Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T05:11:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340763.pdf: 2979981 bytes, checksum: 43244d3130923a9fefa87a734eaf0ead (MD5) Previous issue date: 2016 / A ocorrência de vírus entéricos no ambiente (água, solo) e em alimentos é bem documentada e tem sido associada a diversos surtos de gastroenterite de origem não bacteriana. Diversos patógenos virais foram identificados nestes surtos, incluindo norovírus (NV), vírus das hepatites A e E (HAV e HEV, respectivamente), astrovírus (AstV), poliovírus (PV), poliomavírus (PyV), adenovírus (AdV) e rotavírus (RV). Padrões de qualidade da água, tanto para consumo quanto para recreação, ainda se referem aos coliformes totais e termotolerantes e esse fato tem sido cada vez mais questionado pela comunidade científica e autoridades sanitárias no mundo todo.Este estudo teve como objetivo avaliar o nível de contaminação por vírus em amostras de água e sedimento coletadas em duas regiões da ilha de Florianópolis em Santa Catarina, sul do Brasil: Rio Sangradouro (amostras de água de superfície e sedimento) e Lagoa do Peri (água de superfície, distintas profundidades de coluna de água- 0.9, 5.5 e 8.0 metros e sedimentos). Os vírus avaliados foram: adenovírus humano (HAdV), vírus da hepatite A (HAV), rotavírus grupo A (RVA), e colifagos somáticos. Para mimetizar a influência da radiação solar na estabilidade dos vírus montou-se um microcosmo em condições naturais de claro/escuro (dia e noite) e totalmente no escuro ambos em escala laboratorial e utilizamos AdV recombinante (rAdV) e norovirus murino (MNV-1) como modelos de vírus de genoma DNA e RNA (Capítulo III da tese). Os ensaios envolveram técnicas moleculares de PCR em tempo real (HAdV, HAV, RVA) para quantificação de genomas e técnicas de infecção celular in vitro (HAdV, rHAdV e MNV-1), além de técnicas microbiológicas clássicas (colifagos) para estudos de infecciosidade viral . Capítulo I: No ano de 2013 foram coletadas e analisadas um total de 96 amostras de água e sedimento. Para as amostras de água, HAdV foi detectado em 70,8% das amostras de verão, sendo que 82,4% dessas continham vírus infecciosos; a frequência do HAdV no inverno foi de 62,5% e nenhum deles continham vírus infecciosos. Para as amostras de sedimento, a frequência de HAdV foi de 37,5% nas amostras de verão, com 66,7% desses contendo HAdV infeccioso; a frequência HAdV no inverno foi de 37,5%, e nenhuma amostra continha vírus infecciosos. RVA foram detectados em 20,8 e 45,8% das amostras de águas superficiais coletadas no verão e inverno, respectivamente, e em 8,3 e 12,5% das amostras de sedimentos coletados no verão e inverno, respectivamente. Genomas de HAV foram detectados apenas em águas de superfície, com 54,8 e 12,5% de positividade em amostras de verão e inverno, respectivamente. Capítulo II: No ano de 2014 foi avaliada adistribuição espacial de vírus em diferentes profundidades da coluna de água bem como sedimento. Um total de 84 amostras de água e 48 amostras de sedimentos foi analisado. Foi observado que, 64% e 48% das amostras de água e sedimento foram positivas para HAdV, respectivamente, sendo que 76% e 83% dos amostras respectivamente, continham vírus infecciosos. RVA estava presente em 33% e 18,75% das amostras de água e sedimento respectivamente e 25% das amostras de água foram positivas para HAV. Colifagos somáticos puderam ser detectados em 42% e 18,75% das amostras de água e sedimento, respectivamente. Os dados apontaram para uma variação de prevalência vírus de acordo com as diferentes profundidades da coluna de água. Capítulo III: As taxas de decaimento (K) e T90 para rHAdV e MNV-1 na água e sedimentos foram calculadas usando um microcosmo em escala de laboratório. Foram calculadas as unidades infecciosas de rHAdV e MNV-1 por microscopia de fluorescência e ensaio de placa de lise, respectivamente ao longo de um período de 85 dias. O curso do decaimento natural de rHAdV e MNV-1 foi similar sob luz solar natural nos microcosmos onde o T90 para rHAdV foi de 7,7 e 7 dias em água e sedimentos, respectivamente. O T90 para MNV-1 foi de 6,7 e 6,4 dias na água e sedimento, respectivamente. Nos microcosmos mantidos completamente no escuro observou-se uma estabilidade maior tanto para o rHAdV em água (T90 = 20,9 dias), quanto em sedimentos (T90 = 22 dias) sendo que para MNV-1 a estabilidade foi T90 = 12 dias e T90 = 18 dias em água e em sedimento, respectivamente. Estes resultados demonstraram a presença dos vírus entéricos potenciais causadores de doenças no principal manancial de água doce da Ilha de Santa Catarina e no Rio que corta muitos bairros dessa região e desemboca na Praia do Matadeiro, muito frequentada por banhistas e surfistas durante todo o ano e também a adsorção e estabilidade dos vírus aos sedimentos que são ressuspendidos pela ação dos ventos e chuvas, voltando às colunas de água. Esperemos que, no futuro, essas áreas sejam mais protegidas pelas autoridades e que a população se conscientize de seu papel na proteção dos recursos hídricos, fundamentais à manutenção da vida no planeta terra.<br> / Abstract : The presence of enteric viruses in the environment (water, soil) and in foods is well documented and has been associated with several gastroenteritis outbreaks of non-bacterial origin. Several viral pathogens were identified in these outbreaks, including Norovirus (NV), hepatitis A and E viruses (HAV and HEV respectively), astrovirus (AstV), poliovirus (PV), polyomavirus (PyV), adenovirus (AdV) and rotavirus (RV). Water quality standards, both for consumption and for recreation, still refer to the total and fecal coliforms and this fact has been increasingly questioned by the scientific community and health authorities worldwide.This study aimed to assess the level of viral contamination in water and sediment samples collected from two regions: Rio Sangradouro (surface water and sediment samples) and Peri Lagoon, representing the main freshwater reservoir of the island of Florianopolis in Santa Catarina, southern Brazil, (surface water, different depths of water-column: 0.9, 5.5 and 8.0 meters and sediment). Evaluated virus were: human adenovirus (HAdV), hepatitis A virus (HAV), rotavirus group A (RVA), and somatic coliphages (Chapters I and II of this thesis). To mimic the influence of solar radiation on the stability of the virus it was set up a microcosm in natural conditions of light/dark (day and night) and totally in the dark both at laboratory scale and used recombinant AdV (rAdV) and murine norovirus (MNV -1) as models for DNA and RNA genome viruses (Chapter III of this thesis). The assays involved molecular PCR techniques in real time (HAdV, HAV, RVA) for quantification of genomes and cell culture techniques in vitro (HAdV, rHAdV and MNV-1) in addition to classical microbiological techniques (coliphages) for studies of viral infectivity. Chapter I: We collected a total of 96 samples of water and sediment during the summer and winter of 2013. For water samples, HAdV was detected in 70.8% of the summer samples, 82.4% of those with infectious virus; the incidence of HAdV in winter was 62.5% and none were infectious. For sediment samples, the incidence of HAdV was 37.5% in the summer samples, with 66.7% containing infectious HAdV; the incidence HAdV in winter was 37.5% and none were infectious. Genomes of RVA were detected in 20.8 and 45.8% of surface water samples collected in summer and winter, respectively, and 8.3 and 12.5% of the samples of sediment collected in summer and winter, respectively. Genomes of HAV were detected only in surface waters, with 54.8 and 12.5% positivity in summer and winter samples, respectively. Chapter II: The spatial distribution of theevaluated viruses in different depths of the water column was evaluated. A total of 84 samples of water and 48 samples of sediment were analyzed. After analysis, 64% and 48% of water and sediment samples were positive for HAdV, respectively 76% and 83% respectively infectious. RVA was present in 33% and 18.75% of the samples of water and sediment respectively and 25% of water samples were positive for HAV. Somatic coliphages could be detected in 42% and 18.75% of water and sediment samples, respectively. The data indicated a variation in the virus prevalence according to the different depths of the water column. Chapter III: The decay rates (K) and T90 were calculated for rHAdV and MNV-1 in water and sediments using a microcosm in a laboratory scale. The infectivity was measured by infectious units of rHAdV and MNV-1 by fluorescence microscopy and plaque assay, respectively, over a period of 85 days. The course of natural decay of rHAdV and MNV-1 was similar under natural condition in microcosms where T90 to rAdV was 7.7 and 7 days in water and sediment, respectively. The T90 in NVM-1 was 6.7 and 6.4 days in the water and sediment respectively. In microcosms completely in the dark condition it was observed an increased stability for rHAdV in water (T90 = 20.9 days) and in sediment (T90 = 22 days) as well as for MNV-1 with T90 = 12 days and T90 = 18 days in water and sediment respectively. These results demonstrate the real presence of enteric viruses which cause diseases, in the main fresh water source of the island of Santa Catarina and the Sangradouro River that crosses many districts of this region and flow into Matadeiro Beach, which is used by swimmers and surfers throughout the year. Also we realize the adsorption and stability of the viruses to the sediments that are subsequently resuspended by wind and rain, returning to the water columns. Hopefully, in the future, these areas will be more protected by the authorities and the population will be aware of its role in the protection of water resources, essential to the maintenance of life on planet earth.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T05:11:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340762.pdf: 2249783 bytes, checksum: 26401702acb67e78e563d1df40ac6d86 (MD5) Previous issue date: 2016 / O mecanismo de RNA de interferência (RNAi) é um sistema pós-transcricional de silenciamento gênico com ampla distribuição nos organismos eucariotos. Os pequenos RNA (siRNA e miRNA) são considerados moléculas chaves nesse mecanismo, os quais são gerados pela proteína Dicer. A presença desse sistema parece não seguir um padrão de distribuição filogenético e a sua evolução ainda não foi compreendida. Entre os protozoários, o mecanismo de RNAi está muito bem caracterizado em Trypanosoma brucei, entretanto é ausente em Trypanosoma cruzi e em muitas espécies de Leishmania. O Trypanosoma rangeli não possui vários componentes da maquinaria de RNAi, tornando-a não funcional. Entretanto, o gene que codifica para a Dicer- Like2 (DCL2) foi encontrado completo em seu genoma, enquanto os demais genes codificantes para as outras proteínas da maquinaria estão truncados (pseudogenes). No presente estudo realizamos a caracterização do gene DCL2 de T. rangeli (TrDCL2), o qual apresentou-se como cópia única no genoma do parasito, possuindo uma janela aberta de leitura com 2.667 pb que codifica para uma proteína de 889 aminoácidos (±100 kDa). Foram reveladas diferenças nas sequências aminoacídicas da TrDCL2 entre as cepas KP1(+) e KP1(-) de T. rangeli e devido uma mudança na fase de leitura não é possível identificar os domínios RNAse III nas cepas KP1(-). O gene TrDCL2 é transcrito nas cepas KP1(+), sendo que os níveis de mRNA não apresentam alterações significativas durante o processo de diferenciação celular in vitro do parasito. Visando a avaliação da atividade enzimática e análise da presença e níveis proteicos, realizamos a expressão heteróloga de dois fragmentos e da proteína TrDCL2 inteira. Um dos fragmentos foi utilizado para a produção de um antissoro policlonal anti-TrDCL2. Este antissoro reconheceu uma proteína do tamanho esperado (±100 kDa) nos extratos proteicos totais das formas epimastigotas e tripomastigotas de T. rangeli. Os ensaios de imunofluorescência indireta, utilizando o mesmo antissoro, revelaram uma distribuição difusa da proteína pelo citoplasma de ambas as formas do parasito. A TrDCL2 é expressa em algumas cepas do T. rangeli, entretanto a determinação do seu papel biológico neste parasito ainda permanece a ser elucidada.<br> / Abstract : The interference RNA mechanism (RNAi) is a system of post-transcriptional gene silencing with wide distribution in the eukaryotes. Small RNA (siRNA e miRNA) are considered key molecules in this mechanism, which are generated by Dicer protein. The presence of this system seems not follow a pattern of phylogenetic distribution and its evolution is still not understood. Between trypanosomatids, the RNAi mechanism is well described in Trypanosoma brucei, but is absent in Trypanosoma cruzi and some Leishmania species. Trypanosoma rangeli does not have many components of RNAi machinery, making it not functional. However, the Dicer-Like2 (DCL2) coding gene was fully encountered in its genome, while the other genes of this machinery are truncated (pseudogenes). In the present study, we have realized the characterization of DLC2 gene of T. rangeli (TrDCL2), which presented a single copy in the parasite genome, having an open reading frame with 2.667 bp that encodes a protein with 889 amino acids (±100 kDa). Differences in aminoacidic sequences were revealed between strains KP1(+) and KP1(-) of T. rangeli and due to a change in the reading phase it was not possible to identify RNAse III domains in the KP1(-) strains. TrDCL2 gene is transcripted in the KP1(+), the mRNA levels do not show significant alterations during the process of cellular differentiation in vitro. Aiming the evaluation of the enzymatic activity and the analysis of the presence of the protein and its levels, we realized the heterologous expression of two fragments and the whole protein TrDCL2. One of the fragments was used to produce a polyclonal antiserum anti-TrDCL2. This antiserum recognized a protein with the expected size (±100 kDa) in the total protein extracts of the epimastigotes and trypomastigotes of T. rangeli. Imunofluorescence assays, using the same antiserum, revealed a diffuse distribution of the protein in the cytoplasm in both forms of the parasite. The TrDCL2 is expressed in some strains of T. rangeli, but the determination of its biological role in this parasite still needs to be elucidated.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-10-25T03:14:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 342403.pdf: 2156235 bytes, checksum: cd652312197cb776d37821de591ca5ac (MD5) Previous issue date: 2016 / A microbiota humana é o conjunto de microrganismos que habitam as superfícies externas e internas do nosso corpo, tais como, pele, mucosa oral e respiratória, ou o trato gastrointestinal (TGI) e geniturinário (TGU). Este conjunto de microrganismos é adquirido pelos recém-nascidos inicialmente no momento do parto. Entre os 18 e 24 meses se torna já semelhante à microbiota de um adulto. Uma das principais funções dessa microbiota é a estimulação do sistema imune, tornando-o apto a desenvolver suas funções de homeostase e defesa, através do amplo leque de células e moléculas que o compõe. Existem evidências de que variações na microbiota intestinal podem causar alterações no sistema imunológico, podendo constituir um ambiente que modula de forma negativa ou positiva a indução de uma resposta imune eficaz. O desequilíbrio dessa microbiota (disbiose) pode provocar não só dano tecidual, mas também anergia imune, tolerização ou inflamação intestinal crônica que, caso persistam, podem comprometer a resposta do hospedeiro aos antígenos, e dentre eles àqueles que formam parte das vacinas. O presente trabalho teve como objetivo geral estudar o impacto das alterações provocadas experimentalmente na microbiota intestinal sobre a resposta imune de camundongos imunizados. Os animais foram vacinados por via subcutânea com 108 ufp/animal (109 ufp/mL) de vacina atenuada de adenovírus humano (HuAd5V) recombinante. Para avaliar a ação de variações significativas da microbiota intestinal e correlacioná-la com a imunogenicidade das vacinas foram traçados dois desenhos experimentais baseados na depleção da microbiota com antibióticos. No primeiro desenho experimental (A), camundongos BALB/c foram tratados com 250 mg de axetilcefuroxima e 25 mg de enramicina diluídos em 250 ml de agua estéril administrado por via oral durante 14 dias. Para o segundo desenho experimental (B) utilizaram-se diferentes combinações de antibióticos não absorvíveis: Gentamicina (G), Metronidazol (M), Neomicina (N) e Vancomicina (V), administrada via oral (1 g/L) durante 14 dias. Durante o tratamento, os animais foram avaliados quanto ao seu desenvolvimento mediante a mensuração do seu peso corporal, e foram também realizadas coletas de fezes para realização de culturas bacterianas e quantificação da microbiota intestinal por PCR quantitativa (qPCR). Os resultados mostraram que o desenho experimental B conseguiu ter uma eficácia maior quanto à depleção da microbiota, apesar de que também foram observadas com ele as maiores taxas de diminuição do peso corporal dos animais. Os grupos de animais tratados com M apresentaram maior redução do peso corporal médio e não tiveram sua microbiota totalmente depletada. Já, uma significativa redução da microbiota foi observada no início do tratamento com NGV ainda sem observar uma redução proporcional do seu peso médio corporal. O resultado mais relevante do nosso trabalho é o que diz a respeito do fato de que a depleção/seleção da microbiota intestinal utilizando NGV e MGV teve impacto significativo na imunogenicidade das vacinas recombinantes adenovirais atenuadas, já que os níveis de anticorpos anti-adenovirais resultantes foram menores, apresentando valores de significância estadística (p) de 0.0154 e 0.0293, respectivamente, em relação ao grupo controle.<br> / Abstract : Human microbiota is formed by a group of microorganisms that inhabit our body surfaces, such as skin, respiratory or oral mucosa as well as the gastrointestinal (GIT) or genital-urinary (GUT) tracts. Between 18 and 24 months, this microbiota becomes similar to that of an adult human being. One major function of these microorganisms is to stimulate a diversity of immune functions, making our immune system able to perform their homeostasis and defense functions, mainly through the use of a wide arrange of cells and humoral factors that make part of it. Evidences suggest that variations in gut microbiota contents may cause positive or negative alterations in immune responses, thus representing an immune-modulative microenvironment. Disbiosis (lost of equilibrium) may be responsible not only for intestinal tissue damage but also for immune anergy, tolerization or chronic intestinal inflammation, which, if maintained for long periods, may compromise host´s response to antigens, including those that form the vaccines.Our current study had the aim of elucidating the impact that experimental alterations in gut microbiota of mice might have on the immune responses induced in those animals by vaccination. Mice were immunized subcutaneously with 108 pfu/animal (109 pfu/mL) of a human adenovirus type 5 (HuAdV) recombinant attenuated vaccine. To evaluate significant alterations in gut microbial contents and to correlate those with vaccine immunogenicity, two experimental designs were planned, based on different antibiotic usage schedules. In the first experimental design (A), BALB/c mice were treated with 250 mg of axetilcefuroxime and 25 mg of enramicine, diluted in 250 ml of sterile water, administered orally for 14 days. As for the second experimental design (B), different combinations of non-absorbable antibiotics were used: Gentamicin (G), Metronidazole (M), Neomycin (N) and Vancomycin (V), all of them administered orally at 1 g per liter of drinking water for 14 days. During treatment, mouse development was evaluated by measuring body weight, and fecal samples were also collected to perform bacterial cultures and to quantify total gut microbiota by quantitative PCR (qPCR). Results show that experimental design B was more efficient in terms of microbiota depletion; despite the most significant decrease in body weight was also observed in those groups of mice. Mice treated with M displayed a major reduction in body weight and did not have their gut microbiota totally depleted. In contrast, a significant reduction in gut microbiota was observed during the first ten days of antibiotic treatment with NGV, without observing any significant reduction in mean body weight. The most relevant result of our study relates to the fact that depletion/selection of gut microorganisms in animals treated with NGV or MGV had a significant impact in the immunogenicity of our recombinant attenuated viral vaccines, since the levels of anti-adenovirus antibodies detected were significantly lower in those groups of immunized mice when compared to the other groups of mice, with p values of 0.0154 and 0.0293, respectively.

Dissertação (mestrado) - Univesidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-02-07T03:09:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343939.pdf: 2144518 bytes, checksum: 0409fa15111c9e032fff249eda4f6ba4 (MD5) Previous issue date: 2016 / Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são moléculas essenciais do sistema imune de diversos organismos, participando eficientemente no combate a uma ampla variedade de microrganismos patogênicos. Em camarões, quatro principais famílias de AMPs foram descritas, dentre as quais se destacam as crustinas. Essa família encontra-se distribuída em diversas espécies de crustáceos e apresenta atividades antimicrobianas e antiproteolíticas. Classicamente, as crustinas estão divididas em 5 principais grupos, referidos como Tipos I a V. No camarão Litopenaeus vannamei, apesar de terem sido reportadas crustinas dos Tipos II, III e IV, até o presente ainda não foram descritas crustinas do Tipo I. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi identificar e caracterizar, em nível molecular e transcricional, crustinas do Tipo I em L. vannamei. Sequências de crustinas do Tipo I foram buscadas em bancos transcriptômicos não anotados de L. vannamei (GenBank), submetidas a reconstruções filogenéticas para confirmação de sua autenticidade e usadas no desenho de iniciadores para análises de expressão gênica. Doze sequências de L. vannamei foram resgatadas utilizando-se 41 sequências de crustinas do Tipo I de 22 espécies de crustáceos como referência. As análises filogenéticas indicaram a existência de, pelo menos, dois Subtipos de crustinas do Tipo I em L. vannamei: LvCrus Ia (10 sequências) e LvCrus Ib (2 sequências). Os dois subtipos compartilharam uma alta identidade aminoacídica (>80%) e uma estrutura condizente com as crustinas do Tipo I: um peptídeo sinal seguido de um peptídeo maduro contendo doze resíduos de cisteína, oito dos quais compondo o domínio conservado WAP (Whey Acidic Protein), característico desses AMPs. As análises moleculares mostraram um ponto isoelétrico teórico de 5,01-5,64 para LvCrus Ia (massa molecular de 9,6 kDa) e 7,66 para LvCrus Ib (massa molecular de 11,5 kDa). A expressão de crustinas do Tipo I mostrou um perfil similar de expressão em diferentes tecidos dos animais após um estímulo bacteriano. Interessantemente, LvCrus Ia e LvCrus Ib mostraram-se altamente expressos nas brânquias de animais estimulados e não estimulados, mas não nos hemócitos que são as células imuncompetentes de camarões. Para fins comparativos, a distribuição das demais crustinas de L. vannamei também foi investigada. As crustinas do Tipo II (IIa e IIb) mostraram uma distribuição idêntica, estando presentes em hemócitos e brânquias e as crustinas dos Tipos III e IV foram unicamente hemocitárias. Os níveis transcricionais deLvCrus Ia foi analisado no intestino médio de animais 48 horas após uma infecção experimental por dois patógenos de camarões: o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) ou a bactéria Vibrio harveyi. A expressão de LvCrus Ia apresentou um aumento superior a 50 vezes em animais inoculados com água do mar estéril e com a bactéria V. harveyi, mas não houve diferença entre esses dois tratamentos. Analogamente, não houve modulação na expressão de LvCrus Ia após o desafio viral. Nos hemócitos, apenas as crustinas do Tipo IV (LvSLPI) foram induzidas após a infecção bacteriana. As crustinas do Tipo I de camarões peneídeos compõem, portanto, um grupo diverso de AMPs tanto em termos de estrutura primária, características bioquímicas e no perfil de expressão gênica. Ademais, este trabalho representa o primeiro relato de crustinas aniônicas e de um grupo de AMPs não hemocitários em L. vannamei.<br> / Abstract : Antimicrobial peptides (AMPs) are essential molecules of the immune system of different organisms, participating effectively in the combat to a wide range of pathogenic microorganisms. In shrimp, four main AMP families were described, including the crustins. This AMP family is largely distributed among crustaceans and displays both antimicrobial and antiproteolytic activities. Crustins are classically divided in 5 groups, referred as Types I to V. In L. vannamei shrimp, despite the report of crustins from Types II, III and IV, Type I crustins were not still identified in this species. In this context, the aim of the present study was to identify and characterize at molecular and transcriptional levels Type I crustins in L. vannamei. Sequences coding for Type I crustins were searched in non-annotated transcriptomic libraries from L. vannamei (available in GenBank), submitted to phylogenetic reconstructions for the confirmation of their authenticity and then used for the design of specific primers for gene expression analyses. Twelve sequences were identified in L. vannamei libraries by using as query 41 Type I crustin sequences from 22 crustaceans. Phylogenetic analysis indicated the presence, at least, of two Subtypes of Type I crustins in L. vannamei: LvCrus Ia (10 sequences from nerve cord libraries) e LvCrus Ib (2 sequences from hemocyte libraries). The two Subtypes shared a high amino acid identity (>80%) and a primary structure consistent with other Type I crustins: a leader sequence followed by a mature peptide containing twelve cysteine residues, eight of them comprising a conserved WAP (Whey Acidic Protein) domain, typical of this AMP family. Molecular analysis showed a theoretical isoelectric point of 5.01-5.64 for LvCrus Ia (molecular weight = 9.6 kDa) and 7.66 for LvCrus Ib (molecular weight = 11.5 kDa). The gene expression of both Type I crustins showed to be similar in the different tissues of bacterial-challenged shrimp. Interestingly, LvCrus Ia and LvCrus Ib showed to be highly expressed in gills of both stimulated and non-stimulated animals, but not in hemocytes that are the shrimp immunocompetent cells. For comparative purposes, the gene expression distribution of other L. vannamei crustins was also evaluated. The gene expression distribution of Type II crustins (IIa and IIb) were identical, which were detected in hemocytes and gills, whereas the expression of crustins from Types III and IV showed to be restrict to hemocytes. The transcriptional levels of LvCrus Ia were analyzed in the midgut at 48 hours after an experimental infection with two shrimp pathogens: the White Spot Syndrome Virus(WSSV) or the Gram-negative Vibrio harveyi. The expression of LvCrus Ia increased more than 50-fold in seawater-injected shrimp and animals infected with V. harveyi, but no differences were observed between treatments. Besides, no differences in gene expression modulation were observed for LvCrus Ia in response to the viral infection. In hemocytes, only the expression of Type IV crustins (LvSLPI) was induced in response to the bacterial infection. Type I crustins from penaeid shrimp comprise a diverse group of AMPs in terms of primary structure, biochemical features and gene expression profile. Additionally, the present study represents the first report of anionic crustins and the first identification of non-hemocytic AMPs in L. vannamei.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-03-28T04:11:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 344593.pdf: 4945044 bytes, checksum: be573a4fe45eca3dde59625b082bf902 (MD5) Previous issue date: 2016 / Trypanosoma rangeli é um parasito hemoflagelado pertencente à Ordem Kinetoplastea, grupo ancestral de protistas que contém grande diversidade de espécies, entre elas organismos de vida livre e parasitos com distintos mecanismos de resposta ao estresse oxidativo. Um dos objetivos deste trabalho foi caracterizar in silico enzimas envolvidas direta ou indiretamente na defesa antioxidante de T. rangeli, além de compará-las a suas ortólogas junto a diferentes espécies de Kinetoplastídeos. Dos genes analisados, não foram identificados em T. rangeli: cisteína sintase, ornitina decarboxilase, glutamilespermidina sintase e ascorbato peroxidase, embora o primeiro e o último tenham sido identificados como pseudogenes. Todos os genes foram identificados em Bodo saltans, sugerindo que os mecanismos antioxidantes evoluíram antes do aparecimento do parasitismo nesse grupo. De forma geral, observou-se que a variabilidade de enzimas no sistema antioxidante a nível genômico entre tripanosomatídeos relaciona-se a adaptações específicas ao parasitismo em ampla gama de hospedeiros e sua transmissão pelos vetores e não somente ao isolamento geográfico. Entre as enzimas analisadas, duas destacam-se em relação a infectividade e virulência em tripanosomatídeos patogênicos, a tripanotiona redutase (TRed) e triparedoxina peroxidase em suas isoformas citosólica (TRPxcit) e mitocondrial (TRPxmit). O gene da TrTRed possui uma ORF de 1.473 pb (~490 aa/ 53 kDa) estando presente em cópia única no genoma haploide de T. rangeli. A análise da proteína predita da TrTRed revelou a presença de dois domínios relacionados à ação oxidoredutase. O gene da TrTRPxcit apresentou-se com 549 pb gerando uma proteína com 182 aminoácidos (~ 20 kDa), enquanto para TrTRPxmit a ORF possui 681pb que prediz uma sequência de 266 aminoácidos (~25 kDa). A análise das sequências aminoacídicas deduzidas da TrTRPxcit e TrTRPxmit revelou a presença dos domínios VCP e ICP, respectivamente, além das cisteínas peroxidásica (Cp) e de resolução (Cr). A análise da expressão gênica e proteíca de TrTREd, TrTRPxcit e TrTRPxmit revelou ausência de expressão significativa estágio-específica, porém a espressão da TRed é significativamente maior em T. cruzi do que em T. rangeli. O estresse oxidativo gerado pela adição de H2O2 não induziu alterações significativas na expressão de nenhuma proteína analisada. A presença de antioxidantes como N-acetilcisteína (NAC) e glutationa reduzida (GSH) no meio induziu a proliferação de epimastigotas in vitro, mas não alterou o perfil de expressão da TrTRed ao longo do tempo. A síntese de NADPH foi reduzida e a produção endógena de H2O2 é maior em T. rangeli quando comparada a T. cruzi. Estudos enzimáticos em extratos de T. rangeli mostraram maior atividade da TRed em epimastigotas do que em tripomastigotas. A superexpressão da proteína TrTRed não influenciou o crescimento ou o processo de diferenciação em tripomastigotas in vitro e os parasitos transfectados (TRed+) mostraram aumento na resistência ao estresse induzido pelo H2O2. Conclui-se que o T. rangeli apresenta uma maquinaria de defesa antioxidante semelhante ao T. brucei e ao T. cruzi em função de presença/ausência de genes e quanto à similaridade nas sequências, respectivamente. Além disso, a TrTRed parece não ser a principal envolvida na resposta do T. rangeli ao ambiente oxidante em células do hospedeiro vertebrado, mas possui papel crucial durante a infecção do hospedeiro invertebrado.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli belongs to the Order Kinetoplastea, an ancestral group of protists containing a variety of free-living and parasitic species with distinct mechanisms of antioxidant defence. In this study we have characterized in silico the enzymes directly or indirectly involved on the T. rangeli response t oxidative stress and to comparatively characterize to its orthologs on other kinetoplastids. Ornithine decarboxylase, glutamyl spermidin synthase were not found on the T. rangeli genome while cysteine synthase and ascorbate peroxidase were found as pseudogenes. Since all genes related to antioxidant defence were found on Bodo saltans we hypothesize that such mechanism has evolved prior the parasitic lifestyle. As a rule, we have observed that genomic variability among the antioxidant system genes from trypanosomatids are related to specific adaptations to a parasitic lifestyle between distinct hosts and vectors instead of geographical isolation. Among the studied enzymes, the trypanotion reductase (TRed) and the cytosolic (TRPxcit) and mitochondrial (TRPxmit) forms of tryparedoxin peroxidase are related to virulence and infectivity. The T. rangeli TRed (TrTRed) is a singe-copy gene and has an ORF of 1.473 bp (~490 aa/ 53 kDa) and the predicted TrTRed proteins revealed two oxidoreductase-related domains. The TrTRPxcit gene is 549 bp long coding to a 182 aa protein (~ 20 kDa) while the TrTRPxmit is 681 bp long, predicting to 266 aa protein (~25 kDa). Both TrTRPxcit and TrTRPxmit proteins revealed the presence of the VCP and ICP domains, respectively, along the peroxidatic cysteine (Cp) and resolving cysteine (Cr). The transcription and expression profiles of TrTREd, TrTRPxcit and TrTRPxmit revealed the no stage-specific differences, but was significatly higher in T. cruzi than T. rangeli. No differences on expression were observed for any of the analyzed genes when parasites were exposed to an H2O2-induced stress. Addition of antioxidants such as NAC and GSH on the culture media induced proliferation of epimastigotes in vitro, not altering the TrTRed expression overtime. NADPH generation is lower and production of endogenous H2O2 is higher in T. rangeli Choachí strain than in T. cruzi Y strain epimastigotes. Enzymatic assays revealed an increased activity of TRed on T. rangeli epimastigotes than trypomastigotes. Overexpression of TrTRed has no influence on the growth or on the in vitro differentiation to trypomastigotes, but transfectants revealed an increased resistance to a H2O2-induced stress. Based on the presence/absence of genes and on the sequence similarity, the T. rangeli antioxidant machinery is related to T. brucei and to T. cruzi, respectively. Also, TrTRed seems not to be the main enzyme involved on the T. rangeli response to the oxidative stress on the mamalian host, but having crucial relevance on the infection of the insect vectors.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T01:27:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 191150.pdf: 993555 bytes, checksum: 2e779515979af2597a4cedc731d3419d (MD5) / Partindo do pressuposto de que o estudo referente aos recursos hídricos é de relevância para várias áreas do conhecimento, a presente pesquisa buscou enfocar o assunto num aspecto econômico-ecológico, apresentado em quatro momentos distintos. Inicialmente, fez-se uma análise crítica sobre a problemática, inserindo-a dentro de um contexto maior, como reflexo de uma crise civilizatória pela qual passamos na atualidade. Partiu-se, então, a uma descrição do que seria entendido como Economia Ambiental, apresentando suas principais vertentes e propostas. O objetivo foi o de evidenciar a relação que se estabelece entre a economia e o meio ambiente e avaliar sua contribuição para a solução de questões ambientais. No intuito de atender tal objetivo, realizou-se um estudo de caso, diagnosticando o estado de degradação/poluição hídrica como resultado da atividade de criação de suínos praticada na sub-bacia do rio Bonito/Coruja, localizada no município de Braço do Norte (SC) para, afinal, proceder a avaliação de metodologias e noções propostas pela economia ambiental.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T07:58:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 191223.pdf: 676051 bytes, checksum: 0fe23951fadc40d3e8eab6423404c0ca (MD5) / Os flavonóides polimetoxilados (FPM) são metabólitos secundários que ocorrem nas plantas do gênero Citrus e vem sendo introduzidos na dieta humana pelo avanço tecnologico na fabricação de sucos concentrados. Essas substâncias são encontradas principalmente nas cascas dos frutos que incluem princípios de resistência natural contra patógenos. Essa propriedade é, provavelmente, derivada da possibilidade de formarem complexos com proteínas solúveis e com a parede celular de microrganismos. A metilação das hidroxilas confere à molécula caráter lipofilico, o qual é também um dos parâmetros moleculares mais estudados na elaboração de novos medicamentos e pesticidas. No presente estudo, essas moléculas promissoras foram obtidas de cascas de frutos de 4 espécies de Citrus: C. limon, C. reticulata, C. aurantifolia e C. sinensis. Com o uso de hexano foram preparados extratos da cera epicuticular e extratos brutos hexânico. A partir desses extratos, foram obtidos uma cumarina e quatro flavonóides por precipitação com metanol. O processo foi monitorado por meio de cromatografia em camada delgada (CCD) e as substâncias identificadas por métodos espectroscópicos, como sendo: 6,7-dimetoxi-cumarina, 6,7,8,4'-pentametoxi-flavona, 5,6,7,8,3',4'-hexametoxi-flavona, 8-hidroxi-3,5,6,7,4'-pentametoxi-flavona e 8-hidroxi-3,5,6,7,3',4'-hexametoxi-flavona. A atividade antimicrobiana dos extratos e compostos foi estudada por dois métodos: bioautografia direta e determinação da concentração inibitória mínima (CIM). A bioautografia revelou que todos os extratos e substâncias obtidas apresentaram atividade inibitória para os fungos e as bactérias testadas. Pela CIM, constatou-se que a 6,7-dimetoxi-cumarina foi a substância mais eficiente para os fungos dermatófitos e que as flavonas 6,7,8,4'-pentametoxi-flavona e 5,6,7,8,3',4'-hexametoxi-flavona foram as mais ativas para as bactérias.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T12:39:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O Trypanosoma rangeli é um parasita hemoflagelado que infecta uma grande variedade de espécies de mamíferos, incluindo o homem, nas Américas Central e do Sul. Devido a possibilidade da ocorrência de reações sorológicas cruzada com o T. cruzi, diversos estudos tem se voltado para a obtenção de formas tripomastigotas de T. rangeli. Recentemente nosso grupo padronizou a diferenciação do T. rangeli in vitro incubando parasitas em meio DMEM obtendo-se cerca de 80% de formas tripomastigotas. Testando individualmente cada um dos aminoácidos presentes no meio DMEM, parasitas incubados em L-glutamina apresentaram taxas de diferenciação superiores a 80%, enquanto que a incubação com outros aminoácidos induziram baixas diferenciações e/ou altas mortalidades. A adição de DFMO, um inibidor específico e irreversível da ornitina descarboxilase (ODC), reduziu drasticamente as taxas de diferenciação, que foram recuperadas apenas após a adição de putrescina, sugerindo que a ODC é uma enzima chave na regulação da diferenciação do T. rangeli in vitro. Porém, a incubação de parasitas com as poliaminas putrescina, espermidina e espermina, sem L-glutamina, ocasionou altas mortalidades, sugerindo a importancia da L-glutamina para a manutenção do T. rangeli. Também padronizamos duas metodologias distintas para produção e purificação de tripomastigotas de cultura e sangüíneos pelas metodologias de cromatografia de troca iônica, utilizando CM-celulose, e centrifugação diferencial de gradiente, utilizando Histopaque - 1077® respectivamente. A recuperação de tripomastigotas de cultura ficou em torno de 20% e dos tripomastigotas sangüíneos ficou em torno de 40%. Nossos resultados abrem novas perpectivas para estudos da biologia deste parasita, principalmente em relação a regulação gênica e expressão de proteínas de interesse para o diagnóstico diferencial entre T. rangeli e T. cruzi.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T12:47:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Os mosquitos são insetos dípteros pertencentes a família Culicidae. As fêmeas possuem o hábito hematofágico, sendo responsáveis pela transmissão de várias doenças como: viroses, filarioses e protozoonoses. O aparecimento de resistência aos inseticidas químicos e os danos ambientais causados por eles nos apontam para a necessidade de novas alternativas para o controle de insetos. Neste trabalho, a atividade larvicida e repelente de dezesete extratos vegetais e fúngicos foram testados contra Culex quinquefasciatus. Dos dezesete extratos hidroalcoólicos e hexânicos testados cinco apresentaram atividade larvicida: Polygala sabulosa, Pachyrkizys bolbosa, Schinnus terebinthifolius, Croton celtidifolius e Nerium oleander, sendo que os extratos de P. bolbosa manteve a atividade após dois meses de armazenamento em temperatura ambiente ao abrigo da luz. De posse destes resultados, foi realizada a extração clorofórmica, butanólica, etanólica com acetato de etila e hexânica. Observamos que extratos de C. limon e C. aurantifolia apresentaram atividade larvicida sendo mantida após dois meses a de C. limon. Observamos que os extratos clorofórmico, acetato de etila e hexânico de P. bolbosa e extrato clorofórmico de P. sabulosa mantiveram a atividade larvicida.e que nenhum dos extratos testados apresentou atividade de repelência. Conclui-se que os extratos de P. bolbosa, P. sabulosa e C. limon possuem compostos inseticidas contra larvas de Cx. quinquefasciatus e que essa atividade se encontra nas frações extraídas com os solventes, clorofórmio, acetato de etila e hexano.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T05:27:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 200174.pdf: 780725 bytes, checksum: 5105c9e6dff3c5b93f852902d1aee0fc (MD5) / O Trypanosoma rangeli, bem como o T. cruzi, são protozoários parasitas da Ordem Kinetoplastida sendo amplamente distribuídos nas Américas Central e do Sul, onde compartilham reservatórios, vetores em regiões geográficas distintas. Infecções produzidas pelo T. cruzi resultam na doença popularmente conhecida como mal de Chagas enquanto que as infecções causadas pelo T. rangeli parecem não ser patogênicas para seres humanos. Apesar disso, cerca de 60% da constituição antigênica solúvel destes parasitas é compartilhada o que pode determinar reações sorológicas cruzadas, dificultando o diagnóstico específico e mascarando a epidemiologia da doença de Chagas humana. As metodologias rotineiramente utilizadas no diagnóstico da doença de Chagas não são capazes de distinguir entre as duas espécies fazendo-se necessária a abertura de novas estratégias que nos permitam distinguí-las de maneira fácil, rápida e economicamente viável. No presente trabalho apresentamos os resultados obtidos à partir da construção e seqüenciamento de três bibliotecas de cDNA de formas epimastigotas da cepa Choachi de T. rangeli que resultaram na obtenção de 656 ESTs, dentre as quais apenas 20 ESTs foram homólogas à seqüências de T. rangeli e 245 não apresentaram homologia com seqüências dos bancos de dados pesquisados. Estes resultados demonstram a importância do uso deste tipo de estratégia para obtenção de novas informações à respeito do T. rangeli, servindo como base para a identificação de alvos diagnósticos ou para estudos da e suas interações com seus hospedeiros.