Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:45:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 320894.pdf: 3755694 bytes, checksum: 9dadb202db675917920a086bae9c2a8a (MD5) Previous issue date: 2013 / Uma série de compostos contendo as 4,5-dihidro-3(2H)-piridazinonas substituídas nas posições 4 e 6 do anel heterociclo foram preparadas com rendimentos satisfatórios.A metodologia para a construção do anel dihidropiridazinônico foi baseada no método de Tóth e Kover, no qual empregou-se os derivados do ácido de Meldrum (obtidos com bons rendimentos) e numa sequência de três etapas sintéticas obteve-se o sistema heterocíclico com sucesso. Com este sistema em mãos, foram incorporados diferentes grupos na posição 4 do anel piridazinônico culminando na formação dos espaçadores fenilazafenilacetonitrila, fenilazafenilacetato de metila, N-fenilsulfonamida e sua porção ácida fenilazafenilacético. Buscando melhorar as condições reacionais destas N-alquilações, a base e o solvente foram trocados resultando num aumento do rendimento dos produtos desejados além de uma diminuição do tempo de reação.Adicionalmente, o sistema piridazinônico foi obtido a partir da oxidação dos derivados da 4,5-dihidro-3(2H)-piridazinona. Todos os compostos sintetizados foram caracterizados por espectroscopia de Infravermelho e RMN de 1H e 13C. <br> / Abstract : A series of 4,5-dihydro-3(2H)-pyridazinones substituted in 4 and 6 positions were prepared in satisfactory yields. The methodology for the preparation of 4,5-dihydro-3(2H)-pyridazinones was based on Tóth and Kover?s approach, which employed Meldrum?s acid derivatives and in a three step sequence the heterocyclic system was successfully obtained.With these compounds available, it was incorporated several different groups at the 4-position of piridazinonic ring affording the groups phenylazaphenylacetonitrile, phenylazaphenyl methyl acetate, N-phenylsulfonamide and phenylazaphenylacetic.In order to find the best reaction conditions for N-alkylations, it was investigated the influence of base and solvent, and a significant increase in the yields of desired compounds and in lower reaction times.In addition, the piridazinonic system was obtained by the oxidation of 4,5-dihydro-3(2H)-pyridazinones derivatives with cupric chloride. All the compounds synthesized were characterized by infrared and 1H and 13C NMR.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T08:45:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 294650.pdf: 4219542 bytes, checksum: f2bfd3e0593f35d82be595d1d83f81be (MD5) / Embora pouco prevalente entre a população, a neuralgia do trigêmeo é uma das condições mais dolorosas. Ela é caracterizada por ataques paroxísticos e recorrentes de dor lancinante e súbita, do tipo choque, limitada a um ou mais ramos do nervo trigêmeo. Atualmente, a droga de primeira escolha para o tratamento da neuralgia trigeminal é a carbamazepina, seguida pela oxcarbazepina e gabapentina. Neste trabalho, padronizamos com sucesso o modelo de neuralgia do trigêmeo induzida pela constrição do nervo infraorbital (CNIO) em camundongos Swiss e C57Bl/6. A participação dos receptores B1 e B2 para cininas foi avaliada frente à hiperalgesia orofacial térmica e mecânica desenvolvida em ambas as linhagens. O tratamento pela via intraperitoneal (i.p.) dos animais no 5o dia com os antagonistas para os receptores B1 (DALBK, 0,1-3 µmol/kg) ou B2 HOE-140 (0,01-1 µmol/kg), foi eficaz em reduzir significativamente a hiperalgesia térmica e mecânica. Quando testados na fase tardia da hiperalgesia térmica ao frio (25o dia), DALBK (1 µmol/kg, i.p.) ou HOE-140 (0,1-1 µmol/kg, i.p.) mostraram-se novamente efetivos em reduzir de maneira significativa a resposta hiperalgésica. Os mesmos tratamentos não foram eficazes na fase tardia da hiperalgesia térmica ao calor (17º dia). Já na fase tardia da hiperalgesia mecânica (36o dia), somente a DALBK (0,1-1 µmol/kg, i.p.) mostrou-se efetiva em reduzir significativamente a resposta. Animais C57Bl/6 que possuem deleção gênica para um dos ou ambos os receptores B1 e B2 para cininas não desenvolveram hiperalgesia térmica ou mecânica em resposta à CNIO. Neste trabalho demonstramos também que a hiperalgesia orofacial ao calor induzida pela dinorfina A administrada pela via subaracnóide (1-17, 15 nmol/sítio) foi reduzida pelo pós tratamento com DALBK (1 e 3 µmol/kg, i.p.), mas não com HOE-140. Corroborando esses resultados, o tratamento dos animais com o antissoro anti-dinorfina A reduziu significativamente a hiperalgesia térmica ao calor induzida pela CNIO por até 2 horas após a sua administração. Em conjunto, estes resultados demonstram a participação dos receptores B1 e B2 para cininas nas alterações da reatividade nociceptiva ocorridas após a CNIO, e sugerem que a dinorfina A possa atuar preferencialmente via receptor B1 para cininas, contribuindo dessa forma para a manutenção da neuralgia do trigêmeo. / Despite its low prevalence among the population, trigeminal neuralgia constitutes one of the most painful conditions known. It is characterized by recurrent paroxysmal attacks of sudden, excruciating shock-like pain, usually limited to one or more branches of the trigeminal nerve. Currently, the drug of first choice for treatment of trigeminal neuralgia is carbamazepine, followed by oxcarbazepine and gabapentin. The current study standardizes the model of trigeminal neuralgia induced by constriction of the infraorbital nerve (CION) in Swiss and C57Bl/6 mice. The possible participation of mechanisms operated by kinin B1 and B2 receptors in the maintenance of thermal and mechanical hyperalgesia induced by CNIO in both species was also assessed. Treatment of the animals on the fifth day after CION surgery with (Des- Arg9,Leu8)-Bradykinin (DALBK, B1 receptor antagonist, 0.1-3 µmol/kg, i.p.) or HOE-140 (B2 receptor antagonist, 0.01-1 .mol/kg, i.p) effectively reduced thermal (heat and cold) and mechanical hyperalgesia. When the antagonists were tested against late phase hyperalgesia to orofacial stimulation with cold (25th day), DALBK (1 µmol/kg, i.p.) and HOE-140 (0.1-1 µmol/kg, i.p.) were also effective in reducing these hyperalgesic responses, but late-phase mechanical hyperalgesia (36th day) was transiently reduced by DALBK (0.1-1 µmol/kg, i.p.), but unaffected by HOE-140. The same treatment was not effective in the end phase heat (17º day). Knockout mice for kinin B1, B2 or both receptors did not develop heat or mechanical hyperalgesia in response to CION. The study also demonstrated that subaracnoid dynorphin A (1-17) administration (15 nmol) induces orofacial heat hyperalgesia which is sensitive to attenuation by post-treatment with DALBK (1 and 3 µmol/kg, i.p.). Corroborating these results, treatment of the animals with antiserum anti-dynorphin A reduced CION-induced heat hyperalgesia for up to two hours. Taken together, these results demonstrate the participation of B1 and B2 receptors for kinin in orofacial sensory nociceptive changes induced by CION and that the dynorphin A, overexpressed in neuronal injury, can stimulate kinin receptors for the maintenance of trigeminal neuralgia.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-21T11:54:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 205352.pdf: 611236 bytes, checksum: 755a196b2b760ba77d2dc06af0f7c8be (MD5) / Envolvimento dos receptores B1 e B2 das cininas no extravasamento plasmático (EP) induzido pela bradicinina (BK) e desArg9-bradicinina (DABK) na dura-máter (DM) de ratos. Os resultados mostraram que a BK e DABK aumentam o EP na DM de ratos, mas não aumentaram no cerebelo e no córtex. Esta verificação foi possível graças à utilização de antagonistas seletivos de receptores B1 e B2, [Leu]8desArg9-BK e HOE 140, respectivamente. A administração de LPS provoca o aumento no EP na DM. Entretanto, não foi observada indução de receptores B1 nos animais pré-tratados com esta toxina e injetados com o agonista B1, sugerindo que o efeito da DABK foi independente do pré-tratamento com LPS. Além disso, a administração da BK pode mediar a liberação de SP, através da utilização do antagonista seletivo de receptores NK1, o RP 67580. Sugerindo que a BK pode aumentar o EP na DM tanto pela ativação direta dos receptores B2, quanto pela estimulação de neurônios sensoriais que liberam SP. O pré-tratamento L-NAME, não alterou o EP induzido pelos agonistas de receptores B1 e B2 na DM de ratos. Mostrando que neste estudo do EP na DM parece não estar havendo participação direta do NO. O CAP induziu um aumento no EP na DM de ratos, porém em animais pré-tratados com CAP e que em seguida foi administrada a BK, não foi verificada alteração significante no EP na DM, quando comparado ao grupo tratado com BK. Seria necessária a realização de mais estudos, para verificação de uma possível estimulação da liberação de SP, por parte da DABK, como ficou demonstrado no grupo tratado com BK e inibido com o RP 67580. Além disso, verificou-se a necessidade de mais grupos experimentais com animais pré-tratados com LPS em associação a diferentes doses de DABK, para verificar um possível aumento na expressão de receptores B1, por parte do LPS. E em experimentos futuros seria interessante a realização de estudos de biologia molecular para caracterização da expressão dos receptores B1 na dura-máter de ratos, através da utilização de técnicas como o PCR.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-19T06:09:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T22:59:41Z : No. of bitstreams: 1 183472.pdf: 3605301 bytes, checksum: ffc5710572e3d382f1897738c15fc260 (MD5) / Estudo do efeito do tratamento local com [citocinas pró-inflamatórias] sobre as respostas mediadas pelos [receptores B1 e B2] para as [cininas] na [pata de rato]. O tratamento com as citocinas [IL-1b] ou [TNFa] foi capaz de induzir um aumento dose-dependente e marcante da [resposta edematogênica] mediada pelos receptores B1, acompanhado de um aumento na [expressão] destes receptores, sem interferir com as respostas mediadas pelos receptores B2. O aumento funcional dos receptores B1 na pata de rato, induzido pela IL-1b e pelo o TNFa, parece depender da produção de metabólitos do [ácido araquidônico], da produção secundária de outras citocinas pró-inflamatórias, da ativação de algumas [quinases], além da estimulação do fator de transcrição nuclear [NF-kB] e de [síntese protéica]. Além disso, o aumento das respostas mediadas pelos receptores B1, na pata de ratos pré-tratados com IL-1b, parece envolver a migração de [neutrófilos], dependente da produção de [PAF] e de [moléculas de adesão]. Estes dados contribuem para esclarecer alguns mecanismos envolvidos na interação entre o sistema de cininas e citocinas durante o processo inflamatório.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-19T09:13:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T23:13:54Z : No. of bitstreams: 1 183509.pdf: 2419471 bytes, checksum: 04c50bd7c80ed8a54981d913ba84e96d (MD5) / O presente estudo avaliou, através de técnicas moleculares e farmacológicas, o efeito dos glicocorticóides endógenos sobre a expressão do receptor B1 em ratos. Também foram investigados alguns dos mecanismo envolvidos na indução do receptor B1 para as cininas na aorta isolada de coelhos. Foram obtidas evidências moleculares e farmacológicas adicionais indicando que a expressão do receptor B1 para as cininas pode ser regulada pelos glicocorticóides endógenos através de mecanismo dependente da ativação da via do NF-kB. Além disso, a indução tempo-dependente da contração mediada pela des-Arg9-BK na aorta de colho envolve a ativação da proteína quinase C, da tirosina quinase, com a participação da ciclooxigenase-2 e também da via do NF-kB. Os resultados obtidos com o presente estudo sugerem uma importante participação dos receptores B1 para as cininas mediando respostas inflamatórias. Além disso, sugerem ainda que pelo menos em parte das ações antiinflamatórias dos glicocorticóides pode estar associada com a regulação dos receptores B1 para as cininas.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Laboratório de Biofísica, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-02-13T19:20:31Z No. of bitstreams: 1 2014_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 4612555 bytes, checksum: 6dee7baa09b2069ce2fb0ef9d358bcec (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-03-12T20:41:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 4612555 bytes, checksum: 6dee7baa09b2069ce2fb0ef9d358bcec (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T20:41:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 4612555 bytes, checksum: 6dee7baa09b2069ce2fb0ef9d358bcec (MD5) / A bradicinina (Bk) é um nonapeptídeo vasodilatador que apresenta regiões com aminoácidos susceptíveis à ação de proteases. Quando metabolizada, a Bk não promove vasodilatação, devido à meia-vida reduzida. O objetivo deste trabalho é analisar a atividade da Bk e de dois análogos na presença de um inibidor de proteases denominado black-eyed pea trypsin/chymotrypsin (BTCI). Sistemas contendo BTCI e Bk e seus análogos foram caracterizados estruturalmente na forma de complexos moleculares, por métodos espectroscópicos. As atividades dessas moléculas nas formas livre e de complexos, bem como o efeito na contratilidade em músculo liso de cobaia, foram avaliadas em ensaios colorimétricos in vitro e ex vivo. Além disso, o efeito do BTCI na potencialização da ação hipotensora da Bk e dos seus análogos foi investigado por meio de ensaios in vivo em ratos normotensos. As dimensões moleculares do BTCI na presença dos peptídeos, monitoradas por espalhamento de luz dinâmico, indicou formação de complexos entre estas moléculas. Esse processo foi associado a alterações conformacionais na estrutura do BTCI, monitoradas por espectroscopia de dicroísmo circular distante do UV. Adicionalmente, ensaios enzimáticos mostraram que o BTCI mantém sua atividade inibitória contra proteases na presença dos peptídeos e impede a degradação de Bk e seus análogos por estas proteases. Os ensaios em íleo de cobaia demonstraram que Bk e seus análogos apresentam atividade na contração do músculo liso, que é mantida quando adicionadoso BTCI e as proteases. Quando o BTCI foi testado in vivo em ratos Wistar, associado à Bk e aos análogos, diminuição da resistência vascular e, consequentemente, da hipotensão, foram observadas, além da vasodilatação renal e aórtica, principalmente quando complexado com a Bk e a Bk2. O presente estudo mostrou a inibição de proteases pelo BTCI na presença de Bk e seus análogos e indica este inibidor como uma ferramenta promissora para o aumento dos efeitos da Bk que visem o controle da hipertensão. Além disso, foi mostrado que os análogos de Bk podem ser utilizados como estratégia para o desenvolvimento de um sistema hipotensor de ação prolongada. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bradykinin (Bk) is a vasodilator nonapeptide presenting amino acid residues susceptible to proteases cleavage. Bk does not promote vasodilation when metabolized due its reduced half-life in this condition. The aim of this study was to analyze the activity of Bk and two analogs in the presence of the protease inhibitor named black-eyed pea trypsin proteases/chymotrypsin, BTCI. The BTCI, Bk and its analogues were characterized by spectroscopic methods in free and complexes forms. Ex vivo assays using guinea pig ileum were carried out to monitor the activity of the molecules in solution. Furthermore, the potentiation of the hypotensive action of Bk and its analogues, in the presence of BTCI, was investigated in normotensive rats. The hydrodynamic diameters of BTCI in the presence of peptides,monitored by dynamic light scattering, indicated the formation of complexes between these molecules. It was associated with conformational changes of BTCI,indicated by far- UV circular dichroismspectroscopy. Additionally, enzymatic assays showed that BTCI retains its inhibitory activity against proteases in the presence of these peptides, inhibiting their proteolytic degradation. Tests on guinea pig ileum demonstrated that BK and its analogues exhibit activity on the smooth muscle in the absence and presence of BTCI. When BTCI was tested in vivo on Wistar rats, in the presence of Bk and its analogues, induced a decrease in vascular resistance and, consequently, hypotension, as well as renal and aortic vasodilation, mainly when in complex with Bk and Bk2. This study indicates BTCI as a promising tool for increasing the effects of Bk aiming hypertension control. Furthermore, it shows that BK analogues are good strategies for the development of a system for prolonged hypotensive action.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-07-16T21:07:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 316601.pdf: 4663313 bytes, checksum: f2920336b77d7b730284c826aaed9c0e (MD5) / Uma série de 4,5-di-hidro-3(2H)-piridazinonas dissubstituídas nas posições 4 e 6 do heterociclo foi preparada com bons rendimentos. A metodologia utilizada na síntese do anel di-hidropiridazinônico foi a de Tóth, na qual empregou-se derivados do ácido de Meldrum e numa sequência de quatro etapas reacionais obteve-se o sistema heterocíclico com sucesso. Os derivados monoalquilados do ácido de Meldrum foram obtidos exclusivamente com bons rendimentos, assim como os derivados dialquilados. Uma modificação na metodologia de síntese dos potenciais antagonistas do receptor B1 foi feita, partindo-se do fenol 9a para introdução de sistemas como fenilacético e p-toluenossulfonila. Diferentes grupos ácidos foram incorporados na posição 4 da estrutura do heterociclo culminando em di-hidropiridazinonas contendo a porção fenoxifenilacético e fenoxifenilmetiltetrazol. A obtenção das piridazinonas dissubstituídas foi alcançada a partir da oxidação dos derivados da 4,5-di-hidro-3(2H)-piridazinona. Os intermediários bem como os produtos finais foram devidamente caracterizados por espectrometria de IV, RMN de 1H e 13C.<br> / Abstract : A series of 4,6-dissubstituted-4,5-dihydro-3(2H)-pyridazinones was prepared in good yields. The methodology employed on the synthesis of dihydropyridazinone ring was Tòth´s methodology, which made use of Meldrum´s acid derivates and in a four-step reaction sequence the heterocyclic system was sucessfully obtained. The monoalkylated derivates of Meldrum´s acid were obtained exclusively in good yields as well as the dialkylated derivates. A modification of the method of potencial receptor B1 antagonists synthesis was made, starting from phenol 9a to introduction of systems such as phenylacetic and p-toluenesulphonyl. Different acids groups were incorporated at position 4 of the heterocycle structure culminating in dihydropyridazinones containing the phenoxylphenylacetic group and the phenoxylphenyl group containing tetrazole. The obtation of dissubstituted pyridazinones derivates was achieved by oxidation reaction of 4,5-dihydro-3(2H)-pyridazinones derivates. The intermediates compounds as well as the final products were characterized by IR, 1H and 13C NMR spectroscometry.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T17:16:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 199269.pdf: 7333413 bytes, checksum: 50c4d6191f94f77717439a86aa220a44 (MD5)

Cardiovascular diseases are responsible for almost one third of all global deaths yearly, and therefore are largely studied. Cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) have emerged as an exciting technology for cardiac disease modelling and personalised therapy. Nevertheless, issues concerning functional and molecular maturation are still faced. In addition to this, differentiation protocols generally yield a heterogeneous mixed population comprised of nodal, atrial and ventricular-like subtypes, being unsuitable for therapeutic purposes. Bradykinin (BK) is a vasoactive peptide which exerts important physiological roles in the cardiovascular system, having been previously described as important for cellular, keratinocyte and skeletal muscle differentiation. This project performed in cooperation with PluriCell Biotech, a startup specialized in the production and differentiation of hiPSC-CM, has sought (1) characterizing gene and protein expression of molecular markers of maturation and of subtype specification throughout of differentiation; (2) Assessing the electrical functionality of hiPSC-CM through the characterization of subtype-specific action potentials (APs) and (3) Investigating whether the progress of hiPSCCM maturation is regulated by BK through kinin-B2 receptors (B2R). Our results have validated the model that proposes a developmental-dependent switch between skeletal (ssTnI) and cardiac (cTnI) isoforms of troponin I as differentiation progresses, at least to some extent. Furthermore, prolonged time in culture has resulted in higher levels of expression of the ventricular marker MLC2v and in increased rates of ventricular-like action APs. Electrophysiological analysis of hiPSC-CM reveals a mixed population with AP morphologies correspondent to nodal, atrial and ventricular subtypes, all showing pronounced automaticity as well as other features of immature cardiomyocytes, such as low amplitude and depolarization velocity. Such findings are coherent with those from other groups who have attempted to differentiate mature native-like cardiac cells from pluripotent stem cells sources, without fully succeeding. After showing that differentiating hiPSC-CM express a functional and responsive B2R, the receptor was subjected to chronic activation with 10µM BK and 1µM BK or inhibition with 5µM Firazyr+BK. Even though B2R modulation has not interfered negatively with differentiation yields nor cell morphology, analysis of gene andprotein expression of ssTnI or cTnI and of the ventricular marker MLC2v, have revealed no significant results in comparison to untreated controls. This suggests that BK does not interfere on hiPSC-CM maturation nor subtype specification, although we cannot rule out that it could be leading to other unexplored effects. We recommend a closer look into which intracellular signalling pathways become active upon B2R stimulation in hiPSC-CM, in order to narrow down cellular processes for further investigation. / Doenças cardiovasculares são responsáveis por quase um terço de todas as mortes globais anualmente, e por isto o sistema cardiovascular é amplamente estudado. Cardiomiócitos derivados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCCM) emergiram como uma promissora tecnologia para modelagem de doenças cardíacas e terapia personalizada. No entanto, desafios acerca de sua maturação funcional e molecular ainda são enfrentados. Além disso, protocolos de diferenciação geralmente levam à obtenção de populações heterogêneas contendo células com fenótipos similares aos de cardiomiócitos nodais, atriais e ventriculares sendo, portanto, inapropriadas para fins terapêuticos. A bradicinina (BK) é um peptídio vasoativo que exerce importantes papeis fisiológicos no sistema cardiovascular, além de ter sido previamente descrita como importante para a diferenciação neuronal, de queratinócitos e de músculo esquelético. Este projeto foi realizado em colaboração com a empresa PluriCell Biotech, uma startup especializada na produção e diferenciação de hiPSC-CM, e buscou (1) caracterizar a expressão gênica e proteíca de marcadores moleculares de maturação e de especificação de subtipos cardíacos durante a diferenciação; (2) avaliar a funcionalidade elétrica de hiPSC-CM por meio da caracterização de seus potenciais de ação (PAs) e (3) Investigar se o progresso da diferenciação de hiPSCCM é regulado por bradicinina por meio do receptor B2 (B2R). Nossos resultados validaram o modelo que propõe um switch na expressão das isoformas funcionais de troponina I esquelética (ssTnI) e cardíaca (cTnI), durante o desenvolvimento e diferenciação celular, pelo menos parcialmente. Além disso, tempo prolongado em cultura resultou em maiores níveis de expressão do marcador ventricular MLC2v, assim como maiores frequências de PAs com morfologias similares a de cardiomiócitos ventriculares. Análise eletrofisiológica de hiPSCCM revelam a existência de uma população mista contendo PAs correspondentes aos subtipos nodais, atriais e ventriculares, assim como pronunciada automaticidade e outros atributos típicos de cardiomiócitos imaturos, como baixa amplitude e devagar velocidade de despolarização. Estes resultados são coerentes com os de outros grupos que ainda não foram totalmente bem-sucedidos em diferenciar células cardíacas maduras similares acardiomiócitos nativos a partir de células-troncos pluripotentes. Após mostrar que as hiPSCCM expressam receptores B2 funcionais e responsivos, submetemos o receptor a uma ativação crônica com BK 10µM e BK 1µM ou inibição crônica com Firazyr 5µM + BK. Apesar da modulação do B2R não ter interferido de forma negativa no rendimento da diferenciação ou na morfologia celular, análise de expressão gênica e proteica de ssTnI e cTnI e do marcador ventricular MLC2v não revelou resultados significativos em comparação aos controles não-tratados. Isto sugere que a BK não interfere na maturação e especificação de subtipos cardíacos em hiPSC-CM, apesar de não podermos ignorar o fato de que ela poderia estar desencadeando outros efeitos inexplorados. Nós recomendamos um estudo mais aprofundado acerca de quais vias de sinalização se tornam ativas após estimulação do receptor B2 em hiPSC-CM, com o objetivo de afunilar quais processos celulares poderiam ser investigados em uma próxima etapa deste estudo.

Cardiovascular diseases are responsible for almost one third of all global deaths yearly, and therefore are largely studied. Cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) have emerged as an exciting technology for cardiac disease modelling and personalised therapy. Nevertheless, issues concerning functional and molecular maturation are still faced. In addition to this, differentiation protocols generally yield a heterogeneous mixed population comprised of nodal, atrial and ventricular-like subtypes, being unsuitable for therapeutic purposes. Bradykinin (BK) is a vasoactive peptide which exerts important physiological roles in the cardiovascular system, having been previously described as important for cellular, keratinocyte and skeletal muscle differentiation. This project performed in cooperation with PluriCell Biotech, a startup specialized in the production and differentiation of hiPSC-CM, has sought (1) characterizing gene and protein expression of molecular markers of maturation and of subtype specification throughout of differentiation; (2) Assessing the electrical functionality of hiPSC-CM through the characterization of subtype-specific action potentials (APs) and (3) Investigating whether the progress of hiPSCCM maturation is regulated by BK through kinin-B2 receptors (B2R). Our results have validated the model that proposes a developmental-dependent switch between skeletal (ssTnI) and cardiac (cTnI) isoforms of troponin I as differentiation progresses, at least to some extent. Furthermore, prolonged time in culture has resulted in higher levels of expression of the ventricular marker MLC2v and in increased rates of ventricular-like action APs. Electrophysiological analysis of hiPSC-CM reveals a mixed population with AP morphologies correspondent to nodal, atrial and ventricular subtypes, all showing pronounced automaticity as well as other features of immature cardiomyocytes, such as low amplitude and depolarization velocity. Such findings are coherent with those from other groups who have attempted to differentiate mature native-like cardiac cells from pluripotent stem cells sources, without fully succeeding. After showing that differentiating hiPSC-CM express a functional and responsive B2R, the receptor was subjected to chronic activation with 10µM BK and 1µM BK or inhibition with 5µM Firazyr+BK. Even though B2R modulation has not interfered negatively with differentiation yields nor cell morphology, analysis of gene andprotein expression of ssTnI or cTnI and of the ventricular marker MLC2v, have revealed no significant results in comparison to untreated controls. This suggests that BK does not interfere on hiPSC-CM maturation nor subtype specification, although we cannot rule out that it could be leading to other unexplored effects. We recommend a closer look into which intracellular signalling pathways become active upon B2R stimulation in hiPSC-CM, in order to narrow down cellular processes for further investigation. / Doenças cardiovasculares são responsáveis por quase um terço de todas as mortes globais anualmente, e por isto o sistema cardiovascular é amplamente estudado. Cardiomiócitos derivados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCCM) emergiram como uma promissora tecnologia para modelagem de doenças cardíacas e terapia personalizada. No entanto, desafios acerca de sua maturação funcional e molecular ainda são enfrentados. Além disso, protocolos de diferenciação geralmente levam à obtenção de populações heterogêneas contendo células com fenótipos similares aos de cardiomiócitos nodais, atriais e ventriculares sendo, portanto, inapropriadas para fins terapêuticos. A bradicinina (BK) é um peptídio vasoativo que exerce importantes papeis fisiológicos no sistema cardiovascular, além de ter sido previamente descrita como importante para a diferenciação neuronal, de queratinócitos e de músculo esquelético. Este projeto foi realizado em colaboração com a empresa PluriCell Biotech, uma startup especializada na produção e diferenciação de hiPSC-CM, e buscou (1) caracterizar a expressão gênica e proteíca de marcadores moleculares de maturação e de especificação de subtipos cardíacos durante a diferenciação; (2) avaliar a funcionalidade elétrica de hiPSC-CM por meio da caracterização de seus potenciais de ação (PAs) e (3) Investigar se o progresso da diferenciação de hiPSCCM é regulado por bradicinina por meio do receptor B2 (B2R). Nossos resultados validaram o modelo que propõe um switch na expressão das isoformas funcionais de troponina I esquelética (ssTnI) e cardíaca (cTnI), durante o desenvolvimento e diferenciação celular, pelo menos parcialmente. Além disso, tempo prolongado em cultura resultou em maiores níveis de expressão do marcador ventricular MLC2v, assim como maiores frequências de PAs com morfologias similares a de cardiomiócitos ventriculares. Análise eletrofisiológica de hiPSCCM revelam a existência de uma população mista contendo PAs correspondentes aos subtipos nodais, atriais e ventriculares, assim como pronunciada automaticidade e outros atributos típicos de cardiomiócitos imaturos, como baixa amplitude e devagar velocidade de despolarização. Estes resultados são coerentes com os de outros grupos que ainda não foram totalmente bem-sucedidos em diferenciar células cardíacas maduras similares acardiomiócitos nativos a partir de células-troncos pluripotentes. Após mostrar que as hiPSCCM expressam receptores B2 funcionais e responsivos, submetemos o receptor a uma ativação crônica com BK 10µM e BK 1µM ou inibição crônica com Firazyr 5µM + BK. Apesar da modulação do B2R não ter interferido de forma negativa no rendimento da diferenciação ou na morfologia celular, análise de expressão gênica e proteica de ssTnI e cTnI e do marcador ventricular MLC2v não revelou resultados significativos em comparação aos controles não-tratados. Isto sugere que a BK não interfere na maturação e especificação de subtipos cardíacos em hiPSC-CM, apesar de não podermos ignorar o fato de que ela poderia estar desencadeando outros efeitos inexplorados. Nós recomendamos um estudo mais aprofundado acerca de quais vias de sinalização se tornam ativas após estimulação do receptor B2 em hiPSC-CM, com o objetivo de afunilar quais processos celulares poderiam ser investigados em uma próxima etapa deste estudo.