BRITO, D. Avaliação do potencial de biodegradação de gasolina por bactérias do gênero burkholderia. 2012. 69 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2012. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-21T15:49:02Z No. of bitstreams: 1 2012_dsi_dbrito.pdf: 1457944 bytes, checksum: 661285327bed2a671ebcecc0c056085a (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-21T15:49:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dsi_dbrito.pdf: 1457944 bytes, checksum: 661285327bed2a671ebcecc0c056085a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-21T15:49:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dsi_dbrito.pdf: 1457944 bytes, checksum: 661285327bed2a671ebcecc0c056085a (MD5) Previous issue date: 2012 / The generic taxon Burkholderia presents a high metabolic diversity that allows these protobacteria live in a wide range of habitats, among these are the soil, water (including sea water), plants, fungi, animals and even humans. A remarkable biotechnological application is the capacity to promote the pollutants biodegradation. Thus, this study aimed the identification of Burkhoderia SMF 090 isolate, as well the evaluation of its potential on the utilization of gasoline as a carbon source and the identification of metabolic pathways possibly involved in the degradation of gasoline on its components through realization of proteomic analysis. The identification of the SMF 090 isolate and the analysis of molecular phylogeny were carried out by 16S rRNA gene sequencing. In addition, the molecular phylogeny was analyzed and phylogenetic trees were reconstructed using other bacteria from the same genus. In order to characterize the growth pattern of SMF 090, bacterial growth curves were assessed using the media TY (a nutritive media), BH (a medium without carbon), BH plus commercial gasoline and BH plus D-glucose. The study of differentially expressed proteins was performed using bidimensional electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics analysis. After the 16S rRNA analysis was suggested that SMF 090 is related to Burkholderia sabiae Br3407 and both descended from a recent common ancestral. The strain grown in mineral media containing gasoline as the unique carbon source. Differentially expressed proteins were observed between the tested groups and these proteins may be associated to the metabolic degradation of hydrocarbons. The analysis of data provided by 2DE electrophoresis and mass spectrometry allowed the identification of various proteins related to the monocyclic and polycyclic aromatic hydrocarbons catabolism pathway. Therefore, this study showed relevant results about the growth of Burkholderia as a potential gasoline biodegradant. / O táxon genérico Burkholderia apresenta grande diversidade metabólica, possibilitando que estas proteobactérias vivam numa variedade de habitats, dentre os quais destacamos o solo, água (incluindo água do mar), plantas, fungos, animais e até mesmo seres humanos. Uma das aplicações biotecnológicas mais marcantes é a capacidade de promover a biodegradação de poluentes. Assim, este estudo visou a identificação do isolado de Burkholderia SMF 090, bem como a avaliação do potencial na utilização da gasolina como fonte de carbono e a identificação de vias metabólicas possivelmente envolvidas na degradação dos componentes da gasolina através da realização de análises proteômicas. A identificação do isolado SMF 090 e análise da filogenia molecular foi realizada pelo sequenciamento do gene 16S rRNA. Posteriormente, foram realizadas análises de filogenia molecular e reconstrução de árvores filogenéticas com outras bactérias do gênero. Para a caracterização do perfil de crescimento do isolado SMF 090 foram realizadas curvas de crescimento em meio nutritivo (TY), meio sem fonte de carbono (BH), BH suplementado com gasolina comercial e BH suplementado com D-glicose. O estudo das proteínas diferencialmente expressas ocorreu através de eletroforese bidimensional, de espectrometria de massa e análises de bioinfomática. Através da análise do 16S rDNA, sugeriu-se que SMF 090 está relacionada à Burkholderia sabiae Br3407 e ambos descendem de um ancestral comum recente. A bactéria estudada foi capaz de crescer em meio mineral contendo gasolina como única fonte de carbono. Foi possível observar proteínas diferencialmente expressas entre os grupos testados, as quais podem estar associadas ao metabolismo de degradação de hidrocarbonetos. As análises dos géis de 2DE e os dados de espectrometria de massas permitiram a identificação de várias proteínas das vias de catabolismo dos hidrocarbonetos aromáticos monocíclios e policíclicos. Portanto, o estudo apresentou informações relevantes sobre o metabolismo de Burkholdeiras como potenciais biodegradadoras de gasolina

SOARES, M.A.A. Caracterização das alterações proteômicas de Burkholderia sp. em resposta ao fenol. 2013. 100 f. Dissertação (MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-01T12:01:15Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_maasoares.pdf: 2768119 bytes, checksum: c0677297cb45936115346dc705abe45e (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-27T15:04:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_maasoares.pdf: 2768119 bytes, checksum: c0677297cb45936115346dc705abe45e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-27T15:04:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_maasoares.pdf: 2768119 bytes, checksum: c0677297cb45936115346dc705abe45e (MD5) Previous issue date: 2013 / Bacteria of the genus Burkholderia have as one of its biotechnological applications the ability to biodegrade recalcitrant xenobiotic compounds. Thus, this study aimed to evaluate the ability of Burkholderia sp. SMF 07 tolerate and using phenol as the sole carbon source and performing proteomic analysis of this bacterium, in response to phenol, in order to identify differentially expressed proteins that are related to biodegradation of phenol, the stress response or metabolic pathways involving the production of energy for cells. The evaluation of the capacity of Burkholderia sp. SMF 07 using phenol as the sole carbon source was based on the construction of the curve of growth in mineral medium (BH). For extraction of total proteins was performed bacterial growth in culture medium TY (Triptone-Yeast Medium), supplemented or not with 1000 mg/L phenol, incubated at 28°C. The extraction of total proteins was done after the cultures reached the end of the log phase of bacterial growth (O.D between 0.8 and 1.0 and 0.6 and 0.8 for the control conditions and phenol, respectively). The proteins were quantified by the Bradford method (1976) and assessment of protein purity of the samples was performed by SDS-PAGE. The protein map for each tested condition was determined from two-dimensional electrophoresis (2-D). The adjustment of two-dimensional images of the gels, the detection of protein spots, and data evaluation to determine quantitative and qualitative changes of spots was made by the ImageMaster® software. The identification of proteins was performed using the ExPASy Proteomics Server, using the values of pI and MW of spot. Through the data obtained was observed differentially expressed proteins between the groups tested. Among the proteins that showed increased expression quantitative in the presence of phenol is highlight 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase, an enzyme involved in the degradation meta pathway phenol. Among those that showed decreased expression in the presence of phenol are highlights those involved in the biosynthesis of nucleotides and fatty acids, molecules important to the development and maintenance of microbial structure. Proteins which have inhibited its expression in the presence of phenol were mainly involved in the biosynthesis of amino acids, proteins, lipids, ubiquinone, purines and pyrimidines; beyond participate processing of tRNA, peptidoglycan synthesis, and in the stress response. In conclusion, the study showed that Burkholderia sp. SMF 07 not been able to utilize phenol as the sole carbon source but showed the ability to tolerate phenol when grown in nutrient medium at the concentrations tested. Through proteomic analysis was concluded that the pollutant alter the expression of proteins important for metabolism and maintenance of cellular structure. / Bactérias do gênero Burkholderia apresentam como uma das suas aplicações biotecnológicas a capacidade de biodegradar compostos xenobióticos recalcitrantes. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade da Burkholderia sp. SMF 07 tolerar e utilizar o fenol como única fonte de carbono e realizar a análise proteômica desta bactéria, em resposta ao fenol, com a finalidade de identificar proteínas diferencialmente expressas que estão relacionadas à biodegradação do fenol, à resposta ao estresse ou ainda, que participem das vias metabólicas de produção de energia para as células. A avaliação da capacidade da Burkholderia sp. SMF 07 utilizar o fenol como única fonte de carbono foi realizada a partir na construção da curva de crescimento em meio mineral (BH). A fim de realizar a extração das proteínas totais foi realizado o crescimento bacteriano em meio de cultivo TY (Triptone-Yeast Medium), suplementado ou não com 1000 mg/L de fenol, incubado a 28ºC. A extração das proteínas totais foi feita após as culturas atingirem o final da fase log do crescimento bacteriano (O.D entre 0,8 e 1,0 e 0,6 e 0,8, para as condições controle e fenol, respectivamente). As proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford (1976) e a avaliação da pureza das amostras proteicas foi realizada por SDS-PAGE. O mapa protéico para cada condição testada foi determinado a partir da eletroforese bidimensional (2-D). O ajuste das imagens dos géis bidimensionais, a detecção de spots protéicos e a avaliação dos dados para determinação de variações quantitativas e qualitativas dos spots foi feito pelo programa ImageMaster®. A identificação das proteínas foi feita através do ExPASy Proteomics Server, utilizando os valores de pI e MW do spot. Através dos dados obtidos foi possível observar proteínas diferencialmente expressas entre os grupos testados. Entre as proteínas que apresentaram expressão quantitativa aumentada na presença do fenol destaca-se a 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolase, uma enzima envolvida na via meta de degradação do fenol. Entre aquelas que apresentaram expressão reduzida na presença do fenol se destacam aquelas envolvidas na biossíntese de nucleotídeos e de ácidos graxos, moléculas importantes para o desenvolvimento e manutenção da estrutura microbiana. As proteínas que tiveram sua expressão inibida na presença do fenol estavam envolvidas principalmente na biossíntese de aminoácidos, proteínas, lipídeos, ubiquinona, purinas e pirimidinas; além de participarem do processamento do RNAt, síntese do peptideoglicano e na resposta ao estresse. Em conclusão, o estudo mostrou que a Burkholderia sp. SMF 07 não foi capaz de utilizar o fenol como única fonte de carbono, mas apresentou capacidade de tolerar o fenol quando cultivada em meio nutritivo nas concentrações testadas. Através da análise proteômica concluiu-se que o poluente alterou a expressão de proteínas importantes para o metabolismo e manutenção da estrutura celular.

LIMA, M.S. Análise proteômica, potencial de biodegradação e formação de biofilme de Burkholderia SMF090 sob tratamento com gasolina comercial. 2013. 67 f. Dissertação (MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-01T12:38:13Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_mdslima.pdf: 1741006 bytes, checksum: 359adb1f36cc306126973b67c1d5bae0 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-27T15:18:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_mdslima.pdf: 1741006 bytes, checksum: 359adb1f36cc306126973b67c1d5bae0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-27T15:18:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_mdslima.pdf: 1741006 bytes, checksum: 359adb1f36cc306126973b67c1d5bae0 (MD5) Previous issue date: 2013 / Os compostos pertencentes ao grupo caracterizado como BTEX (sigla para designar Benzeno Tolueno Etilbenzeno e Xileno) são largamente utilizados na indústria como matéria prima para diversos produtos como herbicidas tintas gasolina corantes borracha dentre outras substâncias que podem ser praticamente inertes ou potencialmente poluidoras A utilização da atividade microbiana como alternativa aos tratamentos convencionais de despoluição destas substâncias tem sido bastante estudada como forma de remoção destes compostos visto que é um processo viável e que muitas vezes deixa pouco ou nenhum resíduo secundário Este trabalho teve como objetivo analisar a capacidade de biodegradação por meio de curvas de crescimento do perfil proteômico e do potencial de formação de biofilme de Burkholderia SMF090 submetida ao crescimento em meio mínimo BH suplementado com gasolina comercial Curvas de crescimento foram feitas em meio BH suplementados com 2000 ppm do poluente A análise proteômica foi feita a partir de crescimentos em meio BH suplementados com 2000 ppm de gasolina comercial As proteínas bacterianas do referido crescimento foram extraídas a fim de realizar a eletroforese bidimensional Foram analisadas as proteínas diferencialmente expressas entre tratamento e controle (crescimento apenas em meio BH) análise da tendência de pI e massa molecular das proteínas obtidas e identificação das mesmas a partir do Expert Protein Analysis System (Expasy) As curvas de crescimento mostraram que à medida em que a bactéria é submetida ao poluente seu crescimento é mais rápido sugerindo uma adaptação ao poluente pela célula bacteriana As proteínas encontradas na análise proteômica são principalmente proteínas relacionadas à síntese protéica e ao metabolismo energético bacteriano Nos géis bidimensionais foram encontrados também proteínas pertencentes à via de degradação de compostos BTEX presentes na gasolina As análises prévias do potencial de formação de biofilme demonstraram alta capacidade da célula de formar esta estrutura inclusive não havendo diferenças na formação de biofilme em presença e ausência de gasolina comercial Os resultados sugerem que Burkholderia SMF 090 tem alto potencial de bidegradação dos compostos BTEX presentes na gasolina podendo futuramente ser estudada como possível alternativa biotecnológica para fins de biorremediação / Les composés appartenant au groupe caracterisé comme BTEX (Sigle pour designé Benzene, Toluene, Ethylbenzene, et xylène) sont largement utilisés dans l'industrie comme matière première pour divers produits, comme herbicides, peintures, colorants, caoutchouc, et dans d'autres substances qui peuvent etre pratiquement inertes ou potenciellement polluantes.L'utilisation de l'activité microbienne comme alternative aux traitements conventionnels de dépollution de ces substances, a été très etudié comme une forme d'enlèvement de ses composés, vu que c'est un procès viable et que très souvent ne laisse que peu, ou pas, de residu secondair.Ce travail a eu comme objectif d'analiser la capacité de biodegradation, par le biais de courbes de croissance, du profil proteomique et du potentiel de formation de biofilm Burkholderia SMF090, soumit à la croissance en milieu minimum BH complété avec de l'éssence commerciale.Des courbes de croissance ont été faites en milieu BH completé avec 2000 ppm d'éssence.L'analise proteomique a été faite a partir de croissances en milieu BH completé avec 2000 ppm d'éssence commerciale.Il a été realisé une extraction des proteines bacteriennes de la dite croissance, et electrophorèse bidimensionnellee.Ont été analisées les proteines différentiellement produites entre traitement et contrôle (Croissance seulement en milieu BH), analise de la tendance de pI et masse moleculaire des proteines obtenues, et identification de celle-ci a partir de la base de données Expasy. Les courbes de croissance montrent que, au fur et á mesure que la basterie est soumise au polluant, sa croissance est plus rapide, suggérant une adaptation au polluant par la cellule bactérienne.Les proteines rencontrées dans l'analise proteomique, sont principalment des proteines relationnées á la synthèse protéique, et au metabolisme énergetique bactérien.Dans les gels bidimensionnels, ont été rencontrés aussi des proteines appartenant á la voie de dégradation de composés BTEX, présents dans l'éssence. Les premières analises du potenciel de formation de biofilm, ont montré la haute capacité de la celule á former cette structure, y compris sans avoir de differences dans la formation du biofilm,entre en présence et absence d'éssence commerciale. Les résultats suggerent que Burkholderia SMF 090 a un haut potenciel de biodégradation des composés BTEX presents dans l'éssence, pouvant dans le futur être etudié comme possible alternative biotecnologique a des fins bioremédiation.

BANDEIRA, Tereza de Jesus Pinheiro Gomes. Caracterização fenotípica e genotípica, sensibilidade a antimicrobianos e detecção de genes de virulência de cepas clínicas e ambientais de Burkholderia pseudomallei. 2011. 151 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-07-08T16:20:33Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_tjpgbandeira.pdf: 2968543 bytes, checksum: 7ca158d99b2739cf86254cd483a4ca24 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-07-10T10:59:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_tjpgbandeira.pdf: 2968543 bytes, checksum: 7ca158d99b2739cf86254cd483a4ca24 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-10T10:59:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_tjpgbandeira.pdf: 2968543 bytes, checksum: 7ca158d99b2739cf86254cd483a4ca24 (MD5) Previous issue date: 2011 / Melioidose E UMA Doença infecciosa causada túmulo POR Burkholderia pseudomallei, um bacilo Gram-Negativo ENCONTRADO nenhum sozinho e na Água. A Doença endêmica e No Sudeste Asiático e hiperendêmica nenhum norte da Austrália, Onde a letalidade permanece com UMA taxa de 21%. No Brasil, è considerada UMA Doença emergente desde Marco de 2003. N.os ULTIMOS Oito Anos, 12 Casos ocorreram no Estado do Ceará e hum notificado Pelo Governo Holandês, POR SE TRATAR de hum turista Que Morreu de melioidose, APOS Visita ao Ceará. Em Razão da Ocorrência Clínica de melioidose e faça Isolamento de B. pseudomallei nenhum Ambiente do Estado do Ceará, Este Trabalho objetivou Estudar como cepas Clínicas e Ambientais de B. pseudomallei isoladas sem Estado não PERÍODO de 2003 a 2011, visando a identificar como cepas POR MÉTODOS fenotípicos e moleculares, determinar o Perfil de sensibilidade contra cinco Agentes antimicrobianos (amoxicilina / clavulanato, Ceftazidima, imipenem, doxicilina e sulfametoxazol / trimetoprim), Realizar uma genotipagem das cepas Pela amplificação aleatória de DNA polimórfico - Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), detectar o tipo de virulência Três Sistema de Secreção gene (TTSS), ALÉM de avaliar OS Aspectos clínico-epidemiológicos Que caracterizaram uma Emergência Desta Doença no Brasil. TODAS como 20 cepas (dez Clínicas e dez Ambientais) de B. pseudomallei FORAM precisamente identificadas Tanto Pela Metodologia VITEK2 ® Quanto Pelô sequenciamento da Região 16S fazer DNA, mostraram Resultado Negativo nenhum teste de assimilação de L-arabinose, e exibiram-se Positivas parágrafo fazer a detecção de genes de virulência TTSS. Como Concentrações inibitórias Mínimas (CIM), obtidas POR microdiluição los caldo Müeller-Hinton, demonstraram Opaco de Todos os Isolados (100%) sensíveis FORAM AO imipenem, à doxicilina e AO sulfametoxazol-trimetoprim, não entanto, parágrafo amoxicilina / clavulanato e Ceftazidima, um FOI sensibilidade de 80 e 90%, respectively. A Técnica de RAPD evidenciou UMA Variabilidade genética de 63% empreendedorismo como cepas de B. pseudomallei oriundas do Estado do Ceará, como cais Quais d'Orsay FORAM Agrupadas in Tres aglomerados Diferentes. Este Trabalho decerto contribuirá par o Conhecimento das Características fenotípicas e genotípicas das cepas de B. pseudomallei isoladas nenhuma Ceará e da atualização da Vigilância epidemiológica dos Casos de melioidose ocorridos no Estado, ALÉM de contribuir para à Conscientização dos Órgãos de Saúde competentes Pará a Inclusão fazer Ceará Como zona endêmica parágrafo ESTA enfermidade.

VALENTE, Livia Gurgel do Amaral. Identificação de melanina em cepas clínicas e ambientes de Burkholderia pseudomallei e atividade in vitro do farnesol como inibidor de ß-lactamases. 2012. 81 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-08-12T16:03:59Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_lgavalente.pdf: 2099115 bytes, checksum: 202d0f130cefb452d49f8b0f3f7f0594 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-08-12T16:04:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_lgavalente.pdf: 2099115 bytes, checksum: 202d0f130cefb452d49f8b0f3f7f0594 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-12T16:04:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_lgavalente.pdf: 2099115 bytes, checksum: 202d0f130cefb452d49f8b0f3f7f0594 (MD5) Previous issue date: 2012 / Burkholderia pseudomallei é um bacilo Gram-negativo causador da melioidose uma doença infecciosa severa e geralmente fatal, a qual pode ser adquirida através da inoculação, inalação e ingestão do microrganismo que se encontra distribuído no ambiente. No Brasil a melioidose é considerada uma doença emergente descrita pela primeira vez em 2003 no Nordeste brasileiro O presente estudo consistiu em identificar o gene hppD que codifica a produção de um precursor importante na síntese de melanina e avaliar fenotipicamente a produção do pigmento em cepas de B pseudomallei através de meios contendo substratos fenólicos. Aliado ao estudo foi realizada a comparação do perfil de sensibilidade e curva de morte entre cepas melanizadas e não melanizada ante ao imipenem além da avaliação da possível ação do sesquiterpeno farnesol como um inibidor de β-lactamases Os isolados utilizados no estudo pertencem ao Laboratório de Patógenos Reemergentes e Emergentes-LAPERE UFC Para o cumprimento da metodologia as cepas foram recuperadas do estoque realizado a extração de DNA e a identificação do gene hppD através de reação de PCR A expressão fenotípica de melanina foi avaliada através de subcultivos em meio Brain Heart infusion (BHI) acrescido de ácido caféico. O teste de sensibilidade com cepas melanizadas e não melanizadas foi realizado utilizando-se o teste de microdiluição em caldo padronizado pelo CLSI segundo documento M07-A8 A curva de morte foi realizada a partir da incubação do inóculo com imipenem no intervalo de 0,125 µg/ mL a 0,5 µg/ mL por 1 e 2 horas, seguida da contagem das colônias A avaliação do farnesol como um possível inibidor de β-lactamases foi realizada através da combinação in vitro do farnesol com antibióticos β-lactâmicos (amoxicilina ampicilina oxacilina imipenem amoxicilina-ácido clavulânico utilizando-se o teste de microdiluição em caldo. O gene hppD foi detectado em todas as cepas de B pseudomallei testadas além da produção de pigmento em meios contendo substratos fenólicos Em relação ao perfil de sensibilidade as cepas não melanizadas e melanizadas apresentaram o mesmo valor de CIM porém as cepas melanizadas demonstraram maior capacidade de sobrevivência quando em contato com a droga do que as cepas não melanizadas. Em relação ao farnesol todas as cepas testadas foram inibidas por este composto com CIM variando de 75 a 150µM Dentre as combinações dos β-lactâmicos testadas com farnesol, todas as drogas apresentaram redução estatisticamente significativa: amoxicilina (p=0,0001) amoxicilina-ácido clavulânico (p=0,0005), ampicilina (p=0,0026), oxacilina (p=0,0001) e imipenem (p=0,0105). Por fim as combinações com amicacina e gentamicina não apresentaram redução estatisticamente significativa pois os aminoglicosídeos praticamente repetiram seus valores quando combinados com farnesol Esse estudo abre perspectivas acerca de um novo fator de virulência melanina ainda não descrita para B pseudomallei, além do sesquiterpeno farnesol como um possível inibidor de β-latamases nessa espécie.

VIRGINIO, Camila Gomes. Aspectos fenotípicos de amostras de burkholderia pseudomallei isoladas de uma microepidemia no municípios de Tejuçuoca-CE. 2005. 136 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2005. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-01-04T13:45:00Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_cgvirgínio.pdf: 7687643 bytes, checksum: d6c0e4ff2f09282d3738c27cd4b0bc8f (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-02T13:40:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_cgvirgínio.pdf: 7687643 bytes, checksum: d6c0e4ff2f09282d3738c27cd4b0bc8f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-02T13:40:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_cgvirgínio.pdf: 7687643 bytes, checksum: d6c0e4ff2f09282d3738c27cd4b0bc8f (MD5) Previous issue date: 2005 / Burkholderia pseudomallei is a Gram-negative non-fermentative bacilli, environmental saprophyte able to cause melioidosis on men and animals. The disease is considered endemic in several countries, especially in Thailand and Australia. The bacteria was isolated and identified for the first time in Brazil, february 2003, from four children that lived in a place called Tejuçuoca, Ceará. This work consists of the phenotypic characterization of 3 strains of B. pseudomallei isolated from the patients from Tejuçuoca. The main aim of this study is to compare the data from these samples with the ones from the literature. It was assessed: the colonies morphology in different culture mediums, assimilation of L-arabinose, manual and semi-automatized biochemical tests in API 20NE, antibacterial sensitivity test and diagnosis by PCR, from bacterial cultures. In the obtained results, it was observed the morphological pattern of B. pseudomallei in blood agar, chocolate, Ashdown, Mac Conkey, CLED and trypticase soy agar. The strains 1 and 3 were classified as mucoid and the strain 2 as wrinkled. The three strains had shown the usual phenotypic patterns of B. pseudomallei as much in biochemical manual tests: motility, growth at 42°C, positive oxidase and resistance to polimixin B, as in the API 20NE Diagnosis Kit. In this last one, there was difference in the esculin test among the strains, when the reading was carried out with 48 hours, which did not change on the final identification. All of the three strains were unable to metabolize the carbohydrate L-arabinose, when tested in minimum medium salts and API 20NE, which is a characteristic of virulent strains of B. pseudomallei and is also used to differ this species from B. thailandensis, that is able to use the carbohydrate. The three isolates had shown a poor sensitivity pattern from disk diffusion on TSA, which were resistant to gentamicin, cefalotin, ciprofloxacin (one strain presented intermediate resistance) and sulfa-trimethoprim; two strains presented intermediate sensitivity to ceftriaxone. All of them were sensitive to piperacilin-tazobactam, ticarcilin-clavulanate, ceftazidime, imipenem, tetracycline and chloramphenicol. A modified extraction protocol based on phenol-chloroform was used to obtain DNA and later to test it by PCR, which had shown a 718 bp product, what also confirmed the diagnosis of the organisms by molecular method. The study confirms the presence of B. pseudomallei in Brazil with similar phenotype to that described in the international literature. / A Burkholderia pseudomallei é um bacilo Gram-negativo não-fermentador, saprófita ambiental capaz de causar melioidose em homens e animais. A doença é considerada endêmica em diversos países, entre os quais destacam-se Tailândia e Austrália. Em fevereiro de 2003, ocorreu no Brasil, o primeiro isolamento e identificação da bactéria em quatro crianças da localidade de Tejuçuoca, Ceará. Este trabalho consiste na caracterização fenotípica de 3 amostras de B. pseudomallei originárias dos pacientes do município de Tejuçuoca, com o propósito de comparar os dados obtidos de tais amostras com os dados da literatura. Foram avaliados: morfologia das colônias em diferentes meios de cultivo, assimilação de L-arabinose, testes bioquímicos manuais e em sistema semi-automatizado API 20NE, teste de sensibilidade antibacteriano e diagnóstico por PCR, a partir de cultivos bacterianos. Nos resultados obtidos, foi observado o padrão morfológico característico de B. pseudomallei em ágar sangue, chocolate, Ashdown, Mac Conkey, CLED e tripticase soja. As amostras 1 e 3 foram classificadas como mucóides e a amostra 2 como rugosa. As três amostras apresentaram os padrões fenotípicos característicos de B. pseudomallei tanto nos testes bioquímicos manuais: motilidade, crescimento à 42ºC, oxidase positiva e resistência à polimixina B, como no Kit Diagnóstico API 20NE. Neste último, houve diferença na esculina entre as amostras, o que não interferiu no resultado final de identificação, quando a leitura foi realizada com 48h. Todas as três amostras foram incapazes de assimilar o carboidrato L-arabinose, quando testadas em meio sais mínimo e API 20NE, característica de amostras virulentas de B. pseudomallei e utilizada também para diferenciar esta espécie da B. thailandensis, que é capaz de assimilar este carboidrato. O padrão de sensibilidade resultante do TSA em disco difusão apresentado pelas três amostras foi o característico da espécie B. pseudomallei. Os isolados foram resistentes à gentamicina, cefalotina, ciprofloxacina (1 amostra apresentou resistência intermediária) e sulfa-trimetoprim; 2 amostras apresentaram sensibilidade intermediária à ceftriaxona. Todas as três amostras foram sensíveis à piperacilina-tazobactam, ticarcilina-ácido clavulânico, ceftazidima, imipenem, tetraciclina e cloranfenicol. Com o protocolo fenol-clorofórmio modificado de extração de DNA, a PCR apresentou banda de 718 pb, o que confirmou o diagnóstico da bactéria também por método molecular. O estudo confirma a presença da B. pseudomallei em território brasileiro, com fenotipagem semelhante à descrita na literatura internacional.

Burkholderia pseudomallei et Burkholderia mallei sont respectivement les agents biologiques responsables de la mélioïdose et de la morve. Pour déterminer si les échecs thérapeutiques étaient dus à l'émergence d'une résistance acquise durant le traitement antibiotique, nous avons sélectionné des souches de Burkholderia thailandensis, modèle d'étude, B. pseudomallei et B. mallei, avec différents antibiotiques : le chloramphénicol, la doxycycline et le triméthoprime-sulfaméthoxazole. Les Burkholderia ont montré qu'elles étaient capables de développer une multirésistance in vitro en réponse à chaque antibiotique utilisé dans le traitement oral de la mélioïdose ou de la morve. Pour comprendre les mécanismes de résistance impliqués, nous avons étudié les aspects moléculaires et génétiques de la résistance chez B. thailandensis par des méthodes protéomiques et transcriptomiques. Nous avons développé une méthode pour quantifier l'expression des gènes de pompes d'efflux par RT-PCR quantitative après normalisation sur plusieurs gènes de référence. Ces méthodes nous ont permis d'identifier la surproduction séquentielle de trois pompes d'efflux de type RND : BpeAB-OprB, AmrAB-OprA et BpeEF-OprC, toutes induites par le chloramphénicol ou la doxycycline chez les souches multirésistantes. L'étude de mutants déficients en pompe d'efflux nous a permis de mieux appréhender les relations étroites entre ces trois pompes et a confirmé que l'efflux actif était le principal mécanisme impliqué cette résistance induite. / Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei are respectively the causative agents of melioidosis and glanders. To determine whether treatment failures were due to the emergence of acquired resistance during antibiotic treatment, we selected strains of B. pseudomallei, B. mallei, and Burkholderia thailandensis, used as a study model of these two pathogenic bacteria, with structurally unrelated antibiotics: chloramphenicol, doxycycline and trimethoprim-sulfamethoxazole. We showed that Burkholderia were able to develop multidrug resistance in vitro in response to each of theses antibiotics used in the oral treatment of melioidosis and glanders. To understand the resistance mechanisms involved, we studied the molecular and genetic aspects of resistance in B. thailandensis by proteomic and transcriptomic methods. We have developed a method to quantify efflux pumps gene expression by quantitative RT-PCR after normalization with several reference genes. These methods allowed us to identify sequential overproduction of three RND efflux pumps: BpeAB-OprB, AmrAB-OprA and BpeEF-OprC, all induced by chloramphenicol or doxycycline in multiresistant strains. The study of mutants respectively defective in one of these efflux pumps has allowed us to better understand the close relationship between these three pumps and confirmed that active efflux acted as a major mechanism involved in the induced resistance.

Devido à expansão da cultura canavieira, e aos altos custos dos insumos agrícolas, buscam-se novas formas de manejo do solo dentre elas o uso de substancias húmicas. Apesar disso os produtores aliam as técnicas alternativas as tradicionais como o uso do fipronil, um inseticida fenil - pirazólico muito utilizado na cultura de cana-de-açúcar. Apesar desta prática, pouco se sabe como ocorre à degradação biótica do fipronil, fipronil-sulfeto e fipronil sulfona, quando se utiliza as substâncias húmicas como forma de adubação. Por esse motivo o objetivo deste trabalho foi avaliar a degradação biológica do fipronil quando se utiliza substâncias húmicas. Para este estudo, empregou-se um método indireto de extração de DNA do solo, onde as bactérias foram cultivadas em meio contendo apenas água estéril e fipronil e posteriormente seu DNA foi extraído, fez-se a PCR utilizando o primer 27F/1100R e o produto da PCR foi clonado e sequenciado; as bactérias identificadas estão afiliadas aos gêneros: Clostridium sp, Bdellovibrio sp, Flavisolibacter sp, Burkholderia sp e Herbaspirillum sp. O gênero selecionado para o estudo foi afiliada a Burkholderia sp, devido a seu potencial de degradação citado na literatura. Adquiriu-se uma cepa pura de Burkholderia thailandensis Para determinação do fipronil e seus metabólitos, fipronil sulfeto e fipronil sulfona validou-se o método QuEChERS GC- MS que resultou nas seguintes condições: limites de detecção e quantificação foram de 0,06 mgL-1 0,25 mgL-1 respectivamente, a linearidade foi de 0,99, a precisão foi em torno de 10,9 a 7,3% para o nível baixo e 1,84 a 1,24% para o nível mais alto. Calculou-se a recuperação do método de extração que variou entre 78 e 98%, Em seguida montou-se oito tratamentos os quais foram medidos a degradação do fipronil frente a utilização de SH que obteve-se o seguintes resultados: A Burkholderia thailandensis degradou cerca de 0,75 mg L-1 de fipronil com ou sem a presença das SH adicionada no solo de estudo; não foi possível quantificar os produtos de degradação pois ambos (fipronil sulfeto e fipronil sulfona) ficaram abaixo do LOQ do método. / Due to the expansion of sugar cane, and the high costs of agricultural inputs, currently looking up forms new of soil management among them the use of humic substances. Nevertheless producers combine traditional and alternative techniques, for example addition of fipronil to humic substances. Fipronil is an insecticide phenyl - pyrazole widely used in cane sugar cultivation . Despite this practice, few is known about a biotic degradation of the fipronil, fipronil sulfide and fipronil sulfone, when using humic substances as fertilization. Therefore the objective of this study was to evaluate the biological degradation of fipronil when it used in humic substances. For this study, we used an indirect method of DNA extraction from the soil, where bacteria were cultured in medium containing only sterile water and fipronil. After, the DNA was extracted,a PCR was performing using primer 27F/1100Rr and the PCR product was cloned and sequenced. The bacteria identified were affiliated to the genus Clostridium sp., Bdellovibrio sp., Flavisolibacter sp., Burkholderia sp. and Herbaspirillum sp. The gene selected for the study was affiliated with Burkholderia sp due to its potential degradation reported in the literature. The study strain was acquired in public banks, and was selected to Burkholderia thailandensis. For the determination of fipronil and its metabolites, the method QuEChERS follow by analysis with GC-MS was validated to fipronil, fipronil sulfide, and fipronil sulfone. To this method was found the follow conditions: detection and quantitation limits were 0.06 mg L-1 0.25 mgL-1 respectively, the linearity was 0.99, the precision was about 10.9 to 7.3% for the lowest level and 1.84 to 1.24% for the highest level. We calculated the recovery of the extraction method which ranged between 78 and 98%. Then were assembled eight treatments, to evaluate the degradation of the fipronil and the formation of its two degradation products biotic, fipronil sulfide and fipronil sulfone, when using humic substances in fertilization. The Burkholderia thailandensis degraded approximately 0.75 mg L-1 fipronil with or without the presence of SH in the study soil, but it was not possible to quantify the degradation products of the fipronil (fipronil sulfide and fipronil sulfone) because both were detected but cannot be quantified because their values are below the limit of quantification of the method.

Achromobacter sp. e Burkholderia sp. são considerados patógenos problemáticos em pacientes com fibrose cística (FC), principalmente por apresentarem linhagens que podem ser transmissíveis e multidroga resistentes. Este trabalho teve como objetivo analisar isolados de Achromobacter e do complexo Burkholderia cepacia (CBc) de pacientes com FC atendidos no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP) e no Hospital das Clínicas da Faculdade de Ciências Médicas de Campinas (HCFCM-UNICAMP): identificar gênero/espécies; avaliar a sensibilidade a antimicrobianos; investigar relações genéticas entre os isolados por Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE); elucidar a taxonomia e epidemiologia molecular dos isolados por Multilocus Sequence Typing (MLST) e correlacionar os resultados com dados clínicos. Entre julho/2011 a setembro/2014, nos dois hospitais, as espécies mais prevalentes de Achromobacter e CBc foram A. xylosoxidans e B. vietnamiensis, respectivamente. Os antibióticos mais efetivos contra isolados de Achromobacter sp. de pacientes do HCFMRP-USP foram imipenem e meropenem e do HCFCM-UNICAMP foram meropenem e ceftazidima. Os antibióticos mais efetivos contra CBc de pacientes do HCFMRP-USP foram sulfametoxazol-trimetoprim e meropenem e do HCFCM-UNICAMP foram ceftazidima e meropenem. Houve suspeita de contaminação cruzada entre alguns pacientes que apresentaram isolados com o mesmo perfil de PFGE. No HCFMRP-USP, isolados de B. vietnamiensis de pacientes diferentes tiveram o mesmo perfil de PFGE e apenas 2 pacientes tinham infecção crônica. No HCFCM-UNICAMP, isolados de B. cenocepacia IIIB de 4 pacientes apresentaram o mesmo pulsotipo, porém nenhum dos pacientes tinha infecção crônica. Isolados de B. vietnamiensis e B. multivorans de pacientes diferentes no HCFCM-UNICAMP também apresentaram o mesmo pulsotipo, e apenas um paciente colonizado por B. multivorans tinha infecção crônica. No HCFCM-UNICAMP, isolados de Achromobacter apresentaram perfis únicos de PFGE, enquanto que no HCFMRP-USP houve suspeita de contaminação cruzada somente entre pacientes colonizados por A. xylosoxidans, sendo que 3 destes pacientes estavam com infecção crônica. Nos dois hospitais, 17 STs foram identificados em isolados do CBc, 14 deles pela primeira vez e 3 STs (ST17, ST369 e ST911) apresentaram distribuição intercontinental. Em isolados de pacientes dos dois hospitais foram identificados alguns STs em comum (STs 1056, 1057, 369 e 911), o que pode sugerir ancestral comum. No total, 6 STs diferentes foram identificados em isolados de A. xylosoxidans de pacientes do HCFMRP-USP, dos quais 3 STs apareceram pela primeira vez e os outros 3 STs apresentaram distribuição intercontinental. Nenhuma das espécies apresentou linhagens epidêmicas descritas. Os pacientes colonizados cronicamente por A. xylosoxidans apresentaram valores de escore de Shwachman, índice de massa corporal (IMC) e função pulmonar menos preservados e exacerbações ligeiramente mais frequentes do que pacientes colonizados por bactérias do CBc. Este estudo possibilitou a correta identificação dos patógenos proporcionando a adoção de medidas de controle mais efetivas e tratamentos mais adequados, além de atualização do banco de dados epidemiológicos, o que facilita a análise colaborativa multicêntrica e auxilia no controle de infecção global destes patógenos. / Achromobacter sp. and Burkholderia sp. are troublesome pathogens in cystic fibrosis (CF) patients, mainly because they may have transmissible and multidrug resistant strains. The aim of this study was to analyze the Achromobacter and Burkholderia cepacia complex (Bcc) isolates from CF patients treated at the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP) and Hospital das Clínicas da Faculdade de Ciências Médicas de Campinas (HCFCM-UNICAMP); to identify genus/species; to evaluate antimicrobial susceptibility; to investigate clonal relatedness among isolates by Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE); to elucidate taxonomy and molecular epidemiology of the isolates by Multilocus Sequence Typing (MLST), and to relate the results to clinical data. Between July/2011 and September/2014, in both hospitals, the most prevalent species of Achromobacter and Bcc were A. xylosoxidans and B. vietnamiensis, respectively. The most effective antibiotics against Achromobacter sp. isolates of patients from HCFMRP-USP were imipenem and meropenem, and from HCFCM-UNICAMP were meropenem and ceftazidime. The most effective antibiotics against Bcc isolates of patients from HCFMRP-USP were sulfamethoxazole-trimethoprim and meropenem, and from HCFCM-UNICAMP were ceftazidime and meropenem. Cross-contamination was suspected among some patients who presented isolates with the same PFGE profile. In HCFMRP-USP, isolates of B. vietnamiensis from different patients showed the same PFGE profile, and only 2 patients had chronic infection. In HCFCM-UNICAMP, isolates of B. cenocepacia IIIB of 4 patients showed the same pulsetype, but none of the patients had chronic infection. Isolates of B. vietnamiensis and B. multivorans from different patients from HCFCM-UNICAMP also showed the same pulsetype, and only one patient colonized by B. multivorans had chronic infection. In HCFCM-UNICAMP, Achromobacter isolates showed unique profiles of PFGE, whereas in HCFMRP-USP cross-contamination was only suspected among patients colonized by A. xylosoxidans, and 3 of these patients had chronic infection. In both hospitals, 17 STs were identified in Bcc isolates, 14 of them for the first time and 3 STs (ST17, ST369 and ST911) presented intercontinental distribution. In both hospitals, some common STs (STs 1056, 1057, 369 and 911) were identified, which may suggest a common ancestor. In total, 6 different STs were identified in A. xylosoxidans isolates of patients from HCFMRP-USP, of which 3 STs were identified for the first time, and the other 3 STs presented intercontinental distribution. None of the species presented described epidemic strains. Patients chronically colonized by A. xylosoxidans showed less preserved Shwachman score, body mass index (BMI) and lung function, and slightly more frequent exacerbations than patients colonized by Bcc bacteria. This study provided the correct identification of the pathogens, allowing the adoption of more effective control measures and adequate treatments, besides updating the epidemiological database, which facilitates the multicentric collaborative analysis and assists in the control of global infection of these pathogens

Devido à expansão da cultura canavieira, e aos altos custos dos insumos agrícolas, buscam-se novas formas de manejo do solo dentre elas o uso de substancias húmicas. Apesar disso os produtores aliam as técnicas alternativas as tradicionais como o uso do fipronil, um inseticida fenil - pirazólico muito utilizado na cultura de cana-de-açúcar. Apesar desta prática, pouco se sabe como ocorre à degradação biótica do fipronil, fipronil-sulfeto e fipronil sulfona, quando se utiliza as substâncias húmicas como forma de adubação. Por esse motivo o objetivo deste trabalho foi avaliar a degradação biológica do fipronil quando se utiliza substâncias húmicas. Para este estudo, empregou-se um método indireto de extração de DNA do solo, onde as bactérias foram cultivadas em meio contendo apenas água estéril e fipronil e posteriormente seu DNA foi extraído, fez-se a PCR utilizando o primer 27F/1100R e o produto da PCR foi clonado e sequenciado; as bactérias identificadas estão afiliadas aos gêneros: Clostridium sp, Bdellovibrio sp, Flavisolibacter sp, Burkholderia sp e Herbaspirillum sp. O gênero selecionado para o estudo foi afiliada a Burkholderia sp, devido a seu potencial de degradação citado na literatura. Adquiriu-se uma cepa pura de Burkholderia thailandensis Para determinação do fipronil e seus metabólitos, fipronil sulfeto e fipronil sulfona validou-se o método QuEChERS GC- MS que resultou nas seguintes condições: limites de detecção e quantificação foram de 0,06 mgL-1 0,25 mgL-1 respectivamente, a linearidade foi de 0,99, a precisão foi em torno de 10,9 a 7,3% para o nível baixo e 1,84 a 1,24% para o nível mais alto. Calculou-se a recuperação do método de extração que variou entre 78 e 98%, Em seguida montou-se oito tratamentos os quais foram medidos a degradação do fipronil frente a utilização de SH que obteve-se o seguintes resultados: A Burkholderia thailandensis degradou cerca de 0,75 mg L-1 de fipronil com ou sem a presença das SH adicionada no solo de estudo; não foi possível quantificar os produtos de degradação pois ambos (fipronil sulfeto e fipronil sulfona) ficaram abaixo do LOQ do método. / Due to the expansion of sugar cane, and the high costs of agricultural inputs, currently looking up forms new of soil management among them the use of humic substances. Nevertheless producers combine traditional and alternative techniques, for example addition of fipronil to humic substances. Fipronil is an insecticide phenyl - pyrazole widely used in cane sugar cultivation . Despite this practice, few is known about a biotic degradation of the fipronil, fipronil sulfide and fipronil sulfone, when using humic substances as fertilization. Therefore the objective of this study was to evaluate the biological degradation of fipronil when it used in humic substances. For this study, we used an indirect method of DNA extraction from the soil, where bacteria were cultured in medium containing only sterile water and fipronil. After, the DNA was extracted,a PCR was performing using primer 27F/1100Rr and the PCR product was cloned and sequenced. The bacteria identified were affiliated to the genus Clostridium sp., Bdellovibrio sp., Flavisolibacter sp., Burkholderia sp. and Herbaspirillum sp. The gene selected for the study was affiliated with Burkholderia sp due to its potential degradation reported in the literature. The study strain was acquired in public banks, and was selected to Burkholderia thailandensis. For the determination of fipronil and its metabolites, the method QuEChERS follow by analysis with GC-MS was validated to fipronil, fipronil sulfide, and fipronil sulfone. To this method was found the follow conditions: detection and quantitation limits were 0.06 mg L-1 0.25 mgL-1 respectively, the linearity was 0.99, the precision was about 10.9 to 7.3% for the lowest level and 1.84 to 1.24% for the highest level. We calculated the recovery of the extraction method which ranged between 78 and 98%. Then were assembled eight treatments, to evaluate the degradation of the fipronil and the formation of its two degradation products biotic, fipronil sulfide and fipronil sulfone, when using humic substances in fertilization. The Burkholderia thailandensis degraded approximately 0.75 mg L-1 fipronil with or without the presence of SH in the study soil, but it was not possible to quantify the degradation products of the fipronil (fipronil sulfide and fipronil sulfone) because both were detected but cannot be quantified because their values are below the limit of quantification of the method.