O gene PROPEP1 codifica o peptídeo sinal AtPep1 em Arabidopsis thaliana e está relacionado à amplificação de sinais de defesa. Este peptídeo aumentou a resistência de A. thaliana contra o patógeno necrotrófico Pythium irregulare, tendo sido caracterizados ortólogos deste peptídeo em milho, soja e tomate. Devido a sua importância na resistência de plantas a patógenos necrotróficos, o objetivo deste estudo foi caracterizar o gene PROPEP em Nicotiana benthamiana e sua importância na resistência a Botrytis cinerea. A partir das buscas in silico, foi encontrado um EST e a partir deste, dois genes, identificados como NbPROPEP1 e NbPROPEP2. Estes genes possuem os 23 aminoácidos da região C-terminal de suas proteínas preditas idênticas entre si. Comparados a outras espécies, assemelhando-se em 39% com a sequência de A. thaliana, 60% com Solanum tuberosum e 65% com Solanum lycopersicum, indicando ser um possível peptídeo sinalizador. Estes genes foram avaliados quanto a sua expressão em diferentes órgãos e durante o desenvolvimento, apresentando mais alta expressão de NbPROPEP1 na raiz e caule e NbPROPEP2 no caule. Além disso, as plantas com 6 e 8 semanas foram aquelas com maior expressão de ambos os genes e redução em tempos mais avançados. Para investigar o possível envolvimento deste peptídeo na resistência a B. cinerea, foi empregado o método VIGS, a fim de silenciar a região correspondente ao peptídeo, bem como a síntese e infiltração do peptídeo em folha. O silenciamento resultou no aumento da lesão em folha, além da morte celular sistêmica. O peptídeo infiltrado resultou em níveis de expressão dos genes NbPROPEP1 e NbPROPEP2 e média de lesão, semelhantes as encontradas nas plantas silenciadas. Plantas com os dois tratamentos juntos apresentaram o dobro de lesão. Os resultados obtidos indicam que os mecanismos induzidos em plantas silenciadas e infiltradas com o peptídeo sintético foram semelhantes, permitindo o avanço do patógeno e induzindo a expressão de genes envolvidos na defesa. Conclui-se que NbPep pode estar envolvido na resistência de N. benthamiana a B. cinerea, permitindo maior severidade da doença quando reduzido ou em excesso na planta. / PROPEP1 gene encodes the peptide signal AtPep1 in Arabidopsis thaliana and is related to the amplification defense signal. This peptide increase the resistance of A. thaliana against necrotrophic pathogen Pythium irregular. Orthologs of this peptide have been characterized in maize, soybean and tomato. Due to this importance in plant resistance to necrotrophic pathogens, the aim of this study was to characterize PROPEP in Nicotiana benthamiana and its importance in resistance to Botrytis cinerea. In silico search was found one EST and from this, two genes, identified as NbPROPEP1 and NbPROPEP2. These genes have the 23 amino acid C-terminal region of their predicted proteins identical to each other. Compared to other species, resembling in 39 % with the sequence of A. thaliana, Solanum tuberosum with 60 % and 65 % with Solanum lycopersicum and could be a possible peptide signal. These genes were measured their expression in different organs and during development, with the highest expression of NbPROPEP1 in the root and stem and NbPROPEP2 in stem. In addition, the 6th and 8th week were those with higher expression of both genes and reduction in more advanced times. To investigate the possible involvement of this peptide in resistance to B. cinerea, VIGS was used in order to silencing the region corresponding to the peptide, the peptide synthesis and infiltration of the sheet. The silencing resulted in increase of leaf lesion and systemic cell death. The infiltrate peptide resulted in expression levels of NbPROPEP2 and NbPROPEP1 genes and average lesion, similar to that found in the silenced plants. Plants with two treatments together demonstrated double of lesion. The results indicate that the mechanisms induced in silencing and infiltrating with synthetic peptide were similar, allowing the advance of the pathogen and inducing the expression of defense genes. We conclude that NbPep may be involved in resistance of N. benthamiana to B. cinerea, allowing greater disease severity when reduce or excess in the plant.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T21:06:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 328819.pdf: 12188330 bytes, checksum: b7888c82687b4d7d5efc78595d6eb63b (MD5) Previous issue date: 2014 / Passiflora tenuifila Killip e Passiflora setacea DC. são espécies endêmicas do Brasil que ocorrem no Cerrado, Mata Atlântica e Caatinga (P. setacea DC.) e que foram selecionadas pelo programa de melhoramento genético realizado pela Embrapa Cerrados, visando o desenvolvimento tecnológico para uso funcional das Passifloras silvestres. Este trabalho teve como objetivo gerar conhecimentos sobre a produção de vitamina C (frutos), compostos fenólicos, flavonóides, carotenóides, clorofilas a e b e atividade antioxidante de frutos e sementes, em diferentes estádios de desenvolvimento, e de culturas celulares produzidas in vitro, a partir de diferentes tipos de explantes. Os calos de P. setacea foram produzidos a partir de explantes de segmentos de raiz, hipocótilo, nó cotiledonar, cotilédone e nó foliar de plântulas de 8 semanas de idade, cultivados em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, 0,2% de Phytagel e 2,5 µM de 2,4-D. Os calos de P. tenuifila foram produzidos a partir do cultivo de sementes em desenvolvimento e de segmentos de caules de microplantas, em meio de cultura Murashige & Skoog suplementado com 88,5 mM de sacarose ou frutose, 0,2% de Phytagel e 2,5 µM de 2,4-D ou de ANA. As análises indicaram que os níveis de fenólicos totais, flavonóides, carotenóides, clorofilas a e b, atividade antioxidante, os perfis metabólicos dos calos, determinados através de varredura em UV-vis e os tipos de carotenóides, através da análise por CLAE, variaram com a espécie e dependeram dos estádios de desenvolvimento dos frutos e sementes, assim como dos tipos de explantes e idade das culturas de calos. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram detectar, para cada espécie estudada e para cada grupo de compostos, os estádios adequados de desenvolvimento das sementes e frutos, para a utilização no enriquecimento funcional de alimentos ou aplicação em estudos farmacológicos. Foram, também, definidas as condições de cultura de calos ideais, em que ocorreu a maior biossíntese de cada grupo de metabólitos e atividade antioxidante, confirmando o potencial de utilização das culturas celulares de ambas as espécies em futuras estratégias biotecnológicas para a produção de metabólitos secundários.<br> / Abstract : Passiflora tenuifila Killip e Passiflora setacea DC are endemic of the Brazilian biomas Cerrado, Atlantic Forest and Caatinga (P. setacea DC.) which were selected by the Embrapa Cerrados genetic improvement program aiming the tecnological development for the functional utilization of the native Passifloras. The aim of this work was to generate knowledge on the production of vitamin C (fruits), phenolics, flavonoids, carotenoids, chlorophyll a and b and antioxidant activity of fruits and seeds at different developmental stages and calluses cultures produced in vitro, from different explant types. Calluses of P. setacea were produced from root, hypocotyl, cotyledonary and leaf nodal segments and cotyledon from 8-week-old seedlings cultured on Murashige & Skoog basal medium supplemented with 88,5 mM sucrose, 0,2% Phytagel and 2.5 µM de 2,4-D. The P. tenuifila calluses were produced from developing seeds and microplant stem segments cultured on Murashige & Skoog basal medium supplemented with either 88,5 mM sucrose or fructose, 2% Phytagel and 2.5 µM of either 2,4-D or NAA. The analysis carried out have shown the levels of vitamin C, phenolics, flavonoids, carotenoids, chlorophyll a and b, the antioxidant activity, the metabolic profiles, determined by the UV-vis scanning and the types of carotenoids, analysed by the HPLC varied according to species, with the developmental stages of fruits and seeds, type of explants and callus culture age. These results allowed the establishment, for each species and group of metabolite, the adequate fruit and seed developmental stages for functional food enrichment and application in pharmacological studies. The ideal callus culture conditions were also established to optimize the biosynthesis of each group of metabolite and antioxidant activity, confirming the potential use of cell cultures as tools for further application of biotechnological approaches for secondary metabolite production.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T21:13:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 328413.pdf: 6003694 bytes, checksum: cbbd067975d73d6c668de99d7111401e (MD5) Previous issue date: 2014 / A família das trans-sialidases (TS) é a maior família gênica de Trypanosoma cruzi. O grupo II da superfamília TS reúne diversas glicoproteínas (entre elas, a gp82 e a gp85) presentes na superfície das formas tripomastigotas do T. cruzi. A gp82 está envolvida no processo de adesão do parasito à célula hospedeira e a gp85 na adesão e penetração. Embora sialidases estejam presentes no T. rangeli, a função destas proteínas no ciclo de vida deste parasito ainda não foi esclarecida. Em função disso, o objetivo deste estudo foi estudar os genes de T. rangeli relacionados à superfamília das TS e avaliar a expressão heteróloga da gp82 de T. cruzi por T. rangeli (T. rangeli-gp82). Inicialmente, foram identificadas no genoma do T. rangeli oito ORFs completas similares a gp82 e gp85 de T. cruzi. Por se tratar de várias cópias gênicas, diferentes sequências foram analisadas a partir de amplificação e clonagem destes genes em duas cepas de T. rangeli. As sequências avaliadas continham de um a dois motivos Asp, um motivo subterminal, sítio de ancoramento a GPI e um domínio que pertence a superfamília das glucanases/lectina tipo Concanavalina A. Após a obtenção da cepa recombinante T. rangeli-gp82, observou-se que a gp82 foi expressa na superfície dos parasitos de forma semelhante ao T. cruzi. Além disso, a expressão da gp82 não interferiu nos padrões de crescimento e de diferenciação in vitro do T. rangeli. Em ensaios de interação destes parasitos com células Vero, verificamos um maior número de parasitos da cepa T. rangeli-gp82 nas células hospedeiras em relação à cepa selvagem, além de um maior número de parasitos aderidos às células em relação as demais cepas analisadas. Tanto as formas epimastigotas quanto tripomastigotas de T. rangeli-gp82 foram capazes de mobilizar cálcio intracelular. Estes resultados diferem do observado na interação com células THP-1, onde não verificamos diferença significativa entre T. rangeli-gp82 e as demais cepas analisadas. Em triatomíneos, verificamos que a cepa T. rangeli-gp82 apresenta desenvolvimento semelhante à cepa selvagem, sendo capaz de colonizar a hemolinfa e invadir as glândulas salivares de R. prolixus. Em camundongos, tripomastigotas de todas as cepas de T. rangeli foram observados na corrente sanguínea de animais C57BL/6 infectados via intraperitoneal, porém não foi observada proliferação, sendo a cinética parasitêmica similar para todas as cepas do T. rangeli. Quando estes camundongos foram desafiados com T. cruzi, não observamos alteração na parasitemia deste parasito em relação à infecção controle, entretanto houve uma diminuição do parasitismo tecidual por este parasito nos animais pré-infectados com as três cepas de T. rangeli, principalmente T. rangeli-selvagem e GFP. Com estes resultados, podemos inferir que a proteína gp82 facilita a adesão e penetração do parasito a célula hospedeira, entretanto a expressão desta proteína pelo T. rangeli não promove uma proteção substancial contra a infecção por T. cruzi.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-04-29T21:01:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 328079.pdf: 2882148 bytes, checksum: 0d8f6b84f74603e020abbf3892564514 (MD5) Previous issue date: 2014 / Pacientes imunodeprimidos podem apresentar infecções virais com evolução rápida, sintomatologias atípicas graves e muitas vezes fatais, sendo fundamental um diagnóstico precoce para estabelecimento do tratamento efetivo, redução da toxicidade e da resistência aos antivirais. HSV-1, HSV-2 e poliomavírus BK são vírus de importância clínica para imunodeprimidos e podem levar a rejeição de órgãos em transplantados. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema celular repórter, utilizando a proteína fluorescente GFP, para HSV-1 e 2 e implantar uma qPCR utilizando amostras clínicas de pacientes transplantados renais para detecção de poliomavírus BK. O sistema celular repórter foi construído através da transfecção de células Vero com o vetor pZsGreen1-1 ligado ao promotor ICP10 (F3R3 e F4R3) da RR1 do HSV-2. A regulação da expressão da GFP via ICP10 é dependente da infecção viral e acontece por meio da proteína viral transativadora VP16 e de fatores celulares Oct-1 e HCF-1. A efetividade do sistema foi avaliada por infecção viral e pela aplicação de antivirais (Aciclovir, ácido gálico, convalotoxina e extrato de Uncaria sp.) e candidatos antivirais inativos (Extrato de Passiflora edulis e derivados de cardenolídeos). O sistema repórter F4R3 ZsGreen1-1 expressou GFP em função da infecção por HSV-1 e 2, a qual foi detectada por microscopia de fluorescência e/ou citometria de fluxo. Em análise por citometria de fluxo, a fluorescência do sistema repórter correlacionou-se diretamente com os títulos virais (MOI de 4,0 x10-3 a 3,3 x10-4, ou seja, 1 partícula viral a cada 250 a 3000 células), o sistema manteve a capacidade de expressão da GFP na presença de agentes sem propriedade antiviral e não expressou fluorescência quando tratado com antivirais. O sistema F4R3 ZsGreen1-1 mostrou-se um sistema funcional com possíveis aplicações para diagnóstico clínico, para elaboração de testes de resistência aos antivirais e para a pesquisa de novos medicamentos. A qPCR para poliomavírus BK foi implantada utilizando amostras de DNA cedidas pelo HEMOSC com iniciadores dirigidos para o antígeno T viral. O limite de detecção foi de 18 cópias genômicas/ reação com quantificações variando entre 9,8 x 105 a 6,7 x 107 cópias genômicas/ mL. A qPCR foi efetiva para análises de amostras clínicas e apresentou limite de detecção suficiente para avaliação de risco de nefropatia em transplantados renais.<br> / Abstract : Immunosuppressed patients can present viral infections with fast evolution, severe atypical symptomatologies and often fatal, being essential the early diagnosis for the establishment of effective treatments, reduction of toxicity and development of resistance to antiviral. HSV-1, HSV-2 and polyomavirus BK are virus of clinical importance for immunosuppresed and can lead to the rejection of transplanted organs. Therefore, the aim of this work was to develop a reporter cellular system, using the fluorescent protein GFP, for HSV-1 and 2, and deploy a qPCR using clinical samples from patients submitted to renal transplant, for the detection of polyomavirus BK. The reporter cellular system was constructed through the transfection of Vero cells with the vector pZsGreen1-1 connected to the promoter ICP10 (F3R3 and F4R3) of the RR1 of the HSV-2. The regulation of the expression of GFP via ICP10 is dependent of the viral infection and happens through the viral transactivating protein VP16, and the cellular factors Oct-1 and HCF-1. The effectivity of the system was evaluated by viral infection and through the application of antiviral (Acyclovir, gallic acid, convalotoxina and extract of Uncaria sp.) and inactive antiviral candidate (Extract of Passiflora edulis and derivatives cardenolide). The reporter system F4R3 ZsGreen1-1 expressed GFP as a function of the infection for HSV-1 and 2, which was detected by fluorescence microscopy and/or flow cytometry. In flow cytometry, the fluorescence of the reporter system was directly correlated with virus titers (MOI 4,0 x10-3 to 3,3 x10-4, that is, 1 viral particle to each 250 to 3000 cells), the system maintained the ability to GFP expression in the presence of agents without antiviral property and no expressed fluorescence when treated with antivirals. The system F4R3 ZsGreen1-1 revealed a functional system with possible applications for clinical diagnosis, elaboration of tests of resistance to the antiviral and for new drugs research. The qPCR to polyomavirus BK was deployed using DNA samples provided by HEMOSC with primers directed to the viral antigen T. The limit of detection was 18 genome copies /reaction with quantification ranging between 9.8 x 105 to 6.7 x 107 genome copies /mL. The qPCR was effective for the analyses of clinical samples and presented enough sensitivity for risk evaluation of nephropathy in renal transplant.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-10-06T04:07:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334491.pdf: 1177301 bytes, checksum: f285ec39f3dba85381950eef18de7700 (MD5) Previous issue date: 2015 / A fermentação maloláctica (FML) é o processo bioquímico de descarboxilação do ácido málico em ácido láctico, realizado por bactérias ácido-lácticas. Essa importante etapa no processo de vinificação traz como principais consequências a diminuição da acidez total do vinho, estabilização microbiológica e aporte de compostos relacionados ao aroma e sabor do produto. Nos vinhos finos de altitude da Serra Catarinense, que têm níveis elevados de acidez e pH reduzido, é essencial que a FML ocorra. No entanto, essas condições também tornam o ambiente restritivo para o crescimento bacteriano e dificilmente se consegue resultados satisfatórios com a fermentação espontânea, conduzida pelas próprias bactérias já presentes na vinificação. Com o objetivo de avaliar a FML em vinhos inoculados com bactérias isoladas da região de São Joaquim, foram obtidos 30 isolados a partir de amostras de borra de uma FML rápida, completa e espontânea que ocorreu em uma vinícola da região. Após etapas de caracterização morfológica, bioquímica e molecular, as bactérias R31, R34 e C2 foram escolhidas para ensaio de microvinificação. A produção dos inóculos foi realizada no meio de cultura ML, definido em um teste comparativo com outros cinco meios descritos na literatura. As culturas iniciadoras foram adicionadas em vinhos Cabernet Sauvignon e Merlot. Nos vinhos Cabernet Sauvignon, após 45 dias a FML já havia sido finalizada em todos os vinhos inoculados com bactérias, enquanto no tratamento sem inoculação e em todos os tratamentos no Merlot, a FML não ocorreu dentro de 170 dias. A inoculação de bactérias ácido-lácticas foi um sucesso nos vinhos Cabernet Sauvignon e a explicação mais provável para a maior dificuldade nos vinhos Merlot é a interação entre algumas variáveis físico-químicas presentes na matriz extremamente complexa do vinho, que causaram perda da viabilidade celular e/ou da atividade maloláctica. Apesar de ter apresentado um crescimento mais lento, maior tempo para concluir a FML e ter gerado resultado positivo para produção de uma amina biogênica, a bactéria C2 atingiu os melhores resultados na análise sensorial dos vinhos. As bactérias R31 e R34 também produziram resultados sensoriais satisfatórios, de modo que os três isolados são indicados para uso em vinificações, além de novas investigações a respeito da FML.<br> / Abstract : The malolactic fermentation (MLF) is the biochemical decarboxylation of malic acid to lactic acid, carried out by lactic acid bacteria. This important step in winemaking has as main consequences the decrease of the total acidity of the wine, microbiological stabilization and formation of compounds related to the wine aroma and taste. In the high-altitude wines from Serra Catarinense, which have high levels of acidity and low pH, the process is essential. However, these conditions also make a harsh environment for bacterial growth, and it is difficult to achieve satisfactory results with spontaneous fermentation conducted by the bacteria already present in the winemaking process. With the aim of evaluating the success of the MLF in wines inoculated with bacteria isolated from the region of São Joaquim, 30 isolates were obtained from a wine which has undergone spontaneous quick and complete MLF in a winery in this region. After morphological, biochemical and molecular characterization, the bacteria R31, R34 and C2 were chosen to the microvinification assay. The production of the inoculum was performed in culture medium ML, defined in a comparative test with five other media described in the literature. The starter cultures were added in Cabernet Sauvignon and Merlot wines. In Cabernet Sauvignon wines, after 45 days the MLF was completed in all wines inoculated with bacteria, while in the treatment without inoculation and in all treatments in Merlot the MLF did not occur within 170 days. The inoculation of lactic acid bacteria was successful in Cabernet Sauvignon wines and the most likely explanation for the difficulty in Merlot wines is the interaction between some physical and chemical variables present in the extremely complex wine matrix, which caused loss of cell viability and/or malolactic activity. Despite having experienced slower growth, took longer to complete the MLF and have generated positive result for the production of one biogenic amine, the bacteria C2 generated the best results in the sensory analysis of wine. The bacteria R31 and R34 also produced satisfactory sensory results, so that the three isolates are indicated for use in winemaking, and in new research about the MLF.

TORRES, M. C. M. Solanum campaniforme: constituintes químicos, estudo de fragmentação e desreplicação por espectrometria de massas com ionização por electrospray (IES-EM/EM). 2011. 235 f. Tese (Doutorado em Química) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2014-11-24T22:50:31Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_mcmtorres.pdf: 29299690 bytes, checksum: 7abc0e4eb601a0a03178bae7d43d7e12 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-12-15T23:29:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_mcmtorres.pdf: 29299690 bytes, checksum: 7abc0e4eb601a0a03178bae7d43d7e12 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-15T23:29:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_mcmtorres.pdf: 29299690 bytes, checksum: 7abc0e4eb601a0a03178bae7d43d7e12 (MD5) Previous issue date: 2011 / This work describes the phytochemical investigation of Solanum campaniforme (Solanaceae), aiming the isolation and structural elucidation of new bioactive chemical constituents, as well as the study of their fragmentation pattern under electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) of the isolated alkaloids. The chemical investigation performed with the ethanol extract from leaves of this species by chromatographic methods, including HPLC (reverse phase), resulted in the isolation and identification of nineteen compounds, being four of them phenol derivatives: caffeic acid (SC-1), caffeic acid ethyl ester (SC-2), kaempferol-3-rutinoside (SC-3) and tyramine (SC-4), and fifteen steroidal alkaloids: 22,23-epoxy-solanida-1,4,9-trien-3-one (SC-5), 22,23-epoxy-solanida-1,4-dien-3-one, (SC-6), 3,9-dihydroxy-22,23-epoxy-9(10)-seco-solanida-1,3,5(10)-triene (SC-7), 12-acetoxyl-(25S)-22N-spirosol-4-en-3-one (SC-8), (25S)-22N-spirosol-1,4-dien-3-one (SC-9), (25S)-22-N-spirosol-4-en-3-one (SC-10), 22,23-epoxy-solanida-1,4-dien-3-one (SC-11), 22,23-epoxy-10-epi-solanida-1,4,9-trien-3-one (SC-12), 12-hydroxy-(25S)-22N-spirosol-4-en-3-one (SC-13), 22,23-epoxy-solanida-4-en-3-one (SC-14) and 22,23-epoxy-solanida-4-en-3-one (SC-15), (E)-N-[8’(4-hydroxyphenyl)ethyl]-22,23-epoxy-solanida-1,4,9-trien-3-imine (SC-16), (E)-N-[8’(4-hydroxyphenyl)ethyl]-22,23-epoxy-solanida-1,4-dien-3-imine (SC-17), (Z)-N-[8’(4-hydroxyphenyl)ethyl]-22,23-epoxy-solanida-1,4,9-trien-3-imine (SC-18) and (Z)-N-[8’(4-hydroxyphenyl)ethyl]-22,23-epoxy-solanida-1,4-dien-3-imine (SC-19). Except the alkaloids SC-9 and SC-10, which are being reported as natural products for the first time, all others are unknowns. The structure of all isolated compounds were elucidated by spectral) methods (IR, HR-ESI-MS, 1H and 13C NMR 1D and 2D and by comparison with literature data. The fragmentation pattern of the alkaloids was established based on MS/MS experiments and the data were used for the dereplication these compounds present in the crude ethanol extract from leaves of S. campaniforme. The cytotoxic potencial of the main alkaloids (SC-5 and SC-7) was evaluated against the human tumor cell lines (HCT8, MDA-MB-435, HL6 and SF295), however, no one showed any activity. The antiophidic properties of the same compounds were also investigated against Bothrops pauloensis venom, showing anti-myotoxic, anti-hemorrhagic and anti-necrosis effects. In addition, was evaluated the effect of tyramine on the metabolism of animals with dyslipidemia and obesity, which exhibited therapeutic effect associated to reduction of the cholesterol levels / Este trabalho descreve o estudo fitoquímico de Solanum campaniforme (Solanaceae), visando o isolamento e elucidação estrutural de novos constituintes químicos bioativos, bem como o estudo do padrão de fragmentação por espectrometria de massas seqüencial com ionização por electrospray (IES-EM/EM) dos alcalóides obtidos. A investigação química realizada com o extrato etanólico das folhas da referida espécie, através de métodos cromatográficos, incluindo CLAE (fase reversa), resultou no isolamento e identificação de dezenove substâncias, sendo quatro derivados fenólicos: ácido caféico (SC-1), éster etílico do ácido caféico (SC-2), canferol-3-O-rutinosídeo (SC-3) e tiramina (SC-4), e quinze alcalóides esteroidais: 22,23-epoxi-solanida-1,4,9-trien-3-ona (SC-5), 22,23-epoxi-solanida-1,4-dien-3-ona (SC-6), 3,9-dihidroxi-22,23-epoxi-9,10-seco-solanida-1,3,5(10)-trieno (SC-7), 12-acetiloxi-(25S)-22N-espirosol-4-en-3-ona (SC-8), (25S)-2N-espirosol-1,4-dien-3-ona (SC-9), (25S)-22N-espirosol-4-en-3-ona (SC-10), 22,23-epoxi-solanida-1,4-dien-3-ona (SC-11), 22,23-epoxi-10-epi-solanida-1,4,9-trien-3-ona (SC-12), 12-hidroxi-(25S)-22N-espirosol-4-en-3-ona (SC-13), 22,23-epoxi-solanida-4-en-3-ona (SC-14) e 22,23-epoxi-solanida-4-en-3-ona (SC-15), (E)-N-[8’(4-hidroxifenil)etil]-22,23-epoxi-solanida-1,4,9-trien-3-imina (SC-16), (E)-N-[8’(4-hidroxifenil)etil]-22,23-epoxi-solanida-1,4-dien-3-imina (SC-17), (Z)-N-[8’(4-hidroxifenil)etil]-22,23-epoxi-solanida-1,4,9-trien-3-imina (SC-18) e (Z)-N-[8’(4-hidroxifenil)etil]-22,23-epoxi-solanida-1,4-dien-3-imina (SC-19). Com exceção dos alcalóides SC-9 e SC-10, os quais estão sendo relatados como produtos naturais pela primeira vez, todos os demais são inéditos. As substâncias isoladas tiveram suas estruturas elucidadas por métodos espectrométricos (IV, EM e RMN 1H e 13C 1D e 2D), além de comparação com dados da literatura. O padrão de fragmentação dos alcalóides foi estabelecido com base nos experimentos EM/EM e os dados obtidos foram usados na análise de desreplicação destes compostos no extrato etanólico bruto das folhas da espécie em estudo. O potencial citotóxico dos alcalóides majoritários (SC-5 a SC-7) foi avaliado frente às linhagens de células tumorais humanas: cólon (HCT8), mama (MDA-MB-435), leucemia (HL60) e cérebro (SF295), porém mostraram-se inativos. Estes compostos também foram investigados quanto as suas propriedades antiofídicas frente ao veneno de Bothrops pauloensis, mostrando significativos efeitos anti-miotóxico, anti-hemorrágico e anti-necrosante. Além disso, foi avaliado o efeito da tiramina sobre o metabolismo de animais com dislipidemia e obesidade, a qual apresentou efeito terapêutico relacionado à redução dos níveis de colesterol.

PAIVA, J. R. Estudo do potencial biocatalítico do fungo Rhizopus stolonifer na biotransformação de produtos naturais. 2014. 75 f. Dissertação (Mestrado em Química) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2014-11-17T19:43:15Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_jrpaiva.pdf: 3168577 bytes, checksum: 2dccc004cc1f31dfdf97995945f8f1db (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-01-22T19:59:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_jrpaiva.pdf: 3168577 bytes, checksum: 2dccc004cc1f31dfdf97995945f8f1db (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-22T19:59:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_jrpaiva.pdf: 3168577 bytes, checksum: 2dccc004cc1f31dfdf97995945f8f1db (MD5) Previous issue date: 2014 / In this work the biocatalytic potential of the fungus Rhizopus stolonifer a phytopathogenic fungus in biotransformations of natural secondary metabolites was investigated Two of these metabolites the diterpene 3,12-dioxo-15,16-epoxy-4-hydroxycleroda-13(16),14-diene and the phenolic derivative 6-gingerol was biotransformed and their products was isolated and quantified by HPLC The structural determination of biotransformation products was obtained by analysis of 1H NMR 13C NMR 13C-NMR DEPT 135 IV and MS spectrum The products were obtained by a biorreduction process revealing the potential of this fungus in selective reduction of unconjugated carbonyl groups The products from bioreduction were submitted to antitumor assay against human tumor cell lines OVCAR-8 (ovarian) SF-295 (glioblastoma) and HCT-8 (colon) The biotransformation product 6-gingerdiol showed the highest percentage of inhibition of cell growth: 91,83; 70,90 e 78,56, respectively / Neste trabalho investigou-se o potencial biocatalítico do fungo Rhizopus stolonifer um fungo fitopatogênico em biotransformações de metabólitos secundários naturais Dois desses metabolitos, o diterpeno 3,12-dioxo-15,16-epoxi-4-hidroxicleroda-13(16),14-dieno e o derivado fenólico 6-gingerol foram biotransformados e seus respectivos produtos isolados e quantificados por CLAE A elucidação estrutural dos produtos de biotransformação pelo fungo Rhizopus stolonifer foram realizadas por análise dos espectros de RMN 1H RMN 13C RMN 13C-DEPT 135 IV e EM Identificou-se que os produtos obtidos eram provenientes de uma biorredução revelando o potencial deste fungo na redução quimio e regiosseletivas de grupos carbonilas não conjugados Realizou-se o estudo cinético dos produtos de biorredução por CLAE e ensaios citotoxicidade frente às linhagens tumorais humanas OVCAR-8 (ovário) SF-295 (glioblastoma) e HCT-8 (cólon) O produto biorreduzido 6-gingerdiol apresentou os melhores percentuais de inibição do crescimento celular: 91,83; 70,90 e 78,56 respectivamente

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-07-25T04:09:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347088.pdf: 3940415 bytes, checksum: 28dbecb4b7a705a97c97b2cb3135050b (MD5) Previous issue date: 2017 / Indivíduos HIV-positivos geralmente apresentam uma elevada depleção de linfócitos T CD4. A morte de células infectadas ou não por HIV-1 é resultado, entre diversos outros fatores, da apoptose mediada por proteínas virais. Está apoptose pode ser ativada por mecanismos extrínsecos ou intrínsecos, respectivamente através de receptores celulares ou ativação de moléculas sinalizadoras de morte. Uma das vias celulares que regula a sobrevivência ou morte da célula é a via UPR (Unfolded Protein Response), que regula o estresse reticular causado pelo acúmulo de proteínas mal dobradas através do bloqueio da tradução proteica, aumento da expressão de chaperonas que auxiliam no dobramento e direcionam as proteínas mal dobradas para a via de degradação de proteínas associada ao retículo (ERAD). Quando o estresse reticular é prolongado, como no caso de infecções virais, a via UPR induz apoptose através da expressão da molécula pró-apoptótica CHOP. Neste trabalho, observou-se que após 72 horas de estímulo com 200 nM da proteína Tat houve um aumento significativo na taxa de apoptose das células Jurkat (12,05%, P<0.0001), indicando que provavelmente a proteína Tat exerce um efeito biológico que desencadeia o processo de apoptose. Células estimuladas também apresentam significativas alterações no perfil de transcritos dos genes que codificam as proteínas da via UPR: PERK, ATF6, IRE1, BIP, eIF2a, XBP1-u, XBP1-s, CHOP; e genes relacionado a apoptose mediada pelo estresse de RE: ATF4, CHOP, GADD34, BIM e BCL-2. Esses resultados indicam que a proteína Tat induz alterações celulares que geram estresse no RE levando a ativação da via UPR. O aumento na transcrição de CHOP pode indicar que o estresse no RE está envolvido no mecanismo de apoptose dessas células. Foi observado ainda, que células estimuladas sofrem parada nas fases S e G2 do ciclo celular e perdem o potencial de membrana de mitocôndria, sendo esses outros possíveis mecanismos de apoptose induzido por Tat. A identificação do papel de Tat no estresse no RE com posterior indução apoptótica podem reforçar a sugestão da via UPR como um possível alvo terapêutico.<br> / Abstract : HIV-positive individuals usually have a high depletion of of CD4 lymphocytes. The death of cells infected or not by the HIV is a result, among many other factors, the apoptosis mediated by viral proteins. Extrinsic or intrinsic pathways, respectively through cell surface receptors or activation of death signaling molecules, can trigger apoptosis cell death. The Unfolded Protein Response (UPR) is one of the cellular pathways that regulate cell survival or cell death. UPR also regulates the Endoplasmic Reticulum (ER) stress caused by the accumulation of misfolded or unfolded protein, by blocking the cell protein translation, increased expression of chaperones that assist in protein folding and lead misfolded proteins for the degradation pathway associated with the ER. When the ER stress is prolonged, as in the case of viral infections, the UPR induces apoptosis through the expression of pro-apoptotic molecule CHOP. In the present work, it was observed that after 72 hours of stimulation with 200nM of Tat protein there was a significant increase in apoptosis rate in Jurkat cells (12,05%, p<0.0001), indicating that Tat protein most likely exerts a biologic effect which triggers the apoptosis pathway. Cells stimulated also showed significant changes in transcription profile of genes encoding proteins of the UPR pathway: PERK, ATF6, IRE1, BIP, eIF2a, XBP1-u, XBP1-s, CHOP; and the genes related to ER stress-mediated apoptosis: ATF4, CHOP, GADD34, BIM e BCL-2. The increase in CHOP transcription may indicate that the ER stress is involved in the mechanisms that induces apoptosis in Jurkat cells. Furthermore, Tat stimulation induces cell cycle arrest and loss of mitochondrial membrane potencial in Jurkat cells. Identification the role of Tat in ER stress-induced apoptosis may reinforce the suggestion of the UPR pathway as a possible therapeutic target.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-07-25T04:09:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347087.pdf: 1276548 bytes, checksum: 2fb829c12b7aefe6c5a2912ffa8ea3ed (MD5) Previous issue date: 2017 / O tomate (Solanum lycopersicum L.) é um dos produtos hortícolas mais consumidos no mundo, seja na forma processada ou in natura. No Brasil, doenças foliares como a mancha bacteriana causada por Xanthomonas gardneri (Xg) e a pinta bacteriana causada por Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) são comuns e acarretam inúmeras perdas econômicas na produção de tomate. A crescente preocupação com saúde humana e ambiental tem incentivado diversas pesquisas em prol de uma agricultura mais sustentável. Estudos recentes têm demonstrado a potencialidade de uma vasta gama de micro-organismos endofíticos isolados a partir de diversas espécies vegetais para o controle de fitopatógenos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi isolar bactérias a partir de diferentes genótipos de tomate e selecionar isolados para o controle biológico da mancha e da pinta bacteriana. Para isto, realizou-se o isolamento de 119 isolados bacterianos a partir de amostras de parte aérea, semente e raízes de 15 cultivares de tomate. Informações sobre a origem das amostras e características morfo-fisiológicas, dentre elas a morfologia de colônia, teste Gram, produção de pigmentos fluorescentes, amilase e pectinase, permitiram distinguir 34 isolados endofíticos. Para acessar o potencial dos mesmos no controle de doenças foliares do tomateiro, realizou-se uma seleção prévia com auxílio de metodologias in vitro contra os patógenos Xg e Pst. Na sequência avaliou-se por meio de ensaios em condições de casa de vegetação o efeito dos isolados na redução da severidade da mancha bacteriana causada por Xg. Ao todo, 24 isolados (70,54%) foram capazes de produzir sideróforos em meio Cromo Azurol S e 17 (50%) foram caracterizados como positivos para capacidade de solubilizar fosfato bicálcico. Onze isolados bacterianos inibiram o crescimento de Xg e três destes também apresentaram atividade antimicrobiana frente a Pst. As bactérias endofíticas selecionadas, isolados ISO043, ISO057, ISO137 e ISSO125 reduziram a severidade da mancha bacteriana causada por X. gardneri em condições de casa de vegetação, em 2 experimentos independentes. Apenas o isolado ISO123 não diferiu da testemunha na avaliação feita aos 21 dias após a inoculação do patógeno, no 2º experimento. Após comparar o perfil de DNA dos isolados ISO043 e ISO137 gerado pela técnica de BOX-PCR, verificou-se que estes correspondem à mesma espécie do gênero Pseudomonas e provavelmente à mesma linhagem de bactéria. Apesar do nível de controle da bacteriose não diferir significativamente para os quatro isolados endofíticos promissores, os isolados ISO043 e ISO137 apresentam vantagens pois, esta linhagem de bactéria pode colonizar tanto a parte aérea quanto a parte radicular do tomateiro. Além disso, esta linhagem é capaz de produzir sideróforos e solubilizar fosfatos inorgânicos. Mais estudos são necessários para verificar a eficácia da aplicação dos isolados obtidos neste trabalho em condições de campo e também a eficácia in vivo contra P. syringae pv. tomato. Entretanto, a possibilidade de uso destas bactérias é uma alternativa promissora para o controle de bacterioses foliares. Isto por que além da ação direta de compostos antimicrobianos, os endofíticos poderiam proporcionar um controle indireto de doenças vegetais devido à melhora nas condições nutricionais da planta.<br> / Abstract : Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the most consumed vegetables in the world. In Brazil, foliar diseases such as the bacterial spot caused by Xanthomonas gardneri (Xg) and the bacterial speck caused by Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) are common and responsible for numerous economic losses in tomato production. Nowadays, the concern for human and environmental health has encouraged several studies in support of a more sustainable agriculture. Recent studies have demonstrated the potential of a wide range of endophytic microorganisms isolated from various plant species for control of phytopathogens. In this context, the objective of this work was to isolate bacteria from different tomato genotypes and to select isolates for the biological control of the spot and the bacterial pathogen. The isolation of 119 bacteria was made from samples of flowers, leaves, seeds and roots of 15 tomato cultivars. After that, information about the origin of the samples and morphophysiological traits, among them the colony morphology, Gram test, production of fluorescent pigments, amylase and pectinase allowed to distinguish 34 endophytic isolates. To access their potential to control foliar diseases of tomato, a previous selection was made through in vitro methodologies against X. gardneri and P. syringae pv. tomato. The effect of the isolates in reducing the severity of bacterial spot caused by Xg was evaluated through greenhouse conditions. Twenty four isolates (70.54%) were able to produce siderophores in CAS medium and 17 (50%) were characterized as positive for the ability to solubilize dicalcium phosphate. Eleven endophytic isolates inhibited Xg in vitro, among these 3 isolates also presented antimicrobial activity against Pst. The selected endophytic bacteria isolates ISO043, ISO057, ISO137 and ISO125 reduced the severity of the bacterial spot caused by X. gardneri under greenhouse conditions in 2 independent experiments. Only the isolate ISO123 did not differ from the control in the second experiment. After comparing the DNA profile of the ISO043 and ISO137 isolates generated by the BOXPCR technique, it was found that these correspond to the same species belonging to the genus Pseudomonas and probably the same bacterial strain. Despite the results in vivo do not differ between the selected endophytes, isolates ISO043 and ISO137 has advantages because this strain of bacteria can colonize both the phylosphere and the rhizosphere of tomato plants. Furthermore, this strain is capable of producing siderophores and solubilizing inorganic phosphate. Further research is needed to verify the efficacy of application of the isolates obtained in this work under field conditions and also the efficacy against P. syringae pv. tomato. However, the possibility of using this bacterial strain is a promising alternative for the control of foliar bacterioses. This is because besides the direct action of antimicrobial compounds, they could provide indirect control of plant diseases as a result of improvement in the nutritional status of the plant.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-11-14T03:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348743.pdf: 4711943 bytes, checksum: 2e1d0c81e25c50e4748910ac8f45346a (MD5) Previous issue date: 2017 / A eletrofiação é uma promissora técnica à geração de sistemas de liberação de fármacos e engenharia de tecidos. Este trabalho descreve o desenvolvimento de matrizes nanoestruturadas permissivas à diferenciação de células neuronais. Inicialmente, o efeito dos parâmetros processuais da eletrofiação e da configuração do coletor na arquitetura das fibras foi estudado. O processo foi otimizado para obtenção de nanofibras randomizadas e alinhadas. Nanofibras de policaprolactona (PCL) foram produzidas usando três configurações de coletor: um cilindro metálico rotatório, fios de cobre e um mandril rotatório. O coletor cilíndrico gerou uma nanomatriz com estrutura típica tridimensional, na qual a velocidade de rotação mecanicamente promoveu a redução do diâmetro e alinhamento das fibras. Um padrão de fibras randomizadas com um diâmetro médio de 1142 ± 391 nm foi observado a 0 rpm, enquanto nanofibras alinhadas com um diâmetro médio de 663 ± 334 nm foram produzidas a 2000 rpm. Os cabos de cobre originaram um novo padrão de matriz, cujo grau de orientação das fibras relacionou-se à distribuição do campo elétrico no coletor. Por sua vez, o coletor de mandril deu origem a uma matriz tubular constituída de fibras com diâmetro médio de 606 ± 329 nm. Em seguida, avaliou-se a influência do efeito do polietilenoglicol (PEG) em nanofibras compostas por blendas de PEG e PCL. Três tipos de PEG consoante à massa molecular (400, 1500, e 35000 Da) e três concentrações (1, 5, e 10% em relação à PCL) foram estudados. As matrizes foram caracterizadas quanto a sua arquitetura por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e propriedades mecânicas por teste de tração uniaxial, utilizando um analisador de textura. Em presença de PEG houve uma redução do diâmetro e da resistência mecânica das fibras. Estudos de cultura celular demonstraram a ausência de citotoxicidade destes biomateriais. A adequação do uso do PEG para prolongar a liberação de NGF foi demonstrada. A bioatividade do NFG incorporado nas matrizes foi avaliada através da diferenciação de células PC12. As matrizes constituídas de nanofibras alinhadas promoveram o alinhamento de neuritos e a presença de PEG influenciou positivamente o perfil de liberação do NGF e a degradabilidade das matrizes. Por fim, foi produzido um sistema de liberação prolongado de NGF constituído por uma matriz tubular de nanofibras randomizadas na camada externa e alinhadas no lúmen. Os resultados obtidos indicam que as matrizes desenvolvidas, constituídas de nanofibras de PCL e PEG, apresentam potencial de aplicação como sistema de liberação de NGF e no estudo da regeneração nervosa periférica. / Abstract : Electrospinning is a promising technique to generate scaffolds for delivery systems and nerve tissue engineering. This study describes the development of a nanostructured matrix permissive to neural cell differentiation. Firstly, the effect of setting up parameters and collector design on the alignment and architecture of electrospinning fibers was studied. The process was optimized to obtain randomized and aligned nanofibers. Polycaprolactone (PCL) fibers were produced using three collectors: metallic rotating drum, copper wires, and a rotating mandrel. The drum collector produced a typical tridimensional structure whereby the rotational speed mechanically stretches fibers and affects their diameter and alignment. Randomly oriented fibers with an average diameter of 1142 ± 391 nm were obtained at 0 rpm, while aligned fibers with an average diameter of 663 ± 334 nm were produced at 2000 rpm. Static copper wires produced a novel fiber pattern in which the degree of orientation of the fibers was related to the electrical field distribution along the collector. Mandrel collector produced a tubular mat composed by nanofibers with an average diameter of 606 ± 329 nm. In a second series of experiments, the influence of polyethyleneglycol (PEG) on nanofibers composed of PCL and PEG blends was evaluated. Three types of PEG with t molecular weights (400, 1500, and 35000 Da) and concentrations (1, 5, and 10% ratio to PCL) were studied. Mats were characterized in terms of architecture by Scanning Electron Microscopy (SEM) and mechanical properties by uniaxial tensile tests using a texture analyser. The presence of PEG decreased the diameter and mechanical resistance of fibers. Cell culture studies have demonstrated the absence of cytotoxicity of these biomaterials. The suitability of using polyethylene glycol (PEG) to prolong the delivery of NGF incorporated into PCL electrospinning nanofibers was demonstrated. The effect of released nerve growth factor (NGF) from the mats was evaluated by neuronal differentiation using PC12 cells. Electrospun scaffolds composed by aligned nanofibers promoted alignment and neurite outgrowth of PC12 cells along the axis of the aligned nanofibers. PEG influenced positively the release profile of NGF and mats degradability. Finally, a sustained NGF deliver system composed by a tubular matrix of randomized nanofiber in the outer layer and aligned nanofibers in the lumen was produced. Therefore, the results obtained indicate that the developed matrix, composed by PCL and PEG nanofibers, present potential application as a NGF delivery system and in the study of the peripheral nervous regeneration.