Use of biotechnology in agriculture has become beneficial for many farmers. However, growing of genetically modified crops has it's own specifics. Paper describes and evaluates specifics of use of biotechnologies in agriculture in the Czech Republic.

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Els resultats d'aquesta Tesi posen de manifest el paper del cervell en el control del desenvolupament larvari de Sesamia nonagrioides. Així, S. nonagrioides és el primer lepidòpter on s'ha trobat que es pot desenvolupar de larva a adult sense cervell. Les nostres dades mostren que les mudes depenen de l'alliberament d'ecdisteroides per les glàndules protoràciques (GPs) però poden tenir lloc sense la hormona protoracicotròpica (PTTH) del cervell.Mentre que les larves decapitades (larves sense cervell ni corpora allata, (CA)) pupen, les larves de les que s'ha privat del cervell (però s'ha mantingut el CA) sofreixen sovint varies mudes successives; la primera muda pot ser de larva o pupa segons l'edat a la que la larva ha estat privada del cervell i el fotoperíode al qual la larva s'ha desenvolupat. Moltes de les larves L6 privades del cervell un dia després de la muda van mudar a larva independentment de les condicions de fotoperíode durant el desenvolupament, de dia llarg (DL) o curt (DC), mentre que 5 dies després totes les larves desenvolupades en DL van pupar i les de la mateixa edat però desenvolupades en DC van mudar a larva. Els implants de cervell acceleren les mudes a pupa però no alteren les mudes a larva. S. nonagrioides no sembla tenir cap font alternativa als CA de hormona juvenil (HJ). Les larves decapitades no van mostrar quantitats significades de HJ mentre que les larves privades de cervell van mostrar concentracions que es poden detectar fins i tot 10 dies després de la manipulació quirúrgica, però els implants de cervell no activen els CA essent aparentment neural l'activació d'aquests factors. El cervell podria ser el responsable del manteniment de l'estat larvari per inhibició neural de la pupació; quan les larves d'edat variada van ser privades del cervell, la majoria van pupar. De manera similar, el cervell també podria ser el responsable del manteniment de la diapausa per inhibició de la pupació, conseqüentment, quan les larves van ser privades del cervell (tot mantenint o no els CA) les diferencies entre larves dipausants o no diapausants van desaparèixer.El nivell d'ecdisteroides en les larves decapitades augmentà 10 dies després de la manipulació, aproximadament el temps necessari per a pupar en aquelles larves en absència de HJ, encara que l'extracció de les GPs va impedir la muda, i això probà que la presencia de GPs és essencial per al procés de muda. Les GPs en les larves de S. nonagrioides poden funcionar sense estimulació del cervell i la PTTH pot ser alliberada per una font de fora del cap; a S. nonagrioides hem identificat la PTTH mRNA i una font alternativa en l'intestí. La qPCR confirmà que el gen de la PTTH a S. nonagrioides s'expressa molt al cervell de l'instar 6è amb un màxim al dia 5è i un mínim en la prepupa, però el nivell d'expressió de la PTTH es va detectar també en l'intestí de les larves intactes i encara més en el de las decapitades amb una expressió màxima en la prepupa.La més gran part de les larves decapitades muden a pupa sense cap senyal de desenvolupament d'adult mentre que la majoria de pupes provades de cervell sofreixen metamorfosi a adult, lo que suggereix que la transformació de pupa a adult depèn d'un factor desconegut present en les larves privades de cervell però no en les decapitades. En S. nonagrioides la HJ aplicada tòpicament no solament no va inhibir la metamorfosi de pupa a adult però la pogué haver afavorit mentre que l'aplicació d'un agonista d'ecdisteroides a les pupes no va tenir cap efecte en el desenvolupament d'adult.La ingestió per les larves de S. nonagrioides de quantitats subletals de la proteïna Cry1Ab continguda en les fulles de panís o en la dieta va produir un perllongament del seu desenvolupament acompanyat d'un augment en el nombre de mudes abans de pupar però només en les larves criades en condicions de DL, no en les criades en condicions DC. Aquests resultats són deguts a un augment del nivell de HJ en la hemolimfa de les larves no diapausants (DL) alimentades amb fulles de panís Bt o amb la proteïna Bt afegida a la dieta; pel contrari, no es va detectar el possible lleuger increment de HJ causat per la ingestió de la proteïna Bt en les larves diapausants (DC). A més, l'efecte de la proteïna Bt en la concentració d'ecdisteroides en les larves no diapausants va ser suprimir l'augment de la hormona que era necessari per la pupació i per tant va retardar la pupació en les larves tractades. Aquestes respostes poden ser considerades com un mecanisme de defensa que permet que algunes larves puguin mudar i sobreviure a la ingestió de la toxina. / Los resultados de esta Tesis ponen de manifiesto el papel del cerebro en el control del desarrollo larvario de Sesamia nonagrioides. Así, S. nonagrioides es el primer lepidóptero en el que se demuestra que el desarrollo de larva a adulto puede producirse sin la presencia del cerebro. Nuestros datos demuestran que aunque las mudas dependen de la liberación de ecdisteroides por las glándulas protorácicas (GPs), estas pueden ser activadas sin hormona protoracicotrópica (PTTH) del cerebro.Mientras que las larvas decapitadas (larvas sin cerebro ni corpora allata, (CA)) pupan, las larvas descerebradas, de las que se ha extraído el cerebro pero mantienen el CA, sufren a menudo varias mudas sucesivas, la primera a otra larva o pupa según la edad a la que la larva ha sido desprovista del cerebro y según el fotoperiodo bajo el cual la larva se había desarrollado. Muchas larvas desprovistas del cerebro un día después de la muda a sexto estadio mudan a larva independientemente de las condiciones de fotoperiodo, día largo (DL) o corto (DC), recibidas durante su desarrollo, mientras que 5 días después todas las larvas desarrolladas en día largo puparán y las de la misma edad pero desarrolladas en día corto mudaran a larva. Los implantes de cerebro aceleran las mudas a pupa pero no alteran las mudas a larva. S. nonagrioides no parece tener ninguna fuente de hormona juvenil (HJ) alternativa a los CA. Las larvas decapitadas no mostraron cantidades significativas de HJ mientras que las desprovistas de cerebro mostraron cantidades de HJ detectables incluso 10 días después de la manipulación quirúrgica indicando así que los CA siguieron liberando HJ en ausencia del cerebro. Los implantes de cerebro no activaron los CA por lo que su activación es aparentemente neural. El cerebro debe ser el responsable del mantenimiento del estado larvario por inhibición neural de la pupación ya que cuando se extrajo el cerebro a larvas de diferentes edades la mayoría puparon. De manera similar, el cerebro también debe ser el responsable del mantenimiento de la diapausa ya que cuando las larvas fueron desprovistas del cerebro (manteniendo o no los CA) las diferencias entre larvas dipausantes o no diapausantes desaparecieron.El nivel de ecdisteroides en las larvas decapitadas aumentó 10 días después de la extracción del cerebro, este tiempo es aproximadamente el tiempo que las larvas de último estadio larvario necesitan para pupar. La extracción de las GPs impidió la muda, lo que demuestra que su presencia es esencial para que tenga lugar el proceso de la muda. Ante la evidencia de que las GPs de las larvas de S. nonagrioides podían activarse sin la estimulación por hormona PTTH del cerebro se buscaron fuentes alternativas de la hormona y se identificó PTTH mRNA en el intestino de la larva. La qPCR confirmó que el gen de la PTTH en S. nonagrioides se expresa de forma elevada en el cerebro de la larva de 6º estadio con un máximo el 5º día del mismo y un mínimo en la prepupa, pero la expresión de la PTTH se detectó también en el intestino de las larvas intactas y mucho más en las decapitadas con máxima expresión en el periodo de prepupa.De forma general se asume que la metamorfosis pupa-adulto en los insectos se produce en ausencia de HJ y en el caso de S. nonagrioides la mayoría de las larvas decapitadas mudan a pupa sin mostrar posteriormente ningún indicio de desarrollo a adulto mientras que la mayoría de pupas desprovistas de cerebro pero que mantiene su CA sufren metamorfosis a adulto. Este hecho sugirió que la transformación de pupa a adulto en esta especie depende de algún factor presente en las larvas descerebradas pero no en las decapitadas. En S. nonagrioides la HJ aplicada tópicamente no solamente no inhibió la metamorfosis de pupa a adulto sino que la favoreció mientras que la aplicación de un agonista de ecdisteroides a las pupas no tuvo efecto sobre el desarrollo a adulto.La ingestión por las larvas de S. nonagrioides de cantidades subletales de la proteína Cry1Ab contenida en hoja de maíz o en dieta produjo un prolongamiento de su desarrollo acompañado de un aumento en el número de mudas larvarias antes de pupar, pero sólo en las larvas desarrolladas en condiciones de DL, no en las desarrolladas en condiciones de DC. Estos resultados son consecuencia del aumento de HJ en la hemolinfa de las larvas no diapausantes alimentadas con hoja de maíz Bt o con la proteína Bt añadida. Sin embargo, no se detectó el posible ligero aumento de HJ causado por la ingestión de la proteína Bt en las larvas diapausantes (desarrolladas en DC). Otro efecto de la ingestión de la proteína Bt en las larvas no-diapausantes fue suprimir el aumento en la concentración de ecdisteroides necesario para la pupación que por tanto se retrasó en las larvas tratadas. Estas respuestas pueden ser consideradas como un mecanismo de defensa que permite que algunas larvas puedan mudar y así sobrevivir a la ingestión de la toxina. / The results of this Thesis highlight the role of brain in the control of larval development in Sesamia nonagrioides. Thus, S. nonagrioides is the first lepidopteran found to develop from larvae to adult without brain. Our data show that molts depend on the release of ecdysteroids by prothoracic glands (PGs) but they can occur without prothoracicotropic hormone (PTTH) from the brain.While all decapitated larvae (larvae without brain nor corpora allata, (CA)) pupate, the debrained larvae (larvae with no brain but with CA) often undergo several successive molts; first molt could be to larva or pupa, depending on the age at which the larva has been debrained and on the photoperiod under which the larvae have developed: many of the L6 larvae debrained 1 day after molting, molted to larvae independently of the photoperiod conditions of development, long (LD) or short (SD) day, but 5 days later all larvae developed under LD conditions pupated whereas larvae of the same age developd under SD conditions molted to larvae. Brain implants slightly accelerate pupal molts but do not alter the timing of larval molts. S. nonagrioides does not seem to have any alternative source of juvenile hormone (JH) to the CA. Decapitated larvae did not show noticeable amounts of JH while debrained larvae showed detectable concentrations of JH still 10 days after the surgical manipulation but the brain implants do not activate CA, apparently being neural the activation of these factors. The brain might be responsible for larval stage maintenance by neural inhibition of pupation; when the larvae of any age were deprived of their brain, the majority pupated. In the same way, the brain might be also responsible of diapause maintenance by neural inhibition of pupation; consequently, when the larvae were deprived of their brain (maintaining or not their CA) differences between diapausing and non-diapausing larvae disappeared.The level of ecdysteroids in the decapitated larvae increased ten days after manipulation, approximately the time needed to pupate in these larvae in absence of JH, but the removal of PGs prevented molting, proving that the presence of PGs is essential for the molting process. The PGs of S. nonagrioides larvae can function without brain stimulation and PTTH could be released by a source outside the head; in S. nonagrioides we have identified the PTTH mRNA and an alternative PTTH source in the gut. The qPCR confirmed that the PTTH gene of S. nonagrioides is strongly expressed in the brain of the 6th instar with a maximum on day 5 and a minimum in prepupa, but the level of PTTH expression was also detected in the gut of intact and even more in decapitated larvae with a maximum expression in prepupa.Most decapitated larvae molt to pupa with no sign of adult development while the majority of debrained pupae suffer metamorphosis to adult thus suggesting that pupal-adult transformation depends on an unknown factor present in the debrained but not in the decapitated larvae. In S. nonagrioides JH applied topically not only did not inhibit the pupal-adult metamorphosis but could have favored it while the application of an ecdysteroids agonist to the pupae had no effect on the adult development.Ingestion by S. nonagrioides larvae of sub-lethal amounts of Cry1Ab protein contained in maize leaves or the diet produced a prolonged development accompanied by an increase in the number of molts before pupating only in the larvae reared under LD conditions but not in the larvae reared under SD conditions. These results are due to an increase of the level of JH in the hemolymph in the non-diapausing larvae fed with Bt maize leaves or with Bt protein in the diet; on the contrary, in diapausing (SD) larvae the possible low increase of JH due to the Bt toxin ingested was not detected. In addition, the effect of Bt toxin on the ecdysteroids titer in non diapausing larvae was to suppress the increase of the hormone necessary for the pupation of and thus delaying pupation in the treated larvae. These responses may be considered as a defense mechanism allowing some larvae to molt and to survive to the toxin ingestion.

O uso de culturas GM (geneticamente modificadas) tem sido questionado quanto ao destino dos produtos derivados da transgenia no ambiente. Com a liberação de exsudatos das raízes das plantas e a decomposição dos resíduos culturais, aumenta-se a quantidade de DNA transgênico no ambiente, que pode ser adsorvido à superfície ativa das partículas do solo e/ou degradado pela ação de enzimas microbianas. A comunidade microbiana do solo pode entrar em contato direto com estes produtos, aumentando a probabilidade de transferência horizontal de fragmentos de DNA transgênico para os microrganismos. Também, alterações na composição dos exsudatos das plantas GM e mudanças em função das práticas de manejo, podem resultar em alterações na composição funcional e estrutural da comunidade microbiana. Assim, faz-se necessário avaliar a persistência dos produtos derivados da transgenia no solo e seus possíveis efeitos sobre a comunidade microbiana. Os objetivos deste estudo foram: avaliar a persistência dos fragmentos 35S-hsp70, hsp70-cry1Ab e cry1Ab-planta da construção gênica do milho Bt (evento MON810) em diferentes tipos de solo e temperaturas, em condições de microcosmo e de campo; e determinar a abundância do número de cópias dos gene 16S rRNA de Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria e Archaea, e 18S rRNA de Fungo nas mesmas condições, e avaliar a estrutura da comunidade bacteriana em áreas agrícolas de cultivo de milho Bt. No primeiro estudo, o DNA do milho Bt MON810 foi adicionado em solos arenoso e argiloso. Como controle negativo, apenas água estéril foi misturada ao solo. Amostras de solo foram incubadas a 15 e 25ºC. Em campo, os solos foram amostrados em três áreas agrícolas em Fátima do Sul, MS, em dois anos consecutivos. Após extração de DNA, os fragmentos foram quantificados por qPCR. No segundo estudo, foram determinadas a abundância dos genes 16S rRNA de Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria e Archaea e 18S rRNA de Fungo e avaliada a estrutura da comunidade bacteriana por T-RLFP. Os resultados mostraram que em condições de microcosmo, os fragmentos hsp70-cry1Ab e cry1Ab-planta persistiram até 291 dias, e o fragmento 35S-hsp70 até 180 dias. A temperatura e o tipo de solo não afetaram a persistência dos fragmentos. Em campo, o número de cópias desses fragmentos foi maior na segunda coleta. No segundo estudo, o número de cópias do gene 16S rRNA de Bacteria aumentou com adição de DNA do milho Bt nos microcosmos, e uma redução do número de cópias foi verificada para Archaea, Verrucomicrobia e Fungo. Para Firmicutes, os resultados não foram consistentes. As temperaturas não resultaram em efeito na abundância dos genes, enquanto o tipo de solo teve efeito apenas para Archaea e Verrucomicrobia. Áreas agrícolas com cinco anos de cultivo de milho Bt apresentaram variações na estrutura da comunidade bacteriana em nível de filo, e maior abundância de Fungos no segundo ano de amostragem, enquanto em área com um ano de cultivo, observouse uma redução da população de Firmicutes e Verrucomicrobia. Os maiores efeitos na comunidade microbiana foram verificados entre os anos de amostragem / The use of GM (genetically modified) crops has been questioned about the fate of transgenes is derived products on the environment. With the release of exudates from roots of GM plants and the decomposition of its residues, the amount of transgenic DNA in the environment increases, which can be adsorbed to the active surface of soil particles and/or be degraded by the action of microbial enzymes. Soil microbial communities can come into direct contact with these products, raising the probability of horizontal transfer of transgenic DNA fragments to soil microorganisms. Moreover, changes in exudates composition of GM plants and changes depending on the management practices may result in structural and functional alterations in the microbial community. Thus, it is necessary to evaluate the persistence of transgenes is derivatives in the soil and effects on microbial community. The objectives of this study were to assess the persistence of fragments 35S-hsp70, hsp70-cry1Ab and cry1Abplant from the genetic construct of Bt corn (event MON810) in different soil types and temperatures, in microcosm and field conditions; and to determine the abundance of 16S rRNA copy number of Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria and Archaea and 18S rRNA of Fungi under the same conditions, and to evaluate the structure of bacterial communities in agricultural areas of Bt corn cultivation. In the first study, DNA from Bt corn MON810 was added to sandy and clay soils. As negative control, only sterile water was mixed with soil. Soil samples were incubated at 15 and 25°C. At the field, soils were sampled in three agricultural areas in Fátima do Sul, MS, in two consecutive years. After DNA extraction, fragments were quantified by qPCR. In the second study, the abundance of 16S rRNA of Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria and Archaea and 18S rRNA of Fungi were determined and the structure of bacterial communities was evaluated by T-RFLP. The results showed that in microcosm conditions, hsp70-cry1Ab and cry1Ab-plants fragments persisted until 291 days and the 35S-hsp70 up to 180 days. The temperature and the type of soil did not affect the persistence of fragments. In field, the copy number of these fragments was greater in the second sampling. In the second study, the copy number of 16S rRNA of Bacteria increased with the addition of DNA from Bt corn in microcosm, and a reduction in copy number was observed for Archaea, Verrucomicrobia and Fungi. The results were not consistent for Firmicutes. Temperatures resulted in no effect in gene abundance, while the soil was effective only for Archaea and Verrucomicrobia. Agricultural areas with five years of Bt corn cultivation showed variations in bacterial community structure at the phylum level, and greater abundance of fungi in the second year of sampling, while in the area with a year of cultivation, a reduction in population of Firmicutes and Verrucomicrobia was observed. The largest effects on the microbial community were observed between the sampled years

O uso de culturas GM (geneticamente modificadas) tem sido questionado quanto ao destino dos produtos derivados da transgenia no ambiente. Com a liberação de exsudatos das raízes das plantas e a decomposição dos resíduos culturais, aumenta-se a quantidade de DNA transgênico no ambiente, que pode ser adsorvido à superfície ativa das partículas do solo e/ou degradado pela ação de enzimas microbianas. A comunidade microbiana do solo pode entrar em contato direto com estes produtos, aumentando a probabilidade de transferência horizontal de fragmentos de DNA transgênico para os microrganismos. Também, alterações na composição dos exsudatos das plantas GM e mudanças em função das práticas de manejo, podem resultar em alterações na composição funcional e estrutural da comunidade microbiana. Assim, faz-se necessário avaliar a persistência dos produtos derivados da transgenia no solo e seus possíveis efeitos sobre a comunidade microbiana. Os objetivos deste estudo foram: avaliar a persistência dos fragmentos 35S-hsp70, hsp70-cry1Ab e cry1Ab-planta da construção gênica do milho Bt (evento MON810) em diferentes tipos de solo e temperaturas, em condições de microcosmo e de campo; e determinar a abundância do número de cópias dos gene 16S rRNA de Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria e Archaea, e 18S rRNA de Fungo nas mesmas condições, e avaliar a estrutura da comunidade bacteriana em áreas agrícolas de cultivo de milho Bt. No primeiro estudo, o DNA do milho Bt MON810 foi adicionado em solos arenoso e argiloso. Como controle negativo, apenas água estéril foi misturada ao solo. Amostras de solo foram incubadas a 15 e 25ºC. Em campo, os solos foram amostrados em três áreas agrícolas em Fátima do Sul, MS, em dois anos consecutivos. Após extração de DNA, os fragmentos foram quantificados por qPCR. No segundo estudo, foram determinadas a abundância dos genes 16S rRNA de Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria e Archaea e 18S rRNA de Fungo e avaliada a estrutura da comunidade bacteriana por T-RLFP. Os resultados mostraram que em condições de microcosmo, os fragmentos hsp70-cry1Ab e cry1Ab-planta persistiram até 291 dias, e o fragmento 35S-hsp70 até 180 dias. A temperatura e o tipo de solo não afetaram a persistência dos fragmentos. Em campo, o número de cópias desses fragmentos foi maior na segunda coleta. No segundo estudo, o número de cópias do gene 16S rRNA de Bacteria aumentou com adição de DNA do milho Bt nos microcosmos, e uma redução do número de cópias foi verificada para Archaea, Verrucomicrobia e Fungo. Para Firmicutes, os resultados não foram consistentes. As temperaturas não resultaram em efeito na abundância dos genes, enquanto o tipo de solo teve efeito apenas para Archaea e Verrucomicrobia. Áreas agrícolas com cinco anos de cultivo de milho Bt apresentaram variações na estrutura da comunidade bacteriana em nível de filo, e maior abundância de Fungos no segundo ano de amostragem, enquanto em área com um ano de cultivo, observouse uma redução da população de Firmicutes e Verrucomicrobia. Os maiores efeitos na comunidade microbiana foram verificados entre os anos de amostragem / The use of GM (genetically modified) crops has been questioned about the fate of transgenes is derived products on the environment. With the release of exudates from roots of GM plants and the decomposition of its residues, the amount of transgenic DNA in the environment increases, which can be adsorbed to the active surface of soil particles and/or be degraded by the action of microbial enzymes. Soil microbial communities can come into direct contact with these products, raising the probability of horizontal transfer of transgenic DNA fragments to soil microorganisms. Moreover, changes in exudates composition of GM plants and changes depending on the management practices may result in structural and functional alterations in the microbial community. Thus, it is necessary to evaluate the persistence of transgenes is derivatives in the soil and effects on microbial community. The objectives of this study were to assess the persistence of fragments 35S-hsp70, hsp70-cry1Ab and cry1Abplant from the genetic construct of Bt corn (event MON810) in different soil types and temperatures, in microcosm and field conditions; and to determine the abundance of 16S rRNA copy number of Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria and Archaea and 18S rRNA of Fungi under the same conditions, and to evaluate the structure of bacterial communities in agricultural areas of Bt corn cultivation. In the first study, DNA from Bt corn MON810 was added to sandy and clay soils. As negative control, only sterile water was mixed with soil. Soil samples were incubated at 15 and 25°C. At the field, soils were sampled in three agricultural areas in Fátima do Sul, MS, in two consecutive years. After DNA extraction, fragments were quantified by qPCR. In the second study, the abundance of 16S rRNA of Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria and Archaea and 18S rRNA of Fungi were determined and the structure of bacterial communities was evaluated by T-RFLP. The results showed that in microcosm conditions, hsp70-cry1Ab and cry1Ab-plants fragments persisted until 291 days and the 35S-hsp70 up to 180 days. The temperature and the type of soil did not affect the persistence of fragments. In field, the copy number of these fragments was greater in the second sampling. In the second study, the copy number of 16S rRNA of Bacteria increased with the addition of DNA from Bt corn in microcosm, and a reduction in copy number was observed for Archaea, Verrucomicrobia and Fungi. The results were not consistent for Firmicutes. Temperatures resulted in no effect in gene abundance, while the soil was effective only for Archaea and Verrucomicrobia. Agricultural areas with five years of Bt corn cultivation showed variations in bacterial community structure at the phylum level, and greater abundance of fungi in the second year of sampling, while in the area with a year of cultivation, a reduction in population of Firmicutes and Verrucomicrobia was observed. The largest effects on the microbial community were observed between the sampled years

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