Resumo: Estudo retrospectivo com a finalidade de avaliar o impacto da introdução de um regime alternativo de condicionamento para transplantes de medula óssea alogênicos com doadores aparentados, totalmente compatíveis, portadores de Leucemia Mielóide Crônica, em Fase Crônica. No período de agosto de 1996 a julho de 2008, foram incluídos 158 pacientes, analisados em dois diferentes momentos: o primeiro inclui os pacientes transplantados antes de 2004, quando 72(45%) deles, foram tratados com a combinação Busulfano e Ciclofosfamida (BUCY). Neste período inicial os dados demonstraram melhores resultados nos pacientes abaixo de 30 anos. No segundo período (após 2004) o regime de condicionamento era orientado em função da idade do receptor, condições clínicas, e pelo histórico individual de comorbidades. Com um total de 86 pacientes, transplantados até o final da análise, 44(28%) deles receberam a combinação BUCY e 42(27%) indivíduos foram alocados para o protocolo envolvendo Busulfano e Fludarabina (FLUBU). As informações do grupo transplantado antes de 2004 mostram forte influência da idade do receptor, acima ou abaixo de 30 anos, na Sobrevida Global (p=0, 005), na Sobrevida Livre de Doença (p=0, 001) e na Mortalidade não Relacionada à Recaída (p=0,01). Outra observação nessa população foi a ocorrência da Doença Enxerto contra o Hospedeiro crônica, aos cinco anos, mais freqüentemente observada entre os pacientes que receberam Células Progenitoras Periféricas (92% vs 49% quando foi utilizada a Medula Óssea como fonte, p= 0, 004). Após 2004 os dois grupos de tratamento foram muito heterogêneos em relação a sua composição etária, com idade mediana superior no grupo que recebeu FLUBU (45 (28 a 54) anos vs. 28 (16 a 51) anos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This is a retrospective study that aims to assess the impact of the introduction of an alternative conditioning regimen in stem celltransplants with allogeneic fully matched related donors, in patients with Chronic Myeloid Leukemia in Chronic Phase. From August 1996 to July 2008 we included 158 patients, tested during two different periods: the first period includes patients transplanted before 2004, when 72 (45%) of them were treated with the combination of Busulfan and Cyclophosphamide (BUCY). These data demonstrated that the outcome was better among patients below the age of 30 years. The second period comprised all patients transplanted after 2004. In this second period the choice of the conditioning regimen was based on recipient age, clinical condition and the individual history of comorbidities . With a total of 86 patients transplanted by the end of the analysis, 44 (28%) of them received the BUCY combination and 42 (27%) patients were allocated to the protocol with Busulfan and Fludarabine (FLUBU). For the group transplanted before 2004 a strong influence of recipient age (above or below 30 years old) on Overall Survival (p = 0.005), Disease-free Survival (p = 0.001) and Mortality Related to Transplantation (p = 0.01) could be demonstrated. Graft Versus Host Disease, at five years, was most frequently observed among patients receiving Peripheral blood Progenitor Cells (92% vs 49%) when compared with the use of Bone Marrow as a stem cell source, p = 0.004). After 2004 the two treatment groups were very heterogeneous in relation to their age structure, with older patients receiving FLUBU (45 (28 to 54) years vs 28 (16 to 51), p < 0.0001). Although we analyzed two distinct age groups , the results were comparable in terms of Overall Survival at 3 years (p = 0.49) in Disease-free Survival at 3 ... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Belinda Simões / Coorientador: Ana Lúcia Coradazzi / Coorientador: Celso Arrais / Banca: Lígia Niero-Melo / Banca: Júlio Cesar Voltarelli / Mestre

Orientador: Regina Kiomi Takahira / Banca: Leonardo Brandão / Banca: Marcelo Larami Santoro / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar a importância das plaquetas reticuladas nas condições trombocitopênicas associadas a hipoplasia de megacariócitos e a outras etiologias sem alteração no número de megacariócitos. Para tanto foram utilizados 30 cães sadios adultos (Grupo controle); 15 cães com trombocitopenia (< 100.000 plaquetas/mL), por causas diversas que não sejam por hipoplasia megacariocítica (Grupo A) e 15 cães com trombocitopenia (< 100.000 plaquetas/mL) e com hipoplasia megariocítica (Grupo B), constatadas por meio de citologia aspirativa de medula óssea. Foi coletado sangue e extraído o plasma rico em plaquetas para a realização da quantificação das plaquetas reticuladas em citometria de fluxo e colheita de medula óssea para a análise do número de megacariócitos por duas técnicas distintas e correlação com as plaquetas reticuladas. Não foi observada diferença estatística (p>0,05) entre as duas técnicas de quantificação de megacariócitos. Foi observada diferença estatística (p<0,05) para as plaquetas reticuladas, sendo superior nos grupos A e B, em relação ao grupo controle. Não houve correlação entre plaqueta reticulada e megacariócitos medulares. A ausência de correlação observada não nos permite estabelecer relações de contagem de PR com o aumento do número de megacariócitos na medula óssea. / Abstract: The aim of this study was to evaluate the reticulated platelet importance in evaluation of platelet production in thrombocytopenic conditions associated with megakaryocytic hypoplasia and other conditions with adequate number of bone marrow megacaryocytes. These study were obtained from 30 healthy dogs (control group), 15 thrombocytopenic dogs (< 100,000 platelets/μL) without megakaryocytic hipoplasia (group A) and 15 thrombocytopenic dogs (< 100,000 platelets /μL) with megakaryocytic hipoplasia (group B). Blood samples were collected and the platelet rich plasma (PRP) was extracted for quantification of reticulated platelets in flow cytometry, megakaryocytes were quantified in marrow particles, collected from aspiration cytology and correlated to reticulated platelets counts. No statistical significance (p>0.05) was observed between two megakaryocytes quantification techniques. For reticulated platelets was observed statistical significance difference (p<0.05), values from groups A and B were higher than control group. No correlation was verified between reticulated platelets and marrow megakaryocytes. The absence of correlation do not allow us to establish relationship of reticulated platelets with increase production of bone marrow megakaryocytes. / Mestre

Orientador: Pedro Felício Estrada Bernabé / Banca: Idelmo Rangel Garcia Júnior / Banca: Osvaldo Magro Filho / Banca: Vinicius Canavarros Palma / Banca: Ariel Lenharo / Resumo: O objetivo deste estudo experimental foi comparar histologicamente o reparo ósseo ao redor de implantes preenchidos por coágulo local com ou sem a associação de centrifugado de medula óssea, por meio de análises histológica e histométrica. Doze coelhos receberam dois implantes osseointegráveis em cada tíbia direita, onde a primeira cortical foi preparada com 5 mm e a segunda, ou cortical inferior, com 3 mm. Os implantes foram estabilizados na cortical inferior com 40 N, sendo um defeito preenchido por coagulo sanguíneo e o outro com coágulo e centrifugado de medula óssea. O sacrifício dos animais foi realizado nos períodos de 7, 21 e 60 dias. As peças foram submetidas a processamento laboratorial de rotina e coradas com vermelho de alizarina e azul de Stevenel. Tanto o grupo coágulo quanto o grupo coágulo e centrifugado de medula, após 60 dias, tiveram seus defeitos preenchidos por tecido ósseo, não apresentando diferença estatística entre os grupos quanto à extensão linear de contato entre tecido ósseo e implante. / Abstract: The objective of this experimental study was to compare histologically the bone repair around implant filled out by local coagulum with or without association of bone marrow centrifuged through histological and histometric analysis. Twelve rabbits received two implants in the right tibia, where the first cortical it was prepared with 5 mm and the second or lower cortical, with 3 mm. The implants were stabilized in lower cortical with 40 N, being one defect filled out by blood coagulum and the other filled out by blood coagulum and bone marrow centrifuged. The sacrifice of the animals was accomplished in the periods of 7, 21 and 60 days. The pieces were submitted to routine laboratorial process and stained with alizarin red and Stevenel's blue. Both groups had their defects filled by bone after 60 days, not presenting statistical difference between the groups about the linear extension of contact between bone tissue and implant. / Doutor

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: A lesão do tendão do músculo flexor digital superficial (TFDS) é uma importante causa de claudicação em eqüinos, com prevalência de 13 a 30%, de acordo com a atividade eqüestre. Sua instalação pode comprometer a carreira do potro com recidivas ou causar o afastamento das corridas. Além disto, determina longos períodos de recuperação, com prejuízo à função tendínea. Os tratamentos propostos são diversos, mas efeitos como melhora da qualidade ou rapidez da cicatrização não são confirmados por estudos controlados. A terapia intralesional com fatores de crescimento (TGF-ß e IGF- 1), assim como a terapia com choques extracorpóreos vêm mostrando resultados promissores. Recentemente, os avanços médicos têm demonstrado crescente interesse na utilização das células-tronco em terapia de doenças degenerativas e também em cicatrização lenta ou ineficaz. Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do implante autólogo de células mesenquimais de medula óssea na cicatrização tendínea, comparando tendões tratados com tendões do grupo controle. Foi induzida lesão do TFDS de ambos os membros anteriores de seis eqüinos, seguida por implante autólogo em apenas um membro de cada animal. Os animais foram avaliados por parâmetros clínicos e ultra-sonográficos e após biópsia realizada ao 48o dia do experimento, foram verificadas características histopatológicas e imunoistoquímicas. Resultados como aumento do infiltrado inflamatório celular, abundância da matriz, diminuição da necrose, discreto aumento no índice de proliferação celular (Ki- 67, clone MIB1) e menor imunomarcação do TGF-ß1 caracterizam a aceleração do reparo tendíneo no grupo tratado. Estudos aprofundados devem ser desenvolvidos com o objetivo de definir a influência do tratamento em fase posterior do reparo. Conclui-se, então, ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The superficial digital flexor tendonitis (SDFT) is an important cause of lameness in horses with incidence from 13 to 30% depending of the exercise modality. This injury can occur in yearlings and compromise its carrier by reinjury or even the impossibility of return to athletic life. Although long periods of rest are necessary to tendon repair, there is an elasticity loss in the tendon. As current treatment regimes have only marginal effects there is interest in researching therapies that influence the quality or the duration of tendon repair. Intralesional therapy with growth factors (TGFß1 e IGF-1) and radial shock wave therapy have been presenting promising results. Recently, medical interest has been directed to the stem cells therapy of degenerative diseases and cases of deficient healing process. This study aims to evaluate the influence of autologous mesenchymal stem cells from bone marrow in tendon healing, comparing treated and none treated tendons. Induced collagen lesions were in both forelimbs TFDS from six horses, followed by autologous implant in one forelimb from each animal. The horses were evaluated by clinical, ultrasonographic, histophatologic and imunohistochemistry parameters. Tendon biopsies were done at day 48. Results such as high inflammation cells infiltration and synthesis of extracellular matrix, few necrosis areas, discrete increase in cellular proliferation (Ki-67) and low immunoreactivity to TGFß1 found in treatment group suggested the acceleration of tendon repair in this group. Further studies should be developed in order to verify the influence of this treatment on later phase of tendon repair. Overall, after analysis of results, we conclude that cellular therapy with mesenchymal stem cells have accelerate tendon repair at 48 days after treatment. / Doutor

Orientador: José Corrêa de Lacerda Neto / Banca: Ana Liz Garcia Alves / Banca: Cristina de Oliveira Massoco / Banca: Silvana Martinez Baraldi Artoni / Banca: Marcia Rita Fernandes Machado / Resumo: As células-tronco da linhagem mesenquimal representam uma fonte promissora para o tratamento de injúrias do sistema músculo-esquelético de equinos atletas. Objetivou-se com este trabalho avaliar técnicas de coleta e isolamento de células-tronco mesenquimais em equinos, determinar a caracterização morfológica e fenotípica e avaliar o comportamento celular sob diferentes condições de cultivo. Cinco cavalos foram submetidos à coleta de medula óssea do esterno e de tecido adiposo da região glútea. As amostras foram processadas para o isolamento de células mononucleares e cultivadas em dois tipos de meios de cultivo. No vigésimo quinto dia, foi adicionado TGF-β1, mantendo um grupo controle para cada meio. As técnicas de coleta e processamento foram avaliadas por meio de fatores como facilidade de obtenção, viabilidade celular e número de células obtidas. Características morfológicas qualitativas foram avaliadas semanalmente mediante observação das colônias por microscopia óptica de luz invertida. Características fenotípicas foram avaliadas testando-se marcadores de superfície. Os efeitos do TGF-β1 sobre as culturas de células foram determinados por meio de avaliação citoquímica, número de unidades formadoras de colônia e porcentagens de apoptose e necrose. Foram observadas diferenças entre as amostras em fatores como a viabilidade celular após descongelamento, formação de colônias e relação entre necrose e apoptose em meios de cultivo diferentes. O TGF-β1 apresentou um efeito indutor de apoptose e estimulou a formação de colônias e a produção de proteoglicanas sulfatadas confirmando o efeito condrogênico / Abstract: Mesenchymal stem cells could be a new treatment for healing musculo-skeletal injuries of equine athlete. The objectives of this study were: to analyze the harvest and isolation techniques of equine mesenchymal stem cells, to determine morphological and phenotypical characterization and to evaluate cellular behavior in different culture conditions. Five horses had sternal aspirates bone marrow and croup fat tissue harvest. Both of them harvested materials was processed for mononuclear cells isolation and cultivate in two different kinds of culture medium. Twenty-five days later TGF-β1 was add in both culture mediums, remains a control group for each one. The harvest and process techniques were evaluated through some factors like: easily of harvest, cellular viability and cellular number. Morphological qualitative characteristics were described weekly by culture microscopy observation. Phenotypical characteristics were evaluated testing cluster markers. The effects of TGF-β1 on the cells cultures were determined by histological evaluation, number of unit forming colony and relation between necrosis and apoptosis. Differences between bone marrow and fat tissue cells were observed in some factors like: cellular viability after freezing, unity colony forming and relation between necrosis and apoptosis in different mediums culture. TGF-β1showed apoptosis inductor effect and stimulated the unit forming colony and sulfated proteoglicans production confirming the chondrogenic effect / Doutor

Orientador: Idelmo Rangel Garcia Júnior / Banca: Roberta Okamoto / Banca: Élio Hitoshi Shinohara / Banca: Oswaldo Bergamaschi / Banca: Paulo Sérgio Perri de Carvalho / Resumo: O presente estudo teve por finalidade analisar as respostas teciduais do tecido subcutâneo na presença de transplante homógeno de células de medula óssea, por meio dos estudos histológico e imunoistoquímico das proteínas Cbfa1/Runx2 e osteocalcina. A metodologia utilizada nesse estudo envolve processamento em tecido descalcificado e neste caso, possibilitando cortes com menor espessura, para análise das características morfológicas das células presentes no tecido formado ao redor do enxerto e mesmo a resposta inflamatória do tecido subcutâneo ao material enxertado. Como complementação realizou-se o processamento em tecidos calcificados, após a injeção de fluorocromos, a calceína aos 10 dias e a alizarina aos 20 dias possibilitando a análise do processo de deposição de cálcio ao redor do material enxertado no tecido subcutâneo. Com a análise histológica, verificou-se que o enxerto de medula óssea isoladamente foi incorporado ao tecido subcutâneo, sendo que no período de 20 dias são observadas algumas estruturas semelhantes a tecido ósseo, pois apresentam-se morfologicamente, como tecido calcificado. Com o objetivo de caracterizar o tecido medular implantado no tecido conjuntivo subcutâneo, foi observada imunomarcação positiva contra Cbfa1/Runx2 e contra osteoclacina. Os resultados sugerem que a presença da medula óssea junto ao osso cortical, quando transplantada em seres de mesma espécie, em tecido subcutâneo, favoreceu a osteogênese pelo processo de osteoindução. / Abstract: The purpose of this study was to analyze the cellular response to the subcutaneous tissue in a presence of autolougous bone marrow cells transplantation, through the histological and imunohistochemic study of Cbfa1/Runx2 and osteocalcin proteins. The methodology uses the decalcified tissue processing, and in this case, provides thinnest slices cuts for the morphological analyses and inflammatory responses of the cells around the graft in the subcutaneous tissue. As an extra study, was evaluated the calcified tissues after the fluorochroms injection, calcein in the tenth day and alizarin in the twentieth day, given the possibility to analyze the calcium deposition process around the graft in the subcutaneous tissue. Through the histological analyses it was possible to verify that the bone marrow was well accepted by the connective tissue, at the twentieth day it was possible to see some structures similar to bone, because it was morphologically similar to calcified tissue. With the objective to characterize the bone marrow implanted in the conjunctive subcutaneous tissue, positive results against Cbfa1/Runx2 and osteocalcin was observed. The results suggest that the presence of the bone marrow next to the cortical bone, when grafted in beings of same species, in subcutaneous tissue, it favored osteogneses for the osteoinduction process. / Doutor

Orientador: Dimas Tadeu Covas / Banca: Dimas Tadeu Covas / Banca: Rodrigo Alexandre Panepucci / Banca: Haroldo Wilson Moreira / Resumo: A maior expressão de alvos transcricionais e componentes da via NFkB é uma característica distintiva das células-tronco hematopoéticas (CTH) CD34+ de sangue de cordão umbilical (SCU) comparadas às CTH CD34+ de medula óssea (MO) e pode estar relacionada com o estado mais primitivo das CTH dos neonatos. No entanto, as células CD34+ são um grupo heterogêneo de célulastronco (CT) e progenitoras em diferentes estágios de maturação e diferenças na composição celular entre MO e SCU poderiam contribuir para os resultados mencionados. Estudos recentes têm identificado o marcador de superfície CD133, como um marcador de CT mais primitivas, expresso em uma subpopulação de células CD34bright, com um sugestivo potencial de hemangioblasto. Com o objetivo de caracterizar a composição celular de MO e SCU e identificar mecanismos moleculares envolvidos com a maior primitividade das células CD133+, propusemos avaliar o perfis imunofenotípico (quanto à expressão de CD34 e CD133) por citometria de fluxo e de expressão gênica de células CD34+ e células CD133+ selecionadas imunomagneticamente, de ambas as fontes, pelas técnicas de microarray e PCR em tempo real. Nossos resultados revelaram que enquanto a maioria das células CD133+ são CD34+, independente da fonte, as células CD34+ de SCU possuem uma porcentagem significativamente maior de células CD133+ do que às células CD34+ de MO. A análise de clusterização revelou que as células CD133+ de MO se agrupam com as células de SCU (CD34+ e CD133+), enquanto as CD34+ de MO aparecem como um grupo distinto. A comparação dos perfis de expressão gênica entre as células CD133+ e as células CD34+, revelou a hiper-expressão... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: A higher expression of transcription targets and components of the NF-kB pathway is a distinctive feature of umbilical cord blood (UCB) CD34+ hematopoietic stem cells (HSC) when compared to bone marrow (BM) CD34+ HSC and this could be related to the more primitive state of the newborn's HSC. However, CD34+ cells represent a heterogeneous group of cells composed by stem and progenitors cells in different developmental stages, and differences in cellular composition between both sources could contribute for these finding. The surface marker CD133 has been identified as a very primitive marker, expressed in a subpopulation of CD34bright, with a proposal hemangioblast potential. Thus, in attempt to better characterize the cellular composition of UCB and BM and to identify molecular mechanisms related to the more primitive characteristics of CD133+ cells, we proposed to evaluate the immunophenotypic profile (expression of CD34 and CD133) by flow-cytometry and the gene expression profiles of immunomagnetically selected CD34+ and CD133+ cells, from both sources, by microarray and Real time PCR. Our results highlighted that, while almost all CD133+ cells are CD34+ independently of the evaluated source, the UCB CD34+ cells showed a significantly higher proportion of CD133 expression, compared to BM CD34+ cells. After obtaining the expression profiles from distinct HSC pooled samples generated by microarrays, cluster analysis showed that BM CD133+ cells preferentially grouped with UCB cells (CD34+ and CD133+) instead of BM CD34+ cells, which appeared as a very distinct profile The comparison between CD133+ and CD34+ samples revealed the over-expression of 47 transcriptional factors (TF) in CD133+ cells, many of them well-known and related... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre