratamento antirretroviral sem inibidor de protease ou com inibidor de protease foram avaliados quanto à presença de proteínas relacionadas à via UPR através de Western Blot. BiP teve expressão significantemente maior em linfócitos B de indivíduos HIV positivos. O fator eIF2., relacionado ao braço PERK, foi detectado em pacientes HIV positivos sob terapia antirretroviral; na sua forma não-fosforilada foi encontrado em monócitos enquanto na sua forma fosforilada e inativada, em linfócitos B e linfócitos T CD4+. P-IRE1 foi expresso em linfócitos B e linfócitos T CD4+ de indivíduos HIV negativos e pacientes HIV positivos, porém esta expressão mostrou-se significantemente maior em células de indivíduos sob tratamento antirretroviral. Células de indivíduos HIV positivos apresentaram ainda níveis de clivagem e ativação de ATF6 significantemente maiores quando comparados a indivíduos sadios. O perfil de ativação da via UPR mostrou-se diferente para indivíduos HIV negativos e HIV positivos e dentre os últimos, indivíduos virgens de tratamento ativaram apenas o braço ATF6 da via UPR, enquanto pacientes sob terapia antirretroviral ativaram os três braços. Os diferentes perfis fenotípicos de expressão de proteínas relacionadas à via UPR parecem estar relacionados à infecção pelo HIV e às cargas virais apresentadas pelos indivíduos HIV positivos, estando estas últimas vinculadas à presença ou não de terapia antirretroviral. / The Unfolded Protein Response (UPR) is a mechanism initiated whenever protein folding in the endoplasmic reticulum (ER) is compromised. The UPR pathway has three sensors of ER stress (PERK, IRE1, and ATF6), which promotes the cell metabolism back to homeostasis through transcriptional and translational controls. Virus leads infected cells to produce a great amount of new proteins, which increases the number of unfolded proteins in the ER lumen and activates the UPR signal pathways. The aim of this study was to analyze the HIV infection impact in the UPR activation in cells from HIV-positive individuals under different antiretroviral therapy. Protein lysates from B lymphocytes, T CD4+ lymphocytes and monocytes from healthy individuals, treatment-naive HIV-positive patients, and HIV-positive patients under antiretroviral therapy with or without protease inhibitors were evaluated about their expression of UPR related proteins. Amounts of BiP were significantly higher in B lymphocytes from HIV-positive individuals when compared to healthy individuals. The eIF2. factor, related to the ER stress PERK sensor, was detected in cells from HIV-positive individuals under antiretroviral therapy; non-phosphorylated eIF2. was found in monocytes whereas its phosphorylated form was expressed in B lymphocytes and T CD4+ lymphocytes. P-IRE1 was expressed in B lymphocytes and T CD4+ lymphocytes from HIV-negative and HIV-positive individuals, however this expression was significantly higher in cells from treated HIV-positive individuals. Cells from HIV-positive patients also showed higher levels of ATF6 cleavage and activation in relation to healthy individuals. The expression profile of UPR related proteins showed to be different in HIV-negative and HIV-positive individuals. Differences were also detected between the expression protein profiles from treatment-naive and treated HIV-positive individuals. In treatment-naive patients only the ATF6 pathway was activated while in HIV-positive patients under antiretroviral treatment all the three ER stress sensors were activated. These non-equal phenotypes of UPR activation seem to be related to the HIV infection and the viral loads presented by the HIV-positive patients, being the number of infective particles in their plasmas connected to the presence of antiretroviral therapy.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências / Made available in DSpace on 2013-06-25T21:03:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 308833.pdf: 1251787 bytes, checksum: 6c274d33ed40787afced961b4f2c06ac (MD5) / Existem indivíduos que mesmo expostos sexualmente ao HIV não são infectados, como no caso de casais sorodiscordantes. A despeito do contato com o vírus, o parceiro saudável permanece soronegativo e os mecanismos envolvidos nessa possível resistência seguem pouco esclarecidos. Fatores genéticos, imunológicos, virológicos e comportamentais podem estar envolvidos nesta proteção. Assim, o presente trabalho buscou avaliar e comparar hábitos de vida e moléculas relacionadas ao sistema imune de 9 casais sorodiscordantes e 12 indivíduos saudáveis, os quais foram divididos em três grupos: parceiros soropositivos, parceiros soronegativos e controle. Os voluntários responderam a um questionário sócio-comportamental e cederam amostras de sangue periférico e saliva. No plasma e saliva foram quantificadas as ?-defensinas HBD2 e HBD3 através de ensaios de ELISA e as ?-quimiocinas RANTES, MIP1-?, eotaxina-1 e MCP-1 através de ensaios de CBA. Entre os grupos não houve diferença significativa na média de idade, tempo de relacionamento, gênero, índice de massa corporal, prática de atividade física e ingestão de álcool. O consumo de carne vermelha foi maior e o de cereais menor entre os indivíduos soronegativos. Somente entre os casais sorodiscordantes houve transfusões sanguíneas, tabagismo e uso de drogas recreativas. Não foram observadas diferenças significativas nas concentrações de HBD2 e MIP1-? entre os grupos avaliados. Os soropositivos apresentaram menores concentrações de HBD3 na saliva e maiores concentrações de RANTES no plasma. Não se observou expressão aumentada de HBD2, HBD3, RANTES ou MIP1-? entre os expostos e não soroconvertidos embora tais moléculas tenham sido descritas como capazes de inibir a replicação viral. Em contrapartida, MCP-1 e eotaxina-1 foram observadas em maiores concentrações no plasma dos indivíduos soronegativos, indicando que estas moléculas podem estar relacionadas à proteção contra o HIV. Por conseguinte, a resistência ao HIV é potencialmente conferida por uma gama de fatores e estudos que demonstrem a contribuição de diferentes moléculas aos mecanismos de resistência são muito importantes na compreensão da dinâmica da infecção viral. / Some individuals are exposed to HIV but not become infected, as in serodiscordant couples. Despite the contact with the virus, the healthy partner remains seronegative and the mechanisms involved in this resistance are poorly understood. Genetic, immunological, virological, and behavioral factors may be involved in this protection. Thus, this study aimed to evaluate and compare lifestyles and immunological molecules of 9 serodiscordant couples and 12 healthy individuals, which were divided into three groups: seropositive partners, seronegative partners and controls. The volunteers answered a social and behavioral questionnaire and donated peripheral blood and saliva samples. â-defensins HBD2 and HBD3 were quantified in plasma and saliva by ELISA assays and â-chemokines RANTES, MIP1-â, eotaxin-1 and MCP-1 by CBA. There was no significant difference among the groups related to averages of age, time of relationship, gender, alcohol consumption, body mass index and physical activity. The consumption of red meat was higher within seronegative group, while they consumed cereals less frequently. Only serodiscordant couples had received blood transfusion and consumed drugs or cigarettes. There were no significant differences in HBD2 and MIP1-â concentrations among the groups. The seropositives partners had lower concentrations of HBD3 in saliva and higher concentrations of RANTES in plasma. Although described in the literature as able to inhibit viral replication, an increased expression of HBD2, HBD3, RANTES or MIP1-â between the exposed seronegative individuals was not observed. However, eotaxin-1 and MCP-1 were observed in higher concentrations in plasma of seronegative partners. Therefore, the resistance to HIV is likely due to a range of factors, and studies that demonstrate the contribution of different molecules to the virus resistance mechanisms are considerably important to understand the dynamic of viral infection.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-06-25T21:33:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 309618.pdf: 309275 bytes, checksum: f08ac80d14f76cfd53c16fb4fc2b4fd5 (MD5) / A Atrazina e muito utilizada no controle de erva-daninhas em cultivos agricolas, e como consequencia de seu uso, tem sido detectada no solo, aguas superficiais e subterraneas. Peixes tem sido muito utilizados como modelos em estudos de ecotoxicologia, indicando o risco biologico de exposicao a contaminantes. O objetivo desse trabalho foi identificar e validar genes diferencialmente transcritos no figado de Poecilia vivipara expostos a ATZ (100ug/L). Para tanto, foi realizada uma primeira exposicao com 100ug/L de ATZ a peixes P. vivipara oriundos de bioterio e empregado o metodo de hibridizacao subtrativa supressiva (SSH). A identificacao destes genes foi realizada por homologia com o banco de dados NCBI (Blastx), resultando em 34 sequencias que aparentemente tiveram uma repressao na transcricao e 61 dos genes que apresentaram um aumento na transcricao. Visando a analise de alguns genes provenientes da biblioteca subtrativa, uma segunda exposicao foi realizado com peixes proveninentes de ambiente natural e expostos a concentracoes crescentes de ATZ (2, 10 e 100 ug/L) por 24h. Os genes selecionados foram fibrinogenio gama e beta, inibidor de BAX, vitelogenina A, componente complemento C3 e C9 e ligante de acidos graxos. Os genes C9 e Fibrinogenio Beta aparentemente mostraram um aumento na transcricao nos tratamentos de 10 e 100 ug/L de ATZ em relacao ao grupo controle; e Vitelogenina A apresentou um aumento na transcricao nos animais do tratamento de 10ug/L de ATZ em relacao ao controle. Entretanto, os dois primeiros foram identificados na biblioteca dos genes reprimidos por ATZ. De forma similar, o gene Inibidor Bax-1 apresentou uma diminuicao em sua transcricao no figado dos animais tratados com 10ug/L de ATZ, apesar de estar presente na biblioteca dos genes induzidos. Tais discrepancias podem ser atribuidas a possiveis alteracoes populacionais, uma vez que o experimento preparatorio para a subtracao foi realizado com animais provenientes de cultivo no bioterio da FURG-RS e os experimentos de validacao foram realizados com populacoes de animais de ambiente natural em Florianopolis - SC.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:18:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 223531.pdf: 979006 bytes, checksum: 09cf3ec36da16e960e9f315e1d955827 (MD5) / O Trypanosoma rangeli é um protozoário flagelado, pertencente à Ordem Kinetoplastida, capaz de infectar triatomíneos, mamíferos silvestres e domésticos, bem como o homem nas Américas Central e do Sul. Quando comparado a organismos do mesmo gênero, é notória a falta de informações existentes acerca deste parasito, sobretudo a nível molecular. No presente estudo, apresentamos os resultados obtidos a partir da geração e seqüenciamento de 4 bibliotecas de cDNA de formas tripomastigotas da cepa Choachi de T. rangeli, utilizando a técnica ORESTES. O seqüenciamento dos clones obtidos resultou na geração de 2.475 ORESTES, das quais 1.295 (52,3%) apresentaram alta qualidade (Phred=15). O agrupamento das seqüências resultou em 758 seqüências não redundantes com tamanho médio de 341pb e conteúdo G+C de 54%. Destas seqüências, apenas 2,5% apresentaram similaridade com seqüências deste parasito, 61,21% com outros tripanosomatídeos e somente 5,28% com outros organismos. Além disso, 31% das ORESTES geradas não apresentaram similaridade com seqüências depositadas nos bancos de dados públicos consultados, as quais podem estar representando genes únicos do T. rangeli, os quais ainda não foram caracterizados, genes desconhecidos ou mesmo artefatos da técnica. Estes resultados representam as primeiras seqüências do transcriptoma desta forma evolutiva do parasito.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-16T00:01:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 221535.pdf: 1532953 bytes, checksum: cca824d5fe9dc9f6c5759d3ab3efaa08 (MD5) / A atividade antibacteriana da cumarina per se e de 45 derivados desta foram avaliados contra linhagens bacterianas de Escherishia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa. Entre os análogos estudados estão as cumarinas simples (monossubstituídas, bissubstituídas e trissubstituídas), as furano e dihidrofuranocumarinas, as piranocumarinas e as cumarinas preniladas. Para cada uma dessas cumarinas foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas (CIM) e bactericidas mínimas (CBM) pelo método de microdiluição. As CIMs e CBMs foram consideradas as menores concentrações das substâncias-teste necessárias para inibir o crescimento ou provocar a morte bacteriana e foram expressas em µg/ml. Cumarina per se apresentou atividade antibacteriana contra todas as estirpes bacterianas. Entre os análogos monossubstituídos, somente derivados com substituintes mais polares apresentaram atividade antibacteriana, principalmente, contra cepas Gram-negativas. Com relação as cumarinas bissubstituídas, a esculetina apresentou melhor atividade antibacteriana, especialmente, contra cepas Gram-positivas. A fraxetina um derivado trissubstituído não apresentou atividade antibacteriana contra todas as linhagens testadas. Da classe dos furano e dihidrofuranocumarinas, apenas o (-) heraclenol, xantotoxina e oroselona demonstraram atividade contra bactérias Gram-positivas e angelicina contra bactérias Gram-negativas. Entretanto, piranocumarinas mostraram-se completamente inativas contra o painel bacteriano. Com relação as cumarinas preniladas, apenas o ostenol se mostrou ativo com CMI de 62,5 µg/ml contra cepas Gram-positivas. Esses resultados sugerem que o efeito inibitório desses compostos esteja diretamente relacionado com determinados padrões de substituição.