Submitted by CLAUDIA VILALVA CASSARO null (claudia.v.cassaro@gmail.com) on 2018-03-21T13:51:17Z No. of bitstreams: 1 dissertacao claudia_cassaroFINAL.pdf: 3809022 bytes, checksum: a5c8891039ce6bc569b42ee66058c846 (MD5) / Rejected by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: Necessário fazer as seguintes correções no arquivo submetido: problema 1: Assinalar a agência de fomento (no seu caso CAPES). problema 2: No campo número do financiamento: colocar o número do processo. Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo em PDF novamente. Agradecemos a compreensão. on 2018-03-22T12:35:28Z (GMT) / Submitted by CLAUDIA VILALVA CASSARO null (claudia.v.cassaro@gmail.com) on 2018-03-22T15:52:41Z No. of bitstreams: 1 dissertacao claudia_cassaroFINAL.pdf: 3809022 bytes, checksum: a5c8891039ce6bc569b42ee66058c846 (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-03-23T12:00:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cassaro_cv_me_bot.pdf: 3809022 bytes, checksum: a5c8891039ce6bc569b42ee66058c846 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-23T12:00:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cassaro_cv_me_bot.pdf: 3809022 bytes, checksum: a5c8891039ce6bc569b42ee66058c846 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O reparo do tecido ósseo é um desafio antigo da ciência mundial. A partir das décadas de 70-80, os biomateriais passaram a ser explorados e hoje desempenham importante papel na engenharia tecidual. Estes, quando aplicados na enxertia óssea, devem ser bioativos, biocompatíveis e reabsorvíveis. A integração entre os diversos materiais de origem sintética e os arcabouços biológicos possui amplo espectro de uso. Dentre os arcabouços destacam-se os compostos à base de fibrina por suas propriedades hemostáticas, estabilidade e morfologia favorável à proliferação celular. A presente revisão abordou a estrutura e constituição do tecido ósseo e suas limitações no processo de reparo, a relevância da engenharia tecidual aplicada à esta finalidade e os biomateriais utilizados para otimizar tal processo, com ênfase especial aos materiais compostos por fosfatos de cálcio, células tronco mesenquimais e sua aplicação junto ao arcabouço biológico selante de fibrina, com destaque para o selante heterólogo de fibrina, agora denominado biopolímero de fibrina, um produto único e em fase de testes em experimentação animal e estudos clínicos. Propõe-se, ao final desta, uma nova abordagem para a regeneração de defeitos ósseos de ratos baseada na associação entre o selante heterólogo de fibrina, o fosfato de cálcio bifásico e células tronco mesenquimais. / Bone tissue repair is an ancient challenge of world science. From the 70s and 80s, biomaterials began to be explored and nowadays play an important role in tissue engineering. These, when applied in bone grafting, have to be bioactive, biocompatible and resorbable. The integration between the various materials of synthetic origin and biological scaffolds has a wide spectrum of use. Among these scaffolds, fibrin-based compounds are distinguished by their hemostatic properties, stability and morphology favorable to cell proliferation. The present review addressed the structure and constitution of bone tissue and its limitations in the repair process, the relevance of tissue engineering approaches applied to this purpose and the biomaterials used to optimize this process, with special emphasis on materials composed of calcium phosphates, mesenchymal stem cells and its application with the biological sealant fibrin scaffold, highlighting the heterologous fibrin sealant, now named as fibrin biopolymer, a unique product testing in animal experimentation and clinical studies. At the end of this, a new approach is proposed for the regeneration of rat bone defects based on the association between heterologous fibrin sealant, biphasic calcium phosphate and mesenchymal stem cells.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 893904 bytes, checksum: 428b03ed61d5a4d87eed9198cfbc34b9 (MD5) Previous issue date: 2007-10-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Biomaterials used today to treat bones' defects and fractures still bear some deficiencies to be corrected. This study is a preliminary analysis of composites' made of hydroxyapatite (HAP-91®) and polyhydroxybutyrate (PHB) essentials characteristics to be used in orthopedics. The composites were studied in osseous defects concerning their biocompatibility, osseointegration, osseoconduction, and biodegradation. Bone defects were made bilaterally in the olecranon of 30 white rabbits and each filled with a composite, with a total of 12 members per group. Limbs in the 1 group received composite # 1: 10% of HAP-91® and 90% of PHB; limbs in 2 group received composite # 2: 25% HAP- 91® and 75% PHB; and in 3 group the composite # 3: 50% of each biomaterial. Defects in the control group were not filled. Limbs were evaluated in the first eight days after surgery and again at 45 and 90 days afterwards for lameness, circumference, pain, dehiscence, and infection. Radiographs were taken 8, 45 and 90 days after surgeries when four animals in each group were euthanized and samples with defects taken for histology. Significant differences in circumference data were found for all groups before and one day after surgery, what did not happen with four and eight days. No significant differences were found between groups for circumference as well as for the other clinical parameters. Radiographs taken 8 days after surgery showed no bone- composite apposition, but those for the 45th and 90th days after showed that composites were in direct contact with bone. Histological observations indicated a normal repair process in the 8th day, i.e., a vascularized, dense connective tissue and new, early trabecular bone; this evolved to fully organized trabecular bone and the lateral cortical completely formed by the 90th-day. At the three observation dates, tissues in 1, 2, and 3 group samples were found similar to those in control, where more bone than soft tissues were found in the defect. Projections of connective and bone tissues were seen inside composites #2 and 3. No inflammatory cells in any place whatsoever were found at any observation date. Clearly more bone built up in 3 samples, and at its interface, than in the 1 and 2 groups samples. At the 45 and 90th days, in all three groups, osteoclasts were seen in the bone-composite interface, and also composite pieces, detached from the original block, were found within the bone structure and surrounding soft tissues. Conclusion is that the composites are biocompatible, osseoconductive, integrate to bone and can undergo in vivo degradation. / Os biomateriais hoje utilizados no tratamento das fraturas ósseas e da perda do tecido ósseo ainda apresentam deficiências a serem corrigidas. O presente trabalho consta da análise preliminar de características essenciais para utilização de compósitos de hidroxiapatita (HAP-91®) e polihidroxibutirato (PHB) em ortopedia. Estudou-se a biocompatibilidade, osseointegração, osseocondução e biodegradação dos compósitos em defeitos ósseos. Foram implantados três compósitos fabricados com diferentes proporções desses biomateriais em defeitos circulares bilaterais no olécrano de 30 coelhos, onde cada membro recebeu um compósito, com um total de 12 membros por grupo. Os membros do grupo 1 receberam compósitos contendo 10% de HAP-91® e 90% de PHB, do grupo 2 contendo 25% de HAP-91® e 75% de PHB, do grupo 3, 50% de cada biomaterial e os animais do grupo controle não receberam compósito. Os membros foram avaliados quanto à claudicação, circunferência do membro, sensibilidade dolorosa, deiscência e infecção nos oito primeiros dias após a cirurgia e aos 45 e 90 dias. Foram radiografados imediatamente após a cirurgia e aos oito, 45 e 90 dias. Nessas mesmas datas, 4 animais de cada grupo foram eutanasiados, coletando-se material para processamento histológico. Existiu diferença significante entre os valores de circunferência do membro no pré-operatório e do primeiro dia após a cirurgia dentro de todos os grupos, o que não ocorreu em relação aos dias quatro e oito. Não houve diferença entre os grupos para esse parâmetro assim como para os demais. Não foi observado contato direto entre osso e compósito nas radiografias obtidas aos oito dias após as cirurgias, mas aos 45 e 90 dias nos três grupos tratados observou-se este contato. À análise histológica do grupo controle observou-se processo típico de reparação, ou seja, tecido conjuntivo denso vascularizado e trabéculas ósseas novas aos oito dias com evolução para osso trabecular mais organizado aos 90 dias e cortical lateral restabelecida. Os tecidos observados nos grupos 1, 2 e 3 foram semelhantes ao controle, sendo a proporção de tecido ósseo formada no defeito, maior do que a de tecidos moles em todas as datas. Nos grupos dois e três foram observadas projeções de tecido ósseo e conjuntivo no interior dos poros do compósito. Infiltrados inflamatórios não foram observados em nenhum momento. O grupo 3 apresentou interface com maior proporção de tecido ósseo formado na região do defeito e no interior do compósito do que os grupos 1 e 2. Observou- se osteoclastos nas bordas dos compósitos e fragmentos dos mesmos separados do bloco principal aos 45 e 90 dias nos três grupos. Concluiu-se que os compósitos são biocompatíveis, osteocondutores, se integram ao tecido ósseo e são degradados in vivo.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1127867 bytes, checksum: 90b2884bedb4f6f0766b728ba25b2003 (MD5) Previous issue date: 2012-04-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objective of this study was to evaluate the composite PAH-91-L ®, formed by synthetic hydroxyapatite (20%) and lignin (80%) as a promoter of integration between metal implant and bone tissue. Both hind limbs of 15 dogs were subjected to experimental surgical procedure, referred as MT (treated limb) and MC (control limb). The bone marrow was removed through an orifice of the lateral proximal tibia, which after added to the composite was replaced in the medullary canal with subsequent implantation of the intramedullary Schanz pin in the MT. In MC the marrow was triturated with subsequent placing of the pin. Clinical evaluations were performed for 15 days to assess dehiscence, lameness, pain and edema. Radiographs were taken immediately after the procedure, and in the following 8, 60 and 150 days. On the same dates, except on the surgery day, the animals were euthanized for macroscopic evaluation of the tibia and to collect material for histology. Dehiscence or local infections were not observed. There were differences between MT and MC for lameness, pain and edema indicating mild local inflammatory reaction in MT. Radiographically and macroscopically there were no osteolytic or periosteal reactions in none of the evaluated tibias. It was concluded that the compound tested is biocompatible and osteoconductive. / O objetivo do presente trabalho foi o de avaliar o compósito HAP-91-L®, formado por hidroxiapatita sintética (20%) e lignina (80%) como promotor de integração entre implante metálico e tecido ósseo. Ambos os membros pélvicos de 15 cães foram submetidos ao procedimento cirúrgico experimental, determinados MT (membro tratado) e MC (membro controle). Através de um orifício na face proximal lateral das tíbias foi retirada medula óssea, que acrescida ao compósito, foi recolocada no canal medular, com posterior implantação do pino intramedular de Schanz no MT. No MC a medula foi triturada com a posterior colocação do pino. Foram realizadas avaliações clínicas durante 15 dias para deiscência, claudicação, sensibilidade dolorosa e edema. Radiografias foram realizadas imediatamente após o procedimento, e nos 8, 60 e 150 dias subsequentes. Nas mesmas datas, exceto no dia da cirurgia, os animais foram eutanasiados para avaliação macroscópica das tíbias e coleta de material para histologia. Não foram observadas deiscência e infecção local. Ocorreu diferença entre MT e MC para claudicação, sensibilidade dolorosa e edema indicando leve reação inflamatória local no MT. Radiograficamente e macroscopicamente não foram observadas reações periosteais ou osteolíticas em nenhuma das tíbias avaliadas. Conclui-se que o compósito testado é biocompatível e osteocondutor.

Made available in DSpace on 2016-12-08T17:19:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elementos pre-textuais.pdf: 100348 bytes, checksum: eed0b75225a6274f20636cccbe0612e3 (MD5) Previous issue date: 2006-10-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In many laboratories worldwide the biocements are being studied in order to obtain new nanometric materials, with better characteristics of biocompatibility and functionality to be used in odonto-medical applications. It was observed that microporous ceramics have a better performance regarding substitution and regeneration of bone tissue, mainly the ceramics composed of calcium phosphates (Ca/P). These ceramics are being used more and more in biomedical applications because they have a mineralogical composition very similar to that of human bone apatites, and also because they have an excellent biocompatibility. The aim of this work was focused on the optimization of the powder synthesis method of bioceramics by dissolution/precipitation process and on the characterization of nanostructured calcium phosphate biocements with the molar composition of Ca/P = 1,4; 1,5; 1,6; 1,7 and 1,8. It was studied the morphology, the microstructure, physical, chemical, mechanical properties, thermal behavior and the hydration. The bioceramic powders obtained from the rotating evaporator were treated at 1300°C for 2 hours, providing the biocement. A preliminary study of hydration was performed between 5 and 25 minutes; after it was performed the hydration of cylindrical samples for a period of 1, 2, 3, 7 and 28 days. Also, it was carried out a parallel study, sintering samples with cylindrical and square shapes. Afterward, it was carried out the characterization studies. The results let certainly that the synthesis method permitted obtains of slim bioceramics powders of nostructured calcium phosphate. The thermal treatment at 1300°C/2 hours provided the biocements, compound by b-calcium phosphate and hydroxyapatite. The hydration study of 1 until 28 days , showed the modifications of phase and a microporous microstructure formed by crystalline fibers, it occurred by hydration process. It observed that the shape and size of crystalline fibers, influenced directly about the mechanical properties of the hydrated samples. And finally, it was presented a conclusion of this work and some considerations to be taken in account in the following works. / Os biocimentos vêm sendo estudados por vários centros de pesquisa com a finalidade de obter novos materiais nanométricos com características de biocompatibilidade, biofuncionalidade para serem utilizados em aplicações médicas e odontológicas. Constatou-se que as cerâmicas microporosas destacam-se em aplicações de substituição e regeneração de tecidos ósseos, principalmente as cerâmicas formadas pela composição Ca/P, os fosfatos de cálcio. Estas cerâmicas vêm tomando um espaço importante em aplicações biomédicas em razão de suas características mineralógicas semelhantes às apatitas da estrutura óssea do esqueleto humano e também por apresentarem boa biocompatibilidade. O objetivo deste trabalho concentrou-se na otimização do método de síntese dos pós biocerâmicos pelo processo via úmida e caracterização de biocimentos nanoestruturados de fosfato de cálcio nas composições Ca/P = 1,4; 1,5; 1,6; 1,7 e 1,8 molar. Os estudos de caracterização foram realizados em nível morfológico, microestrutural, físico, químico, das propriedades mecânicas, do comportamento térmico e de hidratação. O pó biocerâmico recuperado do evaporador foi tratado à temperatura de 1300°C/2h, fornecendo o biocimento. Um estudo preliminar de hidratação foi realizado em tempos de 5 a 25 minutos; posteriormente realizou-se a hidratação sob corpos de prova cilíndricos com tempos de 1, 2, 3, 7 e 28 dias. Realizou-se também um estudo paralelo, sintetizando corpos de prova na forma cilíndrica e barretes. Posteriormente, foram realizados os estudos de caracterização. Os resultados deixaram claro, que o método de síntese via úmida permitiu a obtenção de finos pós biocerâmicos de fosfato de cálcio nanoestruturados. O tratamento térmico a 1300ºC/2h forneceu os biocimentos, compostos por fosfato de cálcio-b e hidroxiapatita. O estudo de hidratação de 1 a 28 dias, colocou em evidência as modificações de fase e de uma microestrutura microporosa formada por fibras cristalinas, ocorridas pelo processo de hidratação. Observou-se que a forma e tamanho das fibras cristalinas, influenciaram diretamente sobre as propriedades mecânicas dos corpos de prova hidratados. Por fim serão apresentadas uma conclusão geral e algumas considerações a serem levadas em conta para trabalhos futuros.

O objetivo principal deste trabalho consiste na incorporação de substâncias de interesse biológico (fármacos) em filmes de látex natural (NRL). Assim, estudou-se a liberação destes, visando no futuro usar estes filmes como membrana oclusiva e como sistema de liberação controlada (SLC) de substâncias para aplicações odontológicas e ortopédicas, que envolvem a cicatrização óssea guiada. Estudamos o comportamento do SLC utilizando albumina de soro bovina (BSA) como modelo de proteína e o metronidazol (MTZ) como modelo de antibiótico. Diferentes tratamentos térmicos foram aplicados durante a confecção dos filmes a fim de gerar diferentes porosidades e com isso estudar-se a taxa de liberação destes fármacos. A taxa de liberação dos fármacos foi monitorada e quantificada utilizando o método de Lowry e o método UVVIS. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e a Microscopia de Força Atômica (AFM) determinaram a morfologia do SLC. Em outro parte deste trabalho desenvolvemos um sistema para liberação do óxido nítrico (NO) agregando-se o complexo (FeDETC) ao NRL, pois esta substância atua como spin trapp para este radical. A taxa de liberação do NO pelo sistema NRL-FeDETC-NO foi caracterizada pela Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR). A escolha destas substâncias para este estudo deve-se pelo fato que auxiliam no processo de regeneração óssea (MTZ e NO). Entretanto, a BSA foi utilizada porque possui peso molecular da mesma magnitude e é mais barata que as proteínas morfogenéticas ósseas (BMP). As BMP´s são excelentes estimuladores do crescimento ósseo. / In this work, we have tested Natural Rubber Latex (NRL) as an occlusive membrane for GBR with promising results. One possible way to accelerate bone regeneration would be to incorporate proteins bone morphogenetic protein (BMPs) in NRL. BMPs have strong bone-inductive activity. However since bone healing takes place in weeks to months, it is important that BMPs are released in these time scales. Instead of using BMPs, in our study we used BSA that has similar molecular weight however is less expensive. Moreover, we also employed the metronidazole (MTZ) and nitric oxide (NO) as drug delivery model. MTZ is a used antibiotic for treatment of infections in the skin, fabrics and bones. Initially, we study the BSA delivery system behavior and MTZ delivery system using different thermal treatments during the membranes polymerization. The thermal treatments control the size of the pores of the SLC and release rate of the BSA and MTZ. These membranes were characterized by Scanning Electron Microscopy (SEM), Atomic Force Microscopy (AFM), as well as the Lowry Method to measure the BSA release. Finally, we propose a NO delivery system made of a spin trap (iron(II)-diethyldithiocarbamate complex, FeDETC) encapsulated in a NRL matrix. NO is an early mediator of the increase in bone formation. NO delivery system presents high stability by Electron Paramagnetic Resonance. The results indicate that natural rubber latex could be used in the future as an active membrane for accelerated bone healing.

Orientador: José Mauro Granjeiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T02:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_RodrigoCardosode_D.pdf: 3052048 bytes, checksum: f37f738c374af69b889b7672904eddfc (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O objetivo do trabalho foi avaliar comparativamente a neoformação óssea e o perfil de gelatinases 2 e 9 durante o reparo de defeito crítico em crânio de ratos tratados com osso autógeno ou xenoenxerto desmineralizado. Um defeito ósseo de tamanho crítico (8 mm) foi confeccionado no crânio de 90 ratos Wistar (90 dias de vida), e preenchido com osso autógeno (grupo controle) obtido durante a confecção do defeito ou com matriz óssea bovina desmineralizada (grupo teste). Após os períodos de 7, 14, 21, 30 e 90 dias, os animais foram eutanasiados e as peças coletadas para análises histomorfométrica (em hematoxilina e eosina) e zimográfica. A análise paramétrica foi realizada utilizando análise de variância (teste de Tukey se p<0,05). O completo fechamento do defeito no grupo controle foi observado aos 90 dias com a neoformação óssea ocorrendo das bordas do defeito para o centro e da dura-máter para epiderme. No grupo teste houve atraso no processo de reparo, ossificação incompleta e substituição das partículas do biomaterial por tecido conjuntivo fibroso, após 21 dias. Nos primeiros 14 dias após a cirurgia o infiltrado inflamatório predominante era composto de células mononucleares e poucas células gigantes multinucleadas. A análise zimográfica demonstrou que a atividade MMP-2 e -9 foram significativamente maiores no grupo teste que no grupo controle (p<0,05), sendo que a atividade MMP-2 manteve-se elevada até o período de 14 dias no grupo teste. A despeito da biocompatibilidade do xenoenxerto, o biomaterial não foi capaz de promover a neoformação óssea no defeito, possivelmente devido ao intenso estímulo da atividade gelatinolítica, em particular da MMP-2, que pode ter mediado a reabsorção prematura da matriz óssea bovina desmineralizada / Abstract: The purpose of this study was to evaluate comparatively new bone formation and the profile of the gelatinases 2 and 9 during the repair of critical size defects treated with autogenous bone or demineralized xenograft. A critical defect (8mm) was created in the skull of 90 Wistar rats (90-day-old) and treated with autogenous bone (control group) obtained during the confection of the defect or demineralized bovine bone (experimental group). After at 7, 14, 21, 30 and 90 days, the animals were killed and the calvaria removed for morphometric (stained by hematoxylin-eosin) and zymografic analysis. Parametric analysis was realized with analysis of variance (Tuckey¿s test if p<0.05). The control group showed complete closure of the defects at 90 days with new bone formation occurring from the sides towards the center of the defect and from the dura-mater outwards to the epidermis. In the experimental group, there was a delay in the process of repair, incomplete ossification and nearly complete substitution of material particles by fibrotic connective tissue after 21 days. At 14 days post-operatively, the inflammatory infiltrate consisted predominantly of mononuclear cells and few multinuclear giants cells. Zymografic analysis demonstrated that the activities of MMP-2 and -9 were significantly higher in the experimental group than in the control group (p<0.05), in addition the activity of MMP-2 was increased up to 14 days in control group . Despite the biocompatibity of the xenograft, the biomaterial was not capable to promote new bone formation in the defect. This might be possibly related to the intense stimulation of the gelanolitic activity, in particular of MMP-2, which in turn may have mediated the resorption of the demineralized bovine bone / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-20T16:39:49Z No. of bitstreams: 1 brunosallessottomaior.pdf: 12704173 bytes, checksum: c4e7331f49ab0ac31f7db172d785f1d4 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-10-25T12:28:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 brunosallessottomaior.pdf: 12704173 bytes, checksum: c4e7331f49ab0ac31f7db172d785f1d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-25T12:28:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 brunosallessottomaior.pdf: 12704173 bytes, checksum: c4e7331f49ab0ac31f7db172d785f1d4 (MD5) Previous issue date: 2008-12-17 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O objetivo deste estudo foi realizar uma avaliação histológica e histomorfométrica do efeito da associação da terapia laser de baixa intensidade e o enxerto ósseo bovino orgânico Gen-ox® no reparo de defeitos ósseos de fêmures de ratos Wistar albinus nas fases iniciais do processo de reparo. Cinquenta ratos foram divididos em três grupos de 25 fêmures cada, da seguinte forma: grupo I (controle), grupo II (Gen-ox®) e grupo III (LLLT e Gen-ox®). Os animais do grupo III foram irradiados, transcutaneamente, em quatro pontos ao redor do defeito a cada 48 horas. A primeira irradiação foi imediatamente após o procedimento. Em cada ponto, foi aplicada uma dose de 5 J/cm2 (Ø~0,4; 70 mW) e a dose total por sessão foi de 20 J/cm2. Os animais foram sacrificados com overdose de anestésico geral 1, 3, 5, 7 e 15 dias após a cirurgia. Para análise histológica dos dias 1, 3 e 5, os espécimes foram incluídos em parafina, feitos cortes seriados corados pela HE e analisados em microscopia de luz. Para a análise histomorfométrica, a média do volume de osso neoformado foi estimada pela captura digital (Axiovision®) de três áreas em cada espécime nos dias 5, 7 e 15. Os valores histométricos foram analisados estatisticamente pela análise de variância (ANOVA), com p ≤ 0,05 e pelo teste post hoc LSD. Os resultados mostraram que os espécimes do grupo III apresentaram maior concentração de fibras colágenas, intensa reação no periósteo celular oposto ao defeito nos dias 3 e 5 quando comparados com os grupos I e II. Foi observada maior formação óssea no grupo III em todos os períodos experimentais, com diferença estatisticamente significativa nos dias 5 e 15 quando comparado com os grupos I e II. Dentro dos parâmetros deste estudo, foi concluído que a LLLT associada ao enxerto ósseo bovino orgânico teve um efeito positivo no reparo de defeitos ósseos de ratos. / The aim of this study was to assess histologically and histometrically the effect of the association of low level laser therapy and organic bovine bone graft Gen-ox® on the repair of bone defects on the femur of Wistar albinus rats during the early stages of bone repair. Fifty rats were divided in three groups of 25 femurs each, as follow: group I (control), group II (Gen-ox®) and group III (Gen-ox® and LLLT). The animals on group III were irradiated transcutaneously at four points around the defect every 48 h. The first irradiation was immediately after the procedure. At each point a dose of 5 J/cm2 was given (Ø~0.4, 70 mW) and the total dose per session was 20 J/cm2. The animals were killed by an overdose of general anesthetic 1, 3, 5, 7 e 15 days after surgery. For histological assessment at days 1, 3 and 5, the specimens were routinely processed by embedding in paraffin, serially cut and stained with H&E and analyzed under light microscopy. For histomorphometric assessment, the mean volume of the newly formed bone was estimated by digital capture (Axiovision®) of three areas in each specimen at days 5, 7 and 15. Statistical analyses of the mean values were performed using analysis of variance (ANOVA), with p ≤ 0,05 and post hoc LSD test. The results showed that the specimens of group III presented a higher concentration of collagen fibers, intense reaction in the periosteum cell opposite to the defect at days 3 and 5 as compared to groups I and II. It was observed an increased bone formation in group III in all experimental periods of time. These results showed statistical significance at days 5 and 15 as compared to groups I and II. Within the parameters of this study, it was concluded that LLLT associated to organic bovine bone graft had a positive effect on the repair of bone defects of rats.

Defeitos ósseos assumem importância na crescente prevalência de condições crônicas de saúde, agravando-se conforme o envelhecimento da população. O tratamento convencional baseia-se no transplante autólogo e abordagens extremamente invasivas. Uma proposta promissora é a obtenção de tecidos saudáveis em laboratórios utilizando suportes tridimensionais porosos (scaffolds) que atuarão como arcabouço para o crescimento e diferenciação de células tronco mesenquimais (CTMs) podendo ser otimizados para proporcionar adequada vascularização, uma importante característica na regeneração óssea. CTMs apresentam potencial de diferenciação, imunoregulação e angiogênese. O pico proteico F1 do soro do látex da seringueira Hevea brasiliensis apresenta importante atividade angiogênica e cicatrizante. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência de scaffolds de policaprolactona (PCL) colonizados com CTMs na osteogênese experimental in vitro e in vivo (xenotransplante), a segurança e a influência do pico F1 do látex em cultura de CTMs aplicadas no scaffold de PCL e PCL reforçado com diferentes concentrações de grafeno (PCL/grafeno) na proliferação e diferenciação osteogênica. Para isso, as CTMs foram isoladas do tecido adiposo humano (ADSCs), caracterizadas por imunofenotipagem e diferenciação in vitro. Scaffolds de PCL, produzidos por técnica de manufatura aditiva, foram avaliados quanto ao potencial de adesão/viabilidade celular (ensaio MTT), diferenciação osteogênica (vermelho de alizarina) e potencial in vivo de osteointegração e osteoindução em defeito crítico de calvária avaliados por histologia e imunoistoquímica. O pico F1 do látex, em diferentes concentrações, foi avaliado em cultura de ADSCs e fibroblastos 3T3 quanto a citotoxicidade (MTT), potencial proliferativo (timidina-tritiada), migratório (scratch assay) e indução osteogênica (fosfatase alcalina). Scaffolds de PCL foram reforçados com grafeno (PCL/grafeno), revestidos com pico F1 (adsorção), avaliados quanto a viabilidade/proliferação celular (Alamar blue) e diferenciação osteogênica (fosfatase alcalina e vermelho de alizarina). A imunofenotipagem das ADSCs demonstrou baixa percentagem para marcadores negativos, alta para os positivos e diferenciação in vitro, comprovando o sucesso do isolamento e manutenção das ADSCs. O scaffold de PCL apresentou não-toxicidade e diferenciação osteogênica induzida pelo meio de cultura. Scaffolds de PCL, pré-colonizado e não colonizado com ADSCs, foram implantados em defeito crítico de calvária de ratos. O grupo que recebeu scaffolds com ADSCs humanas proporcionou melhor formação óssea no animal, com participação direta e indireta das ADSCs neste processo. Nos ensaios in vitro com o pico F1 (cultura 2D), observou-se estímulo proliferativo para as concentrações de 0.00001% e 0.0001%, além de maior percentagem de migração celular para as concentrações de 0.001%, 0.0001% e 0.00001%, diferentes do controle. Os scaffolds de PCL/grafeno demonstraram estimulo proliferativo quando colonizados por ADSCs e este estímulo foi ainda maior em scaffolds revestidos com F1, principalmente na concentração de 0.75% de grafeno. Embora o pico F1 não tenha potencializado a diferenciação osteogênico em cultura 2D, este estímulo foi observado em scaffolds revestidos com F1 com superior atividade da fosfatase alcalina. Este trabalho demonstrou sucesso no emprego de ADSCs humanas e scaffolds in vitro e in vivo (transplante xenogênico) para regeneração óssea, além de apresentar dois promissores produtos para engenharia tecidual como os scaffolds com reforço de grafeno em baixas concentrações e o pico proteico F1 na proliferação e diferenciação celular. / The increment of life expectancy and frequency of chronic diseases in the population has led to an increasing incidence of chronic bone defects. Conventional treatment is based on autologous transplantation, which depends on extremely invasive approaches. A promising proposal is to obtain healthy tissues in laboratories using porous three-dimensional matriz (scaffolds), which enable cellular growth and differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs). Scaffolds can be optimized to provide adequate vascularization, a critical event to bone regeneration. MSCs have potential for differentiation, immunoregulation and angiogenesis. F1 natural latex protein from Hevea brasiliensis rubber tree presents important angiogenic and healing activity. The objective of this work was to investigate the influence of pre-colonized polycaprolactone (PCL) scaffolds on experimental in vitro and in vivo osteogenesis (xenotransplantation) and also the safety and influence of F1 protein on MSCs seeded on PCL and PCL reinforced with different concentrations of graphene scaffolds (PCL/graphene) in cell proliferation and osteogenic differentiation. MSCs were isolated from human adipose tissue (ADSCs), characterized by positive and negative markers and also in vitro differentiation. PCL Scaffolds, produced by an additive manufacturing technique, were evaluated for cell adhesion/viability potential (MTT assay), osteogenic differentiation (alizarin red) and in vivo xenogenic grafting potential for osteointegration and osteoinduction evaluated by histology and immunohistochemistry. F1 latex protein, prepared in different concentrations, was evaluated in contact with ADSCs and 3T3 fibroblasts culture in vitro regarding to cytotoxicity (MTT), proliferative potential (tritiated thymidine), migratory (scratch assay) and osteogenic induction (alkaline phosphatase). PCL scaffolds were reinforced with graphene (PCL/graphene scaffolds), coated with F1 protein (adsorption) and evaluated for cell viability/proliferation assay (Alamar blue) and osteogenic differentiation (alkaline phosphatase and alizarin red). ADSCs showed low percentage for negative markers, high percentage for positive markers and differentiation properties in vitro, providing enough information on the successful isolation and maintenance of human ADSCs. PCL scaffolds showed non-toxicity activity and osteogenic differentiation induced by culture medium. PCL scaffolds, pre-colonized and non-colonized with ADSCs, were implanted in a critical calvarial defect in rats. The group of rats which received scaffolds with ADSCs to treat the bone defect had improved bone formation with direct and indirect participation of ADSCs to the bone repair process. To in vitro assays with F1 (2D culture model), proliferative stimulus was observed to F1 0.00001% and 0.0001% samples, in addition to a higher percentage of cell migration to 0.001% and 0.0001%, different from control. PCL/graphene scaffolds demonstrated proliferative stimulation when colonized by ADSCs and this stimulus was even higher to F1 coated PCL/graphene scaffolds, mainly to 0.75% graphene. Although F1 have not enhanced osteogenic differentiation on 2D cell culture model, the stimulus was observed to F1 coated scaffolds with higher alkaline phosphatase activity. This work demonstrated success in the use of ADSCs and scaffolds for bone regeneration and presented two promising products to be applied in tissue engineering field, such as, scaffolds with graphene reinforcement at low concentration and F1 latex protein to improve cell proliferation and differentiation.

A crescente demanda clínica para regeneração óssea tem dirigido esforços significativos para o desenvolvimento de novos biomateriais, incluindo aqueles aplicados em terapias baseadas em engenharia de tecidos. Neste contexto, os biovidros são considerados uma boa alternativa mas as suas propriedades mecânicas têm limitado a sua aplicação. Para melhorar tais propriedades sem afetar a biocompatibilidade, um novo material vitrocerâmico bioativo do sistema P2O5-Na2O-CaO-SiO2, chamado Biosilicato® com duas fases cristalinas (BioS-2P) foi desenvolvido. No entanto, os efeitos da adição das fases cristalinas sobre o comportamento biológico do BioS-2P ainda não foram estudados. Assim, os objetivos deste estudo foram investigar a capacidade do BioS-2P em induzir, in vitro, a diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais (CTMs); a capacidade do BioS-2P em aumentar, in vitro, a atividade dos osteoblastos em fase inicial de diferenciação (OBs) e osteoblastos da linhagem UMR-106 (UMRs); e a capacidade do BioS-2P em conduzir e induzir a neoformação óssea, in vivo, associado ou não a células. Células derivadas da medula óssea obtidas de fêmures de ratos foram cultivadas em meio de crescimento para obtenção de CTMs ou em meio osteogênico para obtenção de OBs. Essas células e UMRs foram cultivadas sobre discos de BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) e plástico de cultura (Controle) e utilizadas nas avaliações in vitro. Para as avaliações in vivo, defeitos de 5 mm criados em calotas de ratos foram implantados somente com arcabouços de BioS-2P ou com arcabouços de BioS-2P associados às CTMs ou aos OBs. Os dados foram comparados por teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Student Newman-Keuls, e o nível de significância adotado foi de 5%. As CTMs foram caracterizadas por apresentarem alta porcentagem de células expressando os marcadores de superfície CD29 e CD90 e baixa porcentagem expressando CD31, CD34, CD45 e CD106. A diferenciação osteoblástica das CTMs foi confirmada pela expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica fosfatase alcalina (ALP), runt-related transcriptor factor-2 (RUNX2), sialoproteína óssea (BSP) e osteocalcina (OC). CTMs cultivadas sobre discos de BioS-2P em meio não-osteogênico apresentaram diminuição da proliferação e aumento da atividade de ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica ALP, RUNX2, osterix (OSX), proteína óssea morfogenética-4 (BMP-4), osteopontina (OPN) e OC, comprovando seu potencial osteoindutor similar ao 45S5. O BioS-2P foi capaz de aumentar a atividade de OBs e UMRs de maneira similar àqueles cultivados sobre o 45S5. OBs apresentaram diminuição na proliferação e aumento da atividade da ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica RUNX2, OSX, BMP-4, OPN e OC. A análise em larga escala da expressão de mais de 23.000 genes mostrou que o BioS-2P induziu a sobre-expressão de genes envolvidos no aumento da atividade osteoblástica e a repressão de genes envolvidos na diminuição dessa atividade, em comparação com o Controle. Ao menos em parte, esse aumento da atividade osteoblástica foi atribuído à modulação das vias de sinalização proteíno-quinases ativadas por mitógenos (MAPK) e Wnt Canônica, e à modulação da expressão de microRNAs. UMRs crescidos sobre o BioS-2P corroboraram esses achados, pela capacidade em formar matriz mineralizada e por apresentarem aumento na expressão das proteínas ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) e OPN. Arcabouços de BioS-2P (5 mm de diâmetro e 2 mm de altura com porosidade de 76 ± 5% e com tamanhos de poros variando entre 100 e 800 &micro;m) implantados em defeitos na calota de ratos estimularam a formação de tecido ósseo, que ocorreu tanto na periferia como no interior dos defeitos e em íntimo contato com o material. A morfometria por microtomografia computadorizada não evidenciou qualquer diferença entre os parâmetros volume ósseo, volume ósseo/volume total, superfície óssea, superfície/volume ósseo, número de trabéculas, separação trabecular e espessura trabecular, avaliados na 4a, 8a e 12a semanas de implantação. As CTMs e os OBs foram carreados para os arcabouços de BioS- 2P (com eficiência de 90% e 81%, respectivamente) e essas células permaneceram nos defeitos por 14 dias. A combinação de arcabouços de BioS-2P com CTMs ou OBs, implantados por 8 semanas, resultou no mesmo padrão de formação óssea daquele observado para o arcabouço sem células. No entanto, essa combinação não resultou em aumento na quantidade de osso formado. Os resultados evidenciaram a capacidade do BioS-2P em induzir a diferenciação osteoblástica de CTMs e estimular a atividade osteoblástica de OBs, o que resultaria na neoformação óssea observada in vivo. No entanto, a combinação de BioS-2P com CTMs e OBs não foi capaz de aumentar a formação óssea e induzir o reparo dos defeitos ósseos. / The increasing clinical demand for bone regeneration has driven significant efforts to develop new biomaterials including those for tissue engineeringbased therapies. In this context, bioglasses emerges as a good alternative, but their use has been limited mainly due their poor mechanical properties. To improve these mechanical properties without affecting biocompatibility, a novel bioactive glass-ceramic of the P2O5-Na2O-CaO-SiO2 system, named Biosilicate® with two cristallyne phases (BioS-2P) was developed. However, the effects of these two phases on BioS- 2P biological behavior have not yet been evaluated. Thus, the aims of this study were to investigate the BioS-2P capability of inducing in vitro mesenquimal stem cell differentiation (MSC) towards osteoblasts; the BioS-2P capability to increase in vitro activity of osteoblasts derived from rat bone marrow at early stages of differentiation (OBs) and osteoblasts from rat cell line UMR- 106 (UMRs); and the BioS-2P capability to drive and induce bone formation in vivo, associated or not with cells. Bone marrow cells harvested from rat femurs were cultured either in growth media to obtain MSCs or in osteogenic media to obtain OBs. MSCs, OBs and UMRs were cultured on discs of BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) and tissue culture polystyrene (Control). For in vivo evaluations, 5-mm rat calvarial surgical defects were filled with BioS-2P with or without MSCs or OBs. Data were compared by non-parametric Kruskal-Wallis test followed by Student Newman- Keuls test and the significance level was set at 5%. MSCs were characterized by presenting high percentage of CD29 and CD90 surface markers and low percentage of CD31, CD34, CD45 and CD106 surface markers. Osteoblastic differentiation of MSCs was detected by gene expression of bone markers alkaline phosphatase (ALP), runt-related transcritption factor 2 (RUNX2), bone sialoprotein (BSP) and osteocalcin (OC). MSCs cultured on Bios-2P discs under non-osteogenic conditions exhibited a decrease on cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers ALP, RUNX2, osterix (OSX), bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), osteopontin (OPN) and OC, confirming its osteoinductive potential similar to 45S5. Also, BioS-2P increased the OBs and UMRs activity, similar to 45S5. OBs cultured on Bios-2P discs presented a decrease in cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers RUNX2, OSX, BMP-4, OPN and OC. The large-scale analysis of over 23,000 genes showed that the BioS-2P induced overexpression of genes positively related to osteoblastic activity and repression of genes negatively related with its activity, compared with control. At least in part, the increase on OBs activity was associated to the modulation of two main signaling pathways, the mitogen activated protein kinases (MAPK) and the Canonical Wnt, and the modulation of microRNAs expression. These findings were corroborated by UMRs grown on BioS-2P, which produced mineralized matrix and exhibited increased expression of the ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) and OPN proteins, than on control. BioS-2P scaffolds (5 mm diameter and 2 mm heigh, presenting 76 ± 5% of total porosity, with poros size ranging from 100 to 800 &micro;m) implanted in calvarial defects promoted new bone formation in close contatc to BioS-2P, both on periphery and in the center of the defect. The computed microtomography morphometry showed no difference between the evaluated parameters bone volume, bone volume / total volume, bone surface, surface / bone volume, number of trabeculae, trabecular separation and trabecular thickness, measured at 4, 8 and 12 weeks. MSCs and OBs were seeded into the scaffold (with efficiency of incorporation 90% e 81%, respectively) and they remained on the defects for 14 days. After 8 weeks, the same pattern of bone formation was observed, however, the combination of BioS-2P with cells did not increase the amount of new bone. The results showed the BioS-2P ability to induce osteoblastic differentiation of MSCs and to stimulate osteoblastic activity, resulting in new bone formation in vivo. However, the combination of BioS-2P with MSCs and OBs was not able to increase bone formation and induce the repair of bone defects.

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