Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-11-10T16:36:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 606109 bytes, checksum: f6154b7b08097fa959b7a0bda71de9f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-10T16:36:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 606109 bytes, checksum: f6154b7b08097fa959b7a0bda71de9f6 (MD5) Previous issue date: 2014-10-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da Somatotropina Recombinante Bovina (rbST) sobre a sobrevivência, a ativação e o crescimento de Folículos Ovarianos Pré-antrais (FOPA) de bovinos cultivados in vitro. O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Reprodução Animal da Universidade Federal de Viçosa. Os ovários foram obtidos de fêmeas bovinas abatidas em frigorífico e transportados ao laboratório em aproximadamente uma hora após a coleta. No laboratório, a região parenquimatosa foi fragmentada, sendo um dos fragmentos de cada ovário imediatamente fixado para Histologia Clássica (HC) e Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), constituindo o controle não cultivado. Em seguida, os demais fragmentos/folículos foram cultivados in situ por um e sete dias, em estufa a 38,5oC e 5% de CO 2 , em Meio Essencial Mínimo suplementado (controle cultivado), na ausência ou presença de diferentes concentrações de rbST (10, 50, 100 e 1000ng/mL). A troca de meio foi realizada a cada dois dias. Após um e sete dias, os fragmentos ovarianos foram fixados e corados para posterior análise histológica. Nesta análise, os folículos foram classificados como normais ou degenerados, bem como primordiais ou ativados. O diâmetro folicular foi mensurado com auxílio de uma ocular micrométrica. Na avaliação ultraestrutural foi observada a integridade da membrana basal, das organelas citoplasmáticas e o grau de vacuolização citoplasmática. Após um e sete dias de cultivo in vitro, o percentual de folículos normais em fragmentos não cultivados foi superior (P<0,05) quando comparado aos folículos cultivados com o meio base e na presença das diferentes concentrações de rbST. Nenhuma das concentrações de rbST manteve as taxas de sobrevivência folicular após sete dias de cultivo. Quanto ao estádio de desenvolvimento, a ativação folicular ocorreu independente da presença da rbST no meio de cultivo. Apenas os folículos cultivados na presença de 1000ng/mL apresentaram o diâmetro dos ovócitos semelhante (P>0,05) ao do controle não cultivado, após um dia de cultivo. Após um e sete dias de cultivo, o diâmetro dos folículos cultivados na presença de 1000ng/mL de rbST foi superior (P<0,05) aos folículos cultivados apenas com o MEM + e com 10ng/mL de rbST. As características ultraestruturais demonstraram que após sete dias de cultivo em meio contendo 1000ng/mL de rbST, houve xidanos à membrana nuclear e basal, alteração nas células da granulosa, bem como aumento da vacuolização e baixa densidade de organelas no citoplasma. Conclui-se que as concentrações de 10, 50 e 100ng/mL de rbST não tem efeitos benéficos sobre a sobrevivência, a ativação e o crescimento de folículos pré-antrais de bovinos. A concentração de 1000ng/mL de rbST aumenta o diâmetro folicular, entretanto não tem efeitos benéficos sobre a sobrevivência e a ativação de folículos pré-antrais de bovinos cultivados in vitro durante um e sete dias. / The aim of this study was to evaluate the effect of Recombinant Bovine Somatotropin (rbST) on survival, activation and growth of Preantral Ovarian Follicles of cattle grown in vitro. The experiment was conducted at the Laboratory of Animal Reproduction, Federal University of Viçosa. Ovaries were obtained from cows slaughtered in a slaughterhouse and transported to the laboratory in approximately one hour after collection. In the laboratory, the parenchymal region was fragmented, being one of the fragments of each ovary immediately fixed for Histology Classic and Transmission Electron Microscopy, constituting the control. Then, the remaining fragments / follicles were cultured in situ for one and seven days in an incubator at 38.5°C and 5% CO 2 in Minimal Essential Medium supplemented (cultured control) in the absence or presence of different concentrations of rbST (10, 50, 100 and 1000ng/ml). The medium change was performed every two days. After one and seven days, ovarian fragments were fixed and stained for subsequent histological analysis. In this analysis, the follicles were classified as normal or degenerated, as well as primary or activated. Follicular diameter was measured with the aid of an ocular micrometer. In the ultrastructural evaluation, were analysed the integrity of the basement membrane, the cytoplasmic organelles and the degree of vacuolation. After one and seven days of in vitro culture, the percentage of normal follicles in not cultivated fragments was higher (P<0.05) when compared to follicles cultured with basal medium and in the presence of different concentrations of rbST. Neither concentration of rbST kept rates follicle viability after seven days. In relation the development, follicular activation occurred independent of the presence of rbST in the culture medium. Only follicles cultured in the presence of 1000ng/ml showed the diameter of oocytes similar (P>0.05) to the not cultived control, after one day. After one and seven days of cultivation, the diameter of follicles cultured in the presence of 1000ng/ml rbST was higher (P<0.05) to the found in only follicles cultured with MEM and 10ng/ml of rbST, respectively. Results showed that after seven days of culture in medium containing 1000 ng/ml rbST, there was damage to nuclear and basement membrane changes in granulosa cells as well as increased vacuolation and low density of organelles in the cytoplasm. It was concluded that concentrations of 10, 50 and 100 xiiing/ml rbST has no beneficial effect on survival, growth and activation of preantral follicles in cattle. The concentration of 1000ng/mL rbST increases follicular diameter, but has no beneficial effects on the survival and activation of preantral follicles in cultured bovine in vitro for one and seven days.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-11-12T17:12:40Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1291733 bytes, checksum: e4cfacdbab2bf88dacbcaac2e6ee8e4a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-12T17:12:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1291733 bytes, checksum: e4cfacdbab2bf88dacbcaac2e6ee8e4a (MD5) Previous issue date: 2018-07-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) pertence a ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae e gênero Varicellovirus. É o agente causador da Rinotraqueíte Infecciosa Bovina (IBR). Apresenta dominância cosmopolita e alta disseminação em rebanhos bovinos de todo o mundo, acarretando prejuízos econômicos associados aos problemas produtivos e reprodutivos. O objetivo desta pesquisa foi estudar a interação do BoHV-1 com o útero, ovários e tubas uterinas, além de investigar a presença e a capacidade de penetração do BoHV-1 em complexos cumulus-ovócitos de vacas não vacinadas contra o BoHV-1, por meio da imunomarcação viral utilizando a microscopia confocal de varredura a laser. Coletou-se amostras de sangue e os órgãos genitais de 75 vacas abatidas em frigorífico e avaliou-se a imunomarcação viral nos tecidos uterino, tubárico e ovariano. Total de 719 COCs foram divididos em dois grupos: COCs derivados de vacas soropositivas e de vacas soronegativas e processados para a microscopia confocal de varredura a laser. Além disso, este estudo investigou a capacidade de penetração do BoHV-1 nos ovócitos de vacas soronegativas. Para tal, os ovócitos foram divididos em dois grupos: Grupo I: COCs (n=312) e ovócitos desnudados (n=296) infectados experimentalmente com BoHV-1 e incubados durante uma hora a 38,5°C e 5% de CO 2 . O controle negativo formado por COCs (273) e ovócitos desnudados (n=310) foram submetidos ao mesmo protocolo, exceto a exposição ao BoHV-1 que não foi realizada. Grupo II: COCs (n=425) e ovócitos desnudados (n=405) foram submetidos ao mesmo protocolo de co-incubação com o BoHV-1, porém durante 24 horas. O controle negativo deste grupo foi formado por 398 COCs e 425 ovócitos desnudados submetidos ao mesmo protocolo exceto a exposição ao BoHV-1. Os resultados gerados nesta tese apresentam um grande significado para a área de reprodução animal. Os achados sugerem novos esclarecimentos sobre a infecção do BoHV-1 nos tecidos reprodutivos. As partículas virais do BoHV-1 foram detectadas no útero de 100% das vacas soropositivas (P<0,01). As tubas uterinas apresentaram o BoHV-1 em 73,2% e os ovários em 58,5% (P>0,05). Não foi observada a presença do vírus em nenhum órgão genital dos 34 animais soronegativos. Nenhum COC (n=276) proveniente de vacas soronegativas apresentou o vírus. No entanto, foi evidenciada a presença do BoHV-1 no citoplasma das células do cumulus em alta porcentagem de COCs (n=158) dos 443 COCs aspirados de vacas soropositivas. Em relação aos ovócitos com e sem a presença das células do cumulus, co- incubados com o BoHV-1, o vírus foi evidenciado no seu interior após 24 horas. Conclui- se que, aparentemente, este estudo é o primeiro a relatar a detecção de BoHV-1 no útero em 100% das vacas soropositivas, o que sugere que este órgão atua como uma fonte de infecção fetal e esteja implicado em desempenhar um papel no abortamento. A detecção do BoHV-1 nas células do cumulus de vacas soropositivas, sugere que vacas infectadas naturalmente e assintomáticas podem apresentar os COCs infectados pelo vírus. Ademais, este estudo é o primeiro a detectar o BoHV-1 no interior de ovócitos bovinos apresentando a zona pelúcida intacta. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) belongs to the Herpesvirales order, Herpesviridae family, Alphaherpesvirinae subfamily and Varicellovirus genus. It is the causative agent of Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR). Its cosmopolitan distribution and high dissemination in cattle herds around the world lead to economic losses related to productive and reproductive disorders. This research aimed to study the interaction of BoHV-1 in the uterus, oviducts, and ovarian tissues, also to investigate the ability of virus penetration in cumulus-oocyte complexes (COCs) from cows unvaccinated against BoHV-1 by immunofluorescence using confocal laser scanning microscopy. Blood samples and genital organs were collected from 75 cows to assess viral immunolabeling in the uterus, oviducts, and ovarian tissues. A total of 719 COCs were divided into two groups: COCs derivate from seropositive cows and those from seronegative cows. Then, the samples were processed for confocal microscopy analysis. Moreover, this study investigated the penetration capacity of BoHV-1 in oocytes from seronegative cows. Subsequently, oocytes were divided into two groups: Group I: COCs and denuded oocytes experimentally infected with BoHV-1 and incubated for 1 h at 38.5 °C and 5% CO 2 . The negative control group were formed by COCs (n = 273) and denuded oocytes (n = 310), which were subjected to the same protocol except for exposure to BoHV-1. Group II: COCs (n = 425) and denuded oocytes (n = 405) were subjected to the same co- incubation protocol with BoHV-1, but for 24 h. The negative control of this group consisted of 398 COCs and 425 denuded oocytes that were subjected to the same protocol except exposure to BoHV-1. The results generated in this thesis have a great significance for the field of animal reproduction. The findings suggest new insights regarding the BoHV-1 infection in reproductive tissue. The virus was detected in the uterus in 100% of seropositive cows (P<0.01), 73.2% of oviduct samples and 58.5% of ovarian tissue samples (P>0.05). No genital organ samples from the 34 seronegative animals had virus presence. None of 276 COCs from the seronegative cows presented BoHV-1. However, BoHV-1 was present in the cytoplasm of cumulus cells from 158 out of 443 COCs recovered from seropositive cows. The virus was detected after 24h co-incubation with the BoHV-1within oocytes (with or without the presence of cumulus cells). In conclusion, the virus detection of 100% in the uterine samples suggests this organ as a fetal infection source to be implicated in playing a role in abortion. The detection of BoHV-1 in the COCs of seropositive cows suggests that COCs from naturally infected and asymptomatic cows may be infected with BoHV-1. Moreover, this study appears to be the first to detect BoHV-1 within COCs and denuded oocytes exhibiting intact ZP, co-incubated with the virus for 24 h.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-11-13T12:15:03Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1654335 bytes, checksum: bce0b05d7832cce3f6841e6c11b57384 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-13T12:15:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1654335 bytes, checksum: bce0b05d7832cce3f6841e6c11b57384 (MD5) Previous issue date: 2018-07-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) é de fácil disseminação, difícil controle e está amplamente disseminado nos rebanhos bovinos no mundo. Essa infecção viral é responsável por prejuízos à pecuária principalmente quanto aos aspectos reprodutivos. Estudos prévios envolvendo infecção experimental com o BoHV-1 em um sistema de produção in vitro de embriões reportou que a presença do vírus afetou o desenvolvimento embrionário. Neste trabalho, foi avaliada a interferência do BoHV-1 sobre a maturação in vitro de complexos cumulus-ovócito (COCs) e ovócitos desnudados com células do cumulus em suspensão (DOs). Foram coletados sangue e os ovários de fêmeas bovinas sabidamente não vacinadas contra o BoHV-1. Após o teste de soroneutralização, os animais soropositivos foram classificados de acordo com a sua titulação de anticorpos. Os ovócitos recuperados após aspiração folicular foram divididos em COCs e DOs e avaliados através da sua capacidade de maturação nuclear associado a detecção viral pela microscopia confocal de varredura a laser. Dois experimentos foram realizados: (I) maturação após infecção in vitro de COCs e DOs de animais soronegativos; (II) maturação in vitro de COCs e DOs de animais soropositivos. No experimento I, diferença (P<0,01) foi observada entre as taxas de maturação do grupo COCs controle (78,2%) e os grupos infectados dos COCs (43,6%). No experimento II verificou-se diferença (P<0,01) na taxa de maturação entre os animais de titulação de anticorpos ≥ 16 (56,9%) e o grupo controle (79,4%). Os ensaios de imunofluorescência permitiram a identificação do BoHV-1 nos COCs e DOs. Diante disso, conclui-se que o BoHV-1 foi capaz de afetar o processo de maturação in vitro tanto nas condições de infecção in vitro e em condições naturais de infecção. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) disseminates easily, is difficult to control, and is widely spread in cattle herds worldwide. BoHV-1 causes a broad range of losses to the cattle industry, mainly concerning reproduction. Previous studies involving experimental infection of BoHV-1 in an in vitro embryo production system have reported impairment of embryonic development by BoHV-1. In this study, we evaluated the interference of BoHV-1 in the in vitro maturation system of cumulus- oocyte complexes (COCs) and denuded oocytes (DOs) cultured with a cumulus cell suspension. Blood samples and ovaries were collected from slaughterhouse cows unvaccinated against BoHV-1. Using virus neutralization assays, the seropositive animals were classified according to their antibody titers. The oocytes were recovered by follicular aspiration and divided into two groups, COCs and DOs, which were evaluated for their nuclear maturation capacity using immunofluorescence assays by laser scanning confocal microscopy. Two experiments were carried out: (I) in vitro maturation of COCs and DOs after artificial infection of seronegative animals and (II) in vitro maturation of COCs and DOs of seropositive animals. In experiment I, a difference (P <0.01) was observed between the maturation rates of the control group COCs (78.2%) and the infected COCs (43.6%). In experiment II, there was a difference (P <0.01) in the maturation rate between animals with antibody titers ≥ 16 (56.9%) and the control group (79.4%). Immunofluorescence assays identified BoHV-1 in the COCs and DOs. Therefore, it was concluded that BoHV-1 affects the in vitro maturation process in both in vitro and natural infections.

Orientador: José Luiz Moraes Vasconcelos / Resumo: O objetivo dessa tese foi avaliar o desempenho reprodutivo de novilhas Bos indicus (BI) e Bos taurus x Bos indicus (CR) submetidas a protocolos de sincronização da ovulação. No Capitulo 2, novilhas BI e CR púberes e pré-púberes foram submetidas a estratégia reprodutiva proposta por Rodrigues et al. (2014) e um grupo de novilhas púberes foram sincronizadas com o protocolo de IATF padrão. No Capítulo 3, novilhas BI e CR foram submetidas a estratégia reprodutiva aos 12 meses de idade. No Capítulo 4, foi avaliado o efeito da concentração circulante de P4 no Dia 9 do protocolo de IATF e tratamento com eCG em novilhas BI e CR. No experimento do Capítulo 2 uma maior porcentagem de novilhas BI estavam pré-púberes no início do experimento comparadas as novilhas do grupo CR. A taxa de indução não foi diferente entre novilhas BI e novilhas CR. A raça interferiu na prenhez à IATF na Fazenda 1, mas não interferiu na Fazenda 2. Novilhas que não responderam ao protocolo de indução tiveram menor taxa de prenhez à IATF em relação aos demais grupos experimentais. No experimento do Capítulo 3, a presença de CL no D0 não diferiu entre os grupos genéticos. Animais mais pesados apresentaram maior presença de CL, independentemente de raça. Houve efeito de CL no D0 na taxa de prenhez à IATF. Não foi detectada interação entre presença de CL e raça na prenhez, sendo que novilhas BI tiveram menor P/IA do que as novilhas CR. Houve interação entre peso e CL no D0 na P/IA, sendo que em novilhas com CL no... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Not available / Doutor

Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Coorientador: Elizabeth Moreira dos Santos Schmidt / Banca: Fabiana Ferreira de Souza / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Banca: Roberto Sartori Filho / Resumo: O estresse térmico reduz a eficiência reprodutiva em vacas leiteiras. O fluido folicular (FF) contém proteínas envolvidas na atividade e diferenciação celular do folículo e maturação oocitária. A caracterização das proteínas do FF pode contribuir para melhor compreensão dos mecanismos fisiológicos envolvidos na foliculogênese e comprometimento da função reprodutiva durante o estresse térmico. No primeiro experimento avaliou-se o perfil proteomico do FF de vacas em diferentes estágios do desenvolvimento folicular (pré-desvio, desvio, dominância e pré-ovulatório) e foi testada a associação das proteínas com as concentrações intrafoliculares de hormônios esteroides. Foram encontradas 22 proteínas diferentemente expressas (P < 0.05) entre as categorias foliculares, sendo o desvio um momento-chave na determinação da expressão das proteínas. Além disso, três proteínas foram correlacionadas (P < 0.05) com as concentrações intrafoliculares de estradiol, enquanto dezesseis foram correlacionadas (P < 0.05) com as concentrações locais de progesterona. A análise de vias canônicas identificou a ativação/inibição das vias associadas com a resposta de fase aguda, sistema de coagulação, sistema complemento, receptor X do fígado e retinóide e produção de óxido nítrico e espécies reativas de oxigênio. No segundo experimento, testou-se o efeito do estresse térmico sobre a expressão das proteínas do FF de vacas. Na validação do modelo experimental, foi observado que a exposição contínua ao estre... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Heat stress reduces the reproductive efficiency in dairy cows. Follicular fluid (FF) contains proteins involved in the follicle activity and cell differentiation and oocyte maturation. The characterization of the proteome of FF may contribute to a better understanding of the physiological mechanisms involved in folliculogenesis and impairment of reproductive function during heat stress. In the first experiment, the FF proteomic profile of cows at different stages of follicle development (predeviation, deviation, dominance and pre-ovulatory) was evaluated and the association of proteins with intrafollicular concentrations of steroid hormones was tested. Twenty-two differentially expressed proteins (P < 0.05) were found among the follicular categories, with deviation being a critical time-point in the determination of protein expression. In addition, three proteins were correlated (P < 0.05) with the intrafollicular concentrations of estradiol, while sixteen were correlated (P < 0.05) with the local concentrations of progesterone. The canonical pathway analysis identified the activation/inhibition of the pathways associated with acute phase response, coagulation system, complement system, liver X receptor and retinoid, and production of nitric oxide and reactive oxygen species. In the second experiment, the effect of heat stress on the expression of cow FF proteins was tested. In the experimental model validation, we observed that the continuous exposure to heat stress affected thermoregulatory mechanisms, 4 leading to a marked increase in respiratory rate, followed by an increase in rectal temperature. The influence of environmental variables from the previous day on physiological parameters and dry matter intake were more important than the immediate effect and ambient temperature represented the most determinant factor for heat exchange. Although prolonged exposures to heat stress... (Complete abstract electronic access below) / Doutor