Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei cause the diseases melioidosis and glanders, respectively. These diseases are endemic mainly in southeastern Asia and northern Australia, but they also pose a bioterrorism threat in the developed world. These diseases have high mortality, partially due to the lack of vaccines and rapid, accurate diagnostic assays. The work discussed here represents a part of a larger project to develop a dependable diagnostic assay for use in both developing endemic areas and the developed world, as well as a subunit vaccine to protect against disease. In this study, several proteins from B. pseudomallei, B. mallei, and the closely related but less virulent B. thailandensis have been cloned, expressed and purified in order to develop highly sensitive and specific diagnostic reagents for the detection of B. pseudomallei and B. mallei in infected patient samples. Protein targets expressed in this study were also used in subunit vaccine development for melioidosis and glanders. / text

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / BactÃrias do gÃnero Burkholderia apresentam como uma das suas aplicaÃÃes biotecnolÃgicas a capacidade de biodegradar compostos xenobiÃticos recalcitrantes. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade da Burkholderia sp. SMF 07 tolerar e utilizar o fenol como Ãnica fonte de carbono e realizar a anÃlise proteÃmica desta bactÃria, em resposta ao fenol, com a finalidade de identificar proteÃnas diferencialmente expressas que estÃo relacionadas à biodegradaÃÃo do fenol, à resposta ao estresse ou ainda, que participem das vias metabÃlicas de produÃÃo de energia para as cÃlulas. A avaliaÃÃo da capacidade da Burkholderia sp. SMF 07 utilizar o fenol como Ãnica fonte de carbono foi realizada a partir na construÃÃo da curva de crescimento em meio mineral (BH). A fim de realizar a extraÃÃo das proteÃnas totais foi realizado o crescimento bacteriano em meio de cultivo TY (Triptone-Yeast Medium), suplementado ou nÃo com 1000 mg/L de fenol, incubado a 28ÂC. A extraÃÃo das proteÃnas totais foi feita apÃs as culturas atingirem o final da fase log do crescimento bacteriano (O.D entre 0,8 e 1,0 e 0,6 e 0,8, para as condiÃÃes controle e fenol, respectivamente). As proteÃnas foram quantificadas pelo mÃtodo de Bradford (1976) e a avaliaÃÃo da pureza das amostras proteicas foi realizada por SDS-PAGE. O mapa protÃico para cada condiÃÃo testada foi determinado a partir da eletroforese bidimensional (2-D). O ajuste das imagens dos gÃis bidimensionais, a detecÃÃo de spots protÃicos e a avaliaÃÃo dos dados para determinaÃÃo de variaÃÃes quantitativas e qualitativas dos spots foi feito pelo programa ImageMasterÂ. A identificaÃÃo das proteÃnas foi feita atravÃs do ExPASy Proteomics Server, utilizando os valores de pI e MW do spot. AtravÃs dos dados obtidos foi possÃvel observar proteÃnas diferencialmente expressas entre os grupos testados. Entre as proteÃnas que apresentaram expressÃo quantitativa aumentada na presenÃa do fenol destaca-se a 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolase, uma enzima envolvida na via meta de degradaÃÃo do fenol. Entre aquelas que apresentaram expressÃo reduzida na presenÃa do fenol se destacam aquelas envolvidas na biossÃntese de nucleotÃdeos e de Ãcidos graxos, molÃculas importantes para o desenvolvimento e manutenÃÃo da estrutura microbiana. As proteÃnas que tiveram sua expressÃo inibida na presenÃa do fenol estavam envolvidas principalmente na biossÃntese de aminoÃcidos, proteÃnas, lipÃdeos, ubiquinona, purinas e pirimidinas; alÃm de participarem do processamento do RNAt, sÃntese do peptideoglicano e na resposta ao estresse. Em conclusÃo, o estudo mostrou que a Burkholderia sp. SMF 07 nÃo foi capaz de utilizar o fenol como Ãnica fonte de carbono, mas apresentou capacidade de tolerar o fenol quando cultivada em meio nutritivo nas concentraÃÃes testadas. AtravÃs da anÃlise proteÃmica concluiu-se que o poluente alterou a expressÃo de proteÃnas importantes para o metabolismo e manutenÃÃo da estrutura celular. / Bacteria of the genus Burkholderia have as one of its biotechnological applications the ability to biodegrade recalcitrant xenobiotic compounds. Thus, this study aimed to evaluate the ability of Burkholderia sp. SMF 07 tolerate and using phenol as the sole carbon source and performing proteomic analysis of this bacterium, in response to phenol, in order to identify differentially expressed proteins that are related to biodegradation of phenol, the stress response or metabolic pathways involving the production of energy for cells. The evaluation of the capacity of Burkholderia sp. SMF 07 using phenol as the sole carbon source was based on the construction of the curve of growth in mineral medium (BH). For extraction of total proteins was performed bacterial growth in culture medium TY (Triptone-Yeast Medium), supplemented or not with 1000 mg/L phenol, incubated at 28ÂC. The extraction of total proteins was done after the cultures reached the end of the log phase of bacterial growth (O.D between 0.8 and 1.0 and 0.6 and 0.8 for the control conditions and phenol, respectively). The proteins were quantified by the Bradford method (1976) and assessment of protein purity of the samples was performed by SDS-PAGE. The protein map for each tested condition was determined from two-dimensional electrophoresis (2-D). The adjustment of two-dimensional images of the gels, the detection of protein spots, and data evaluation to determine quantitative and qualitative changes of spots was made by the ImageMaster  software. The identification of proteins was performed using the ExPASy Proteomics Server, using the values of pI and MW of spot. Through the data obtained was observed differentially expressed proteins between the groups tested. Among the proteins that showed increased expression quantitative in the presence of phenol is highlight 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase, an enzyme involved in the degradation meta pathway phenol. Among those that showed decreased expression in the presence of phenol are highlights those involved in the biosynthesis of nucleotides and fatty acids, molecules important to the development and maintenance of microbial structure. Proteins which have inhibited its expression in the presence of phenol were mainly involved in the biosynthesis of amino acids, proteins, lipids, ubiquinone, purines and pyrimidines; beyond participate processing of tRNA, peptidoglycan synthesis, and in the stress response. In conclusion, the study showed that Burkholderia sp. SMF 07 not been able to utilize phenol as the sole carbon source but showed the ability to tolerate phenol when grown in nutrient medium at the concentrations tested. Through proteomic analysis was concluded that the pollutant alter the expression of proteins important for metabolism and maintenance of cellular structure.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O tÃxon genÃrico Burkholderia apresenta grande diversidade metabÃlica, possibilitando que estas proteobactÃrias vivam numa variedade de habitats, dentre os quais destacamos o solo, Ãgua (incluindo Ãgua do mar), plantas, fungos, animais e atà mesmo seres humanos. Uma das aplicaÃÃes biotecnolÃgicas mais marcantes à a capacidade de promover a biodegradaÃÃo de poluentes. Assim, este estudo visou a identificaÃÃo do isolado de Burkholderia SMF 090, bem como a avaliaÃÃo do potencial na utilizaÃÃo da gasolina como fonte de carbono e a identificaÃÃo de vias metabÃlicas possivelmente envolvidas na degradaÃÃo dos componentes da gasolina atravÃs da realizaÃÃo de anÃlises proteÃmicas. A identificaÃÃo do isolado SMF 090 e anÃlise da filogenia molecular foi realizada pelo sequenciamento do gene 16S rRNA. Posteriormente, foram realizadas anÃlises de filogenia molecular e reconstruÃÃo de Ãrvores filogenÃticas com outras bactÃrias do gÃnero. Para a caracterizaÃÃo do perfil de crescimento do isolado SMF 090 foram realizadas curvas de crescimento em meio nutritivo (TY), meio sem fonte de carbono (BH), BH suplementado com gasolina comercial e BH suplementado com D-glicose. O estudo das proteÃnas diferencialmente expressas ocorreu atravÃs de eletroforese bidimensional, de espectrometria de massa e anÃlises de bioinfomÃtica. AtravÃs da anÃlise do 16S rDNA, sugeriu-se que SMF 090 està relacionada à Burkholderia sabiae Br3407 e ambos descendem de um ancestral comum recente. A bactÃria estudada foi capaz de crescer em meio mineral contendo gasolina como Ãnica fonte de carbono. Foi possÃvel observar proteÃnas diferencialmente expressas entre os grupos testados, as quais podem estar associadas ao metabolismo de degradaÃÃo de hidrocarbonetos. As anÃlises dos gÃis de 2DE e os dados de espectrometria de massas permitiram a identificaÃÃo de vÃrias proteÃnas das vias de catabolismo dos hidrocarbonetos aromÃticos monocÃclios e policÃclicos. Portanto, o estudo apresentou informaÃÃes relevantes sobre o metabolismo de Burkholdeiras como potenciais biodegradadoras de gasolina. / The generic taxon Burkholderia presents a high metabolic diversity that allows these protobacteria live in a wide range of habitats, among these are the soil, water (including sea water), plants, fungi, animals and even humans. A remarkable biotechnological application is the capacity to promote the pollutants biodegradation. Thus, this study aimed the identification of Burkhoderia SMF 090 isolate, as well the evaluation of its potential on the utilization of gasoline as a carbon source and the identification of metabolic pathways possibly involved in the degradation of gasoline on its components through realization of proteomic analysis. The identification of the SMF 090 isolate and the analysis of molecular phylogeny were carried out by 16S rRNA gene sequencing. In addition, the molecular phylogeny was analyzed and phylogenetic trees were reconstructed using other bacteria from the same genus. In order to characterize the growth pattern of SMF 090, bacterial growth curves were assessed using the media TY (a nutritive media), BH (a medium without carbon), BH plus commercial gasoline and BH plus D-glucose. The study of differentially expressed proteins was performed using bidimensional electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics analysis. After the 16S rRNA analysis was suggested that SMF 090 is related to Burkholderia sabiae Br3407 and both descended from a recent common ancestral. The strain grown in mineral media containing gasoline as the unique carbon source. Differentially expressed proteins were observed between the tested groups and these proteins may be associated to the metabolic degradation of hydrocarbons. The analysis of data provided by 2DE electrophoresis and mass spectrometry allowed the identification of various proteins related to the monocyclic and polycyclic aromatic hydrocarbons catabolism pathway. Therefore, this study showed relevant results about the growth of Burkholderia as a potential gasoline biodegradant.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A Burkholderia pseudomallei à um bacilo Gram-negativo nÃo-fermentador, saprÃfita ambiental capaz de causar melioidose em homens e animais. A doenÃa à considerada endÃmica em diversos paÃses, entre os quais destacam-se TailÃndia e AustrÃlia. Em fevereiro de 2003, ocorreu no Brasil, o primeiro isolamento e identificaÃÃo da bactÃria em quatro crianÃas da localidade de TejuÃuoca, CearÃ. Este trabalho consiste na caracterizaÃÃo fenotÃpica de 3 amostras de B. pseudomallei originÃrias dos pacientes do municÃpio de TejuÃuoca, com o propÃsito de comparar os dados obtidos de tais amostras com os dados da literatura. Foram avaliados: morfologia das colÃnias em diferentes meios de cultivo, assimilaÃÃo de L-arabinose, testes bioquÃmicos manuais e em sistema semi-automatizado API 20NE, teste de sensibilidade antibacteriano e diagnÃstico por PCR, a partir de cultivos bacterianos. Nos resultados obtidos, foi observado o padrÃo morfolÃgico caracterÃstico de B. pseudomallei em Ãgar sangue, chocolate, Ashdown, Mac Conkey, CLED e tripticase soja. As amostras 1 e 3 foram classificadas como mucÃides e a amostra 2 como rugosa. As trÃs amostras apresentaram os padrÃes fenotÃpicos caracterÃsticos de B. pseudomallei tanto nos testes bioquÃmicos manuais: motilidade, crescimento à 42ÂC, oxidase positiva e resistÃncia à polimixina B, como no Kit DiagnÃstico API 20NE. Neste Ãltimo, houve diferenÃa na esculina entre as amostras, o que nÃo interferiu no resultado final de identificaÃÃo, quando a leitura foi realizada com 48h. Todas as trÃs amostras foram incapazes de assimilar o carboidrato L-arabinose, quando testadas em meio sais mÃnimo e API 20NE, caracterÃstica de amostras virulentas de B. pseudomallei e utilizada tambÃm para diferenciar esta espÃcie da B. thailandensis, que à capaz de assimilar este carboidrato. O padrÃo de sensibilidade resultante do TSA em disco difusÃo apresentado pelas trÃs amostras foi o caracterÃstico da espÃcie B. pseudomallei. Os isolados foram resistentes à gentamicina, cefalotina, ciprofloxacina (1 amostra apresentou resistÃncia intermediÃria) e sulfa-trimetoprim; 2 amostras apresentaram sensibilidade intermediÃria à ceftriaxona. Todas as trÃs amostras foram sensÃveis à piperacilina-tazobactam, ticarcilina-Ãcido clavulÃnico, ceftazidima, imipenem, tetraciclina e cloranfenicol. Com o protocolo fenol-clorofÃrmio modificado de extraÃÃo de DNA, a PCR apresentou banda de 718 pb, o que confirmou o diagnÃstico da bactÃria tambÃm por mÃtodo molecular. O estudo confirma a presenÃa da B. pseudomallei em territÃrio brasileiro, com fenotipagem semelhante à descrita na literatura internacional. / Burkholderia pseudomallei is a Gram-negative non-fermentative bacilli, environmental saprophyte able to cause melioidosis on men and animals. The disease is considered endemic in several countries, especially in Thailand and Australia. The bacteria was isolated and identified for the first time in Brazil, february 2003, from four children that lived in a place called TejuÃuoca, CearÃ. This work consists of the phenotypic characterization of 3 strains of B. pseudomallei isolated from the patients from TejuÃuoca. The main aim of this study is to compare the data from these samples with the ones from the literature. It was assessed: the colonies morphology in different culture mediums, assimilation of L-arabinose, manual and semi-automatized biochemical tests in API 20NE, antibacterial sensitivity test and diagnosis by PCR, from bacterial cultures. In the obtained results, it was observed the morphological pattern of B. pseudomallei in blood agar, chocolate, Ashdown, Mac Conkey, CLED and trypticase soy agar. The strains 1 and 3 were classified as mucoid and the strain 2 as wrinkled. The three strains had shown the usual phenotypic patterns of B. pseudomallei as much in biochemical manual tests: motility, growth at 42ÂC, positive oxidase and resistance to polimixin B, as in the API 20NE Diagnosis Kit. In this last one, there was difference in the esculin test among the strains, when the reading was carried out with 48 hours, which did not change on the final identification. All of the three strains were unable to metabolize the carbohydrate L-arabinose, when tested in minimum medium salts and API 20NE, which is a characteristic of virulent strains of B. pseudomallei and is also used to differ this species from B. thailandensis, that is able to use the carbohydrate. The three isolates had shown a poor sensitivity pattern from disk diffusion on TSA, which were resistant to gentamicin, cefalotin, ciprofloxacin (one strain presented intermediate resistance) and sulfa-trimethoprim; two strains presented intermediate sensitivity to ceftriaxone. All of them were sensitive to piperacilin-tazobactam, ticarcilin-clavulanate, ceftazidime, imipenem, tetracycline and chloramphenicol. A modified extraction protocol based on phenol-chloroform was used to obtain DNA and later to test it by PCR, which had shown a 718 bp product, what also confirmed the diagnosis of the organisms by molecular method. The study confirms the presence of B. pseudomallei in Brazil with similar phenotype to that described in the international literature.

Achromobacter sp. e Burkholderia sp. são considerados patógenos problemáticos em pacientes com fibrose cística (FC), principalmente por apresentarem linhagens que podem ser transmissíveis e multidroga resistentes. Este trabalho teve como objetivo analisar isolados de Achromobacter e do complexo Burkholderia cepacia (CBc) de pacientes com FC atendidos no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP) e no Hospital das Clínicas da Faculdade de Ciências Médicas de Campinas (HCFCM-UNICAMP): identificar gênero/espécies; avaliar a sensibilidade a antimicrobianos; investigar relações genéticas entre os isolados por Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE); elucidar a taxonomia e epidemiologia molecular dos isolados por Multilocus Sequence Typing (MLST) e correlacionar os resultados com dados clínicos. Entre julho/2011 a setembro/2014, nos dois hospitais, as espécies mais prevalentes de Achromobacter e CBc foram A. xylosoxidans e B. vietnamiensis, respectivamente. Os antibióticos mais efetivos contra isolados de Achromobacter sp. de pacientes do HCFMRP-USP foram imipenem e meropenem e do HCFCM-UNICAMP foram meropenem e ceftazidima. Os antibióticos mais efetivos contra CBc de pacientes do HCFMRP-USP foram sulfametoxazol-trimetoprim e meropenem e do HCFCM-UNICAMP foram ceftazidima e meropenem. Houve suspeita de contaminação cruzada entre alguns pacientes que apresentaram isolados com o mesmo perfil de PFGE. No HCFMRP-USP, isolados de B. vietnamiensis de pacientes diferentes tiveram o mesmo perfil de PFGE e apenas 2 pacientes tinham infecção crônica. No HCFCM-UNICAMP, isolados de B. cenocepacia IIIB de 4 pacientes apresentaram o mesmo pulsotipo, porém nenhum dos pacientes tinha infecção crônica. Isolados de B. vietnamiensis e B. multivorans de pacientes diferentes no HCFCM-UNICAMP também apresentaram o mesmo pulsotipo, e apenas um paciente colonizado por B. multivorans tinha infecção crônica. No HCFCM-UNICAMP, isolados de Achromobacter apresentaram perfis únicos de PFGE, enquanto que no HCFMRP-USP houve suspeita de contaminação cruzada somente entre pacientes colonizados por A. xylosoxidans, sendo que 3 destes pacientes estavam com infecção crônica. Nos dois hospitais, 17 STs foram identificados em isolados do CBc, 14 deles pela primeira vez e 3 STs (ST17, ST369 e ST911) apresentaram distribuição intercontinental. Em isolados de pacientes dos dois hospitais foram identificados alguns STs em comum (STs 1056, 1057, 369 e 911), o que pode sugerir ancestral comum. No total, 6 STs diferentes foram identificados em isolados de A. xylosoxidans de pacientes do HCFMRP-USP, dos quais 3 STs apareceram pela primeira vez e os outros 3 STs apresentaram distribuição intercontinental. Nenhuma das espécies apresentou linhagens epidêmicas descritas. Os pacientes colonizados cronicamente por A. xylosoxidans apresentaram valores de escore de Shwachman, índice de massa corporal (IMC) e função pulmonar menos preservados e exacerbações ligeiramente mais frequentes do que pacientes colonizados por bactérias do CBc. Este estudo possibilitou a correta identificação dos patógenos proporcionando a adoção de medidas de controle mais efetivas e tratamentos mais adequados, além de atualização do banco de dados epidemiológicos, o que facilita a análise colaborativa multicêntrica e auxilia no controle de infecção global destes patógenos. / Achromobacter sp. and Burkholderia sp. are troublesome pathogens in cystic fibrosis (CF) patients, mainly because they may have transmissible and multidrug resistant strains. The aim of this study was to analyze the Achromobacter and Burkholderia cepacia complex (Bcc) isolates from CF patients treated at the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP) and Hospital das Clínicas da Faculdade de Ciências Médicas de Campinas (HCFCM-UNICAMP); to identify genus/species; to evaluate antimicrobial susceptibility; to investigate clonal relatedness among isolates by Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE); to elucidate taxonomy and molecular epidemiology of the isolates by Multilocus Sequence Typing (MLST), and to relate the results to clinical data. Between July/2011 and September/2014, in both hospitals, the most prevalent species of Achromobacter and Bcc were A. xylosoxidans and B. vietnamiensis, respectively. The most effective antibiotics against Achromobacter sp. isolates of patients from HCFMRP-USP were imipenem and meropenem, and from HCFCM-UNICAMP were meropenem and ceftazidime. The most effective antibiotics against Bcc isolates of patients from HCFMRP-USP were sulfamethoxazole-trimethoprim and meropenem, and from HCFCM-UNICAMP were ceftazidime and meropenem. Cross-contamination was suspected among some patients who presented isolates with the same PFGE profile. In HCFMRP-USP, isolates of B. vietnamiensis from different patients showed the same PFGE profile, and only 2 patients had chronic infection. In HCFCM-UNICAMP, isolates of B. cenocepacia IIIB of 4 patients showed the same pulsetype, but none of the patients had chronic infection. Isolates of B. vietnamiensis and B. multivorans from different patients from HCFCM-UNICAMP also showed the same pulsetype, and only one patient colonized by B. multivorans had chronic infection. In HCFCM-UNICAMP, Achromobacter isolates showed unique profiles of PFGE, whereas in HCFMRP-USP cross-contamination was only suspected among patients colonized by A. xylosoxidans, and 3 of these patients had chronic infection. In both hospitals, 17 STs were identified in Bcc isolates, 14 of them for the first time and 3 STs (ST17, ST369 and ST911) presented intercontinental distribution. In both hospitals, some common STs (STs 1056, 1057, 369 and 911) were identified, which may suggest a common ancestor. In total, 6 different STs were identified in A. xylosoxidans isolates of patients from HCFMRP-USP, of which 3 STs were identified for the first time, and the other 3 STs presented intercontinental distribution. None of the species presented described epidemic strains. Patients chronically colonized by A. xylosoxidans showed less preserved Shwachman score, body mass index (BMI) and lung function, and slightly more frequent exacerbations than patients colonized by Bcc bacteria. This study provided the correct identification of the pathogens, allowing the adoption of more effective control measures and adequate treatments, besides updating the epidemiological database, which facilitates the multicentric collaborative analysis and assists in the control of global infection of these pathogens

The phenylacetic acid degradation pathway of Burkholderia cenocepacia is necessary for full pathogenicity of B. cenocepacia in nematode; however, the reasons of such requirements are unknown. Unlike wild type B. cenocepacia, a deletion mutant of the phenylacetyl-CoA monooxygenase complex (ΔpaaABCDE) released phenylacetic acid extracellularly in conditions that allow infection in Caenorhabditis elegans. Addition of phenylacetic acid further decreased the pathogenicity of the ΔpaaABCDE, which cannot metabolize phenylacetic acid, but did not affect the wild type, due to phenylacetic acid consumption. Detection of acyl-homoserine lactones was reduced in spent medium from ΔpaaABCDE compared to that of the wild type strain. Phenotypes repressed in ΔpaaABCDE, protease activity and pathogenicity against C. elegans, increased with the addition of exogenous N-octanoyl-L-homoserine lactone. Thus, it was demonstrated that the attenuated phenotype of B. cenocepacia ΔpaaABCDE is due to quorum sensing inhibition by release of phenylacetic acid, affecting N-octanoyl-L-homoserine lactone signaling. / October 2014

Thesis (Ph.D.) - James Cook University, 2004. / Typescript (photocopy) Bibliography: leaves 189-223.

MARTINS, M.G.Q. Biodegradação de ácido 2,4 - Diclorofenoxiacético por burkholderia sp. 2012. 113 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2012. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-10-26T20:18:20Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_mgqmartins.pdf: 2492565 bytes, checksum: 3b6832f0ed7442ae5b935515c41bb4af (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-10-26T20:18:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_mgqmartins.pdf: 2492565 bytes, checksum: 3b6832f0ed7442ae5b935515c41bb4af (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-26T20:18:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_mgqmartins.pdf: 2492565 bytes, checksum: 3b6832f0ed7442ae5b935515c41bb4af (MD5) Previous issue date: 2012 / Bacteria of the genus Burkholderia have the capacity to degrade various toxic and recalcitrant compounds. Based on the foregoing, this study used real-time PCR (qRT-PCR) and two-dimensional electrophoresis (2DE) to investigate the gene expression profiles tfdB related to biodegradation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and differentially expressed proteins qualitative and qualitative, respectively in the presence of 2,4-D Burkholderia sp. SMF07. In order to make the extraction of RNA and protein total bacterial growth was carried out in two TY culture media (Tryptone-Yeast Medium), a control and the other being supplemented with 1 mg / mL 2,4-D, both were incubated at 28 ° C. RNA extraction and total proteins was done after addition of the pollutant in time of 15 minutes, 1, 2, 3 and 5 hours and during the log phase bacterial growth, respectively. The quality of total RNA was measured by the integrity of the fragments of ribosomal RNA (rRNA) checked by electrophoresis on 1.2% agarose gel and the ratio between the absorbances at 260 nm and 280 nm. For quantitative and qualitative analysis of proteins, the method of Bradford and SDS-PAGE, respectively. The synthesis of complementary DNA (cDNA) was determined from the total RNA using the enzyme reverse transcriptase (Superscript III, Invitrogen) using random primers and 6-mer (Invitrogen). Relative expression of the gene was performed using tfdB qRT Power-PCR using SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems) and using the 16S rRNA gene as housekeeping. The synthesized cDNA was used as template DNA. Comparative analysis of qRT-PCR was performed by 2-ΔΔCT method. The total proteins extracted from the two-dimensional map was determined for each reference condition. The adjustment of the two-dimensional images of the gels, the detection of protein spots and evaluate data to determine quantitative and qualitative variations, molecular mass (MM) and isoelectric point (pI) of the spots was done by the program ImageMaster®. Proteins differentially expressed quantitatively and qualitatively in the presence of 2,4-D were identified using the values of pI and MM of the spot against a database of proteins available in UniProt ExPASy server. According to this work, the gene expression tfdB significantly increased 200% over the control after one hour of induction of the abovementioned herbicides. The mean number of spots of replication of protein was 836 2DE gel (control) and 803 (treatment). The greater abundance of proteins was observed in the 2DE gels in pH range 5-6 with MM between 20 and 40 quilodalton (kDa). It was verified in 2DE gels differentially expressed proteins quantitatively and qualitatively to the stress condition in response to bacterial 2,4-D compared to control. Most of these identified proteins belong to molecular function: hydrolase or transferase, expressed different quantitative and qualitative. For these reasons, the strain of Burkholderia sp. SMF07 introduced tfdB also the gene expression level was increased and it was possible to detect differentially expressed proteins qualitatively and quantitatively to grow in medium containing 2,4-D, indicating the importance of these bacteria on the biodegradation of the pollutant. In accordance with these data, we conclude that strain Burkholderia sp. SMF07 tfdB introduced gene, which demonstrated high expression in a medium containing 2,4-D. Adicionadamente, were differentially expressed proteins in medium supplemented above, indicating the importance of these bacteria as a biotechnological tool for the biodegradation potential of this pollutant / Bactérias do gênero Burkholderia apresentam capacidade de degradar diversos compostos tóxicos e recalcitrantes. Com base no exposto, neste estudo foi utilizado PCR em tempo real (qRT-PCR) e eletroforese bidimensional (2DE) para investigar os perfis de expressão do gene tfdB relacionado a biodegradação de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e proteínas diferencialmente expressas qualitativa e qualitativa, respectivamente na presença de 2,4-D por Burkholderia sp. SMF07. A fim de fazer a extração de RNA e proteínas totais foi realizado o crescimento bacteriano em dois meios de cultivo TY (Triptone-Yeast Medium), sendo um controle e o outro suplementado com 1 mg/mL de 2,4-D, ambos foram incubados a 28 ºC. A extração de RNA e proteínas totais foi feita após a adição do poluente no tempo de 15 minutos, 1, 2, 3 e 5 horas e durante a fase log do crescimento bacteriano, respectivamente. A qualidade do RNA total foi mensurada pela integridade dos fragmentos de RNA ribossômico (rRNA) verificado por eletroforese em gel de agarose 1,2% e pela relação entre as absorbâncias a 260 nm e 280 nm. Para análise quantitativa e qualitativa das proteínas foi utilizado o método de Bradford e SDS-PAGE, respectivamente. A síntese do DNA complementar (cDNA) foi realizada a partir do RNA total extraído utilizando a enzima de transcrição reversa (Superscript III, Invitrogen) e empregando iniciadores randômicos 6-mer (Invitrogen). A expressão relativa do gene tfdB foi feita através qRT-PCR utilizando Power SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems) e empregando o gene 16S rRNA como housekeeping. O cDNA sintetizado foi empregado como DNA template. A análise comparativa da qRT-PCR foi feita pelo método 2-ΔΔCT. A partir das proteínas totais extraídas foi determinado o mapa bidimensional de referência para cada condição. O ajuste das imagens dos géis bidimensionais, a detecção de spots protéicos e a avaliação dos dados para determinação de variações quantitativas e qualitativas, massa molecular (MM) e ponto isoelétrico (pI) dos spots foi feito pelo programa ImageMaster®. Proteínas diferencialmente expressas quantitativamente e qualitativamente na presença de 2,4-D foram identificadas utilizando os valores de pI e MM do spot contra um banco de dados de proteínas UniProt disponível no servidor ExPASy. De acordo com esse trabalho, a expressão do gene tfdB aumentou significativamente 200% em relação ao controle após 1 hora de indução com o supracitado herbicida. O número médio de spots protéicos das replicas dos géis 2DE foi de 836 (controle) e 803 (tratamento). A maior abundância de proteínas foi observada nos géis 2DE na faixa de pH de 5-6 com MM entre 20 e 40 quilodalton (kDa). Foi possível verificar nos géis 2DE proteínas diferencialmente expressas quantitativamente e qualitativamente para a condição de estresse bacteriano em reposta ao 2,4-D em relação ao controle. A maioria dessas proteínas identificadas pertence às funções moleculares: transferase ou hidrolase, diferentes expressas quantitativas e qualitativas. De acordo com os presentes dados, conclui-se que a cepa de Burkholderia sp. SMF07 apresenta o gene tfdB, o qual demostrou seu nível de expressão aumentado em meio contendo 2,4-D. Adicionadamente, houve proteínas diferencialmente expressas no referido meio suplementado, indicando a importância desta bactéria como ferramenta biotecnológica potencial para a biodegradação deste poluente.

VASCONCELOS, D. C. Efeito da prometazina combinada aos antibióticos clássicos frente à forma planctônica e ao biofilme de Burkholderia pseudomallei. 2015. 84 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-01-20T14:13:27Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_dcvasconcelos.pdf: 2600778 bytes, checksum: 517035433406fc9bf380fa7e591e303e (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-01-20T14:13:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_dcvasconcelos.pdf: 2600778 bytes, checksum: 517035433406fc9bf380fa7e591e303e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-20T14:13:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_dcvasconcelos.pdf: 2600778 bytes, checksum: 517035433406fc9bf380fa7e591e303e (MD5) Previous issue date: 2015-11-13 / Among the defense mechanisms employed by Burkholderia pseudomallei are the expression of efflux pumps such as BpeAB-OprB, AmrAB-OprA and BpeEF-OprC, which are responsible for resistance to aminoglycosides, macrolides, fluoroquinolones and sulfonamides. It is therefore necessary to find adjuvants able to minimize this resistance. In this context, the phenothiazines stand out for inhibiting those pumps. This study evaluated the in vitro inhibitory activity of promethazine alone or in combination with amoxicillin, amoxicillin/clavulanate, erythromycin, sulfamethoxazole/trimethoprim, ciprofloxacin or gentamicin against B. pseudomallei in planktonic and biofilm form. The structure of B. pseudomallei biofilm, with and without addition of promethazine, was also investigated. The sensitivity was evaluated by the broth microdilution test. The minimum inhibitory concentration (MIC) was 0.78 mg / mL and the minimum biofilm elimination concentration (MBEC) was 0.78 to 3.12 mg / mL for promethazine. Moreover, the association with promethazine significantly reduced the MIC values for erythromycin, trimethoprim / sulfamethoxazole, gentamicin and ciprofloxacin, whereas the MBEC values of all antibiotics tested significantly declined in combination with promethazine (p <0.05). Through electron and confocal microscopy, we found that promethazine was able to disrupt the biofilm matrix, possibly facilitating penetration of antibiotics. Therefore, this study demonstrates the inhibitory activity of promethazine against B. pseudomallei and its synergistic effect with traditional antibiotics against biofilms. / Dentre os mecanismos de resistência demonstrados por Burkholderia pseudomallei, há o destaque para expressão de bombas de efluxo do tipo BpeAB-OprB, AmrAB-OprA e BpeEFOprC, que são responsáveis pela resistência a aminoglicosídeos, macrolídeos, fluoroquinolonas e sulfonamidas. Torna-se assim necessária a busca por adjuvantes capazes de minimizar essa resistência. Neste contexto, destacam-se as fenotiazinas, que inibem tais bombas. O presente estudo visou avaliar a atividade inibitória in vitro da prometazina isolada e em combinação com amoxicilina, amoxicilina/clavulanato, eritromicina, sulfametoxazol/trimetoprim, ciprofloxacina e gentamicina frente à forma planctônica e ao biofilme de B. pseudomallei. Foi investigada ainda a estrutura do biofilme de B. pseudomallei, com e sem adição de prometazina. A concentração inibitória mínima (CIM) foi de 0,78 mg / mL e a concentração eliminatória mínima em biofilme (CEMB) foi de 0,78 a 3,12 mg/mL para prometazina. Ademais, a associação com prometazina reduziu significativamente os valores de CIM para eritromicina, sulfametoxazol/trimetoprim, gentamicina e ciprofloxacina, enquanto que os valores de CEMB para todos os antibióticos testados apresentaram diminuição significativa em combinação com prometazina (p<0.05). Por meio de técnicas de microscopia confocal e eletrônica, observou-se que a prometazina foi capaz de desestruturar a matriz do biofilme, possivelmente auxiliando a penetração dos antibióticos. Deste modo, o presente estudo mostrou a atividade inibitória da prometazina ante a B. pseudomallei e seu efeito sinérgico com antibióicos clássicos frente aos biofilmes.

ROLIM, Dionne Bezerra. Burkholderia pseudomallei no estado do Ceará : caracterização de reservárias. 2009. 156 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-18T13:23:34Z No. of bitstreams: 1 2009_ tese_dbrolim.pdf: 3141910 bytes, checksum: 3afbdab5e7f63e729d72f0de548bd1f4 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-05-18T13:27:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_ tese_dbrolim.pdf: 3141910 bytes, checksum: 3afbdab5e7f63e729d72f0de548bd1f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-18T13:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_ tese_dbrolim.pdf: 3141910 bytes, checksum: 3afbdab5e7f63e729d72f0de548bd1f4 (MD5) Previous issue date: 2009 / Melioidosis, a disease caused by the Gram-negative bacteria Burkholderia pseudomallei, is endemic in southeast Asia and in Australia and shows a sporadic distribution in other parts of the world. The disease has been described in the Americas, it is an emergent illness in Brazil, as human cases are well documented in Ceará state. This research aims to better understand the ecology of the bacteria. The study was carried out by means of an environmental search for B. Pseudomallei in the ground of the cities Tejuçuoca and Banabuiú and by a epidemiological surveillance on the local rural population. For the environmental study, soil samples were collected monthly from the surface down to 40 cm depth from January to December 2007. Five sampling sites in each municipality were chosen near to the homes of people who had melioidosis. For the serological study, serum samples of 321 inhabitants of those areas were collected, and an inquiry was taken that included data about demography, previous illnesses and activities related to exposition to water and soil. Serological titers were determined by means of an immunoenzymatic test, using microplates adsorbed with filtered antigen of B. Pseudomallei. The bacteria was found in the soil of Tejuçuoca and Banabuiú municipalities in 4.3% (26/600) of the samples. Both regions show similar geoclimatic and environmental aspects, such as soil and vegetation, rainfall index, and temperatures. Detection of B. Pseudomallei occurred in tropical semi-arid climate, with low annual pluviometric index and a shrubby “caatinga” vegetation, showing an influence of local factors enabling the survival and multiplication of the microorganism. Epidemiological surveillance showed 51.27% (161/327) for the IgM isotype and 58.49% (186/317) for IgG isotype. Frequency of IgM titers was higher among children than adults, while IgG frequency raised with age. There was a significant association between agricultural occupations and IgM (44.15%, p<0.005) and IgG titers (44.15%, p<0.005) and between construction workers and IgG titers (84.6%, p=0.005). Most samples with high titers showed reactivity to the 33 and 45 kD bands, which correspond to the polysaccharide O of the liposaccharide chain of the bacteria. / A melioidose, uma enfermidade causada pelo bacilo Gram-negativo, Burkholderia pseudomallei, é endêmica no sudeste da Ásia e na Austrália e tem distribuição esporádica em outras partes do mundo. A doença é descrita nas Américas, sendo emergente no Brasil desde que casos em humanos são bem documentados no Estado do Ceará. Esta pesquisa pretendeu compreender melhor a ecologia da bactéria por meios da caracterização de suas reservárias. O estudo foi realizado em uma pesquisa ambiental de B. pseudomallei no solo dos Municípios de Tejuçuoca e Banabuiú e na realização de inquérito soro-epidemiológico para a população rural residente nesses locais. Para o estudo ambiental, foram coletadas amostras mensais de solo da superfície até 40 cm de profundidade durante o período de janeiro a dezembro do ano de 2007. Cinco sítios de coleta em cada município, delimitados na residência de pessoas que tiveram melioidose. Para a realização do estudo sorológico, foram coletadas amostras de soro de 321 residentes nessas áreas e efetivado inquérito, que incluiu informações sobre dados demográficos, história de doenças prévias e atividades com exposição relativas a solo e água. A determinação dos títulos sorológicos de anticorpos foi realizada mediante teste imunoenzimático, utilizando microplacas adsorvidas com antígeno filtrado de B. pseudomallei. A bactéria foi encontrada no solo dos Municípios de Tejuçuoca e Banabuiú em 4,3 % (26/600) das amostras investigadas. As duas regiões apresentaram aspectos geoclimáticos e componentes ambientais, como tipo de solo e vegetação, índice pluviométrico, temperatura similares entre si. A detecção de B. pseudomallei ocorreu em clima tropical semi-árido, com índice pluviométrico anual baixo e vegetação de caatinga arbustiva, demonstrando influência de fatores locais que facilitam a sobrevivência e multiplicação do microorganismo. O inquérito sorológico evidenciou 51, 27% (161/327) para oisotipo IgM e 58,49 % (186/317) para o isotipo IgG. A freqüência dos títulos de IgM foi maior em crianças do que em adultos, enquanto a freqüência de IgG aumentou com a idade. Houve associação significativa entre a ocupação em atividades de agricultura e os títulos de IgM (44.15%, p<0.005) e de IgG (44.15%, p<0.005) e entre trabalhadores de construção civil e os títulos de IgG (84.6%, , p=0.005). A maioria das amostras com títulos elevados mostrou reatividade com as banda na posição 33 a 45 kD que correspondem ao polissacarídeo O da cadeia do lipossacarídeo da bactéria.