Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei cause the diseases melioidosis and glanders, respectively. These diseases are endemic mainly in southeastern Asia and northern Australia, but they also pose a bioterrorism threat in the developed world. These diseases have high mortality, partially due to the lack of vaccines and rapid, accurate diagnostic assays. The work discussed here represents a part of a larger project to develop a dependable diagnostic assay for use in both developing endemic areas and the developed world, as well as a subunit vaccine to protect against disease. In this study, several proteins from B. pseudomallei, B. mallei, and the closely related but less virulent B. thailandensis have been cloned, expressed and purified in order to develop highly sensitive and specific diagnostic reagents for the detection of B. pseudomallei and B. mallei in infected patient samples. Protein targets expressed in this study were also used in subunit vaccine development for melioidosis and glanders. / text

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-08T14:30:49Z No. of bitstreams: 1 Jose Andreey Almeida Teles.pdf: 1056555 bytes, checksum: 1cd9d8325b9ce830ca450c9fea318bad (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-08T14:30:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jose Andreey Almeida Teles.pdf: 1056555 bytes, checksum: 1cd9d8325b9ce830ca450c9fea318bad (MD5) Previous issue date: 2012-02-13 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Glanders is an infectious-contagious disease of acute or chronic character which principally affects horses, causing enormous losses in the productive chain of this animal. To control the disease, the Ministry of Agriculture, Husbandry and Supply instituted mandatory sanitation measures in the entire national territory which include an official diagnosis through the complement fixation (CF) test, maleinization and sacrifice of the animals that are positive. Nowadays the kits used for the diagnosis of the disease are imported, making their routine application difficult and more expensive. The objective of this study was to standardize an indirect ELISA test, using the proteic extract of Burkholderia mallei isolated from a carrier horse in the state of Pernambuco. The samples were cultivated in 10% blood agar and incubated for 48h at 37ºC; later, one of the isolated colonies was characterized phenotypically and genotypically and immediately cultivated in brain heart infusion (BHI) for enrichment; then it was peaked (repicada) for the Dor-set Henley medium which was incubated at 37ºC under 60rpm for eight weeks. To standardize the test the Protein G Peroxidase Sigma Conjugate was used in the dilution of 1:90.000, with serums diluted in 1:100 and the antigen in 1:400. Sixty serums were used as negative controls, tested before the CF to determine the cutting point which was 0.042nm. After establishing the standardization, 300 samples were tested, of which 99% (297) were in agreement with the results obtained in the CF. At the end, of assay presented 100% sensibility and 98.2% specificity, with predictive (preditivo) positive and negative values of 97.7% and 100% respectively. The Kappa concordance test was 0.98 and the intra and interplac repeatability were 8.8% and 10.3% respectively. From the results obtained, it is possible to affirm that the indirect ELISA test can be used as an efficient diagnosis tool. However, more essays must be carried out to consolidate the reliability of this test. / O mormo é uma enfermidade infecto-contagiosa de caráter agudo ou crônico que acomete principalmente os equídeos, causando enormes prejuízos na cadeia produtiva do cavalo. Para controlar a enfermidade, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento instituiu medidas sanitárias obrigatórias em todo território nacional que incluem o diagnóstico oficial pela fixação do complemento (FC), maleinização e sacrifício dos animais positivos. Os kits atuais utilizados no diagnóstico da doença são importados, dificultando e encarecendo sua aplicação na rotina. Objetivou-se com este estudo padronizar um teste de ELISA indireto utilizando o extrato protéico de Burkholderia mallei isolada a partir de equídeo portador no estado de Pernambuco. As amostras foram cultivadas em ágar sangue 10%, incubada por 48h a 37ºC; posteriormente caracterizou-se fenotípica e genotipicamente uma das colônias isoladas, e em seguida a cultivou em BHI para enriquecimento; logo após, esta foi repicada para o meio Dor-set Henley o qual foi incubado a 37ºC sob 60rpm por oito semanas. Para padronização do teste utilizouse o conjugado Proteína G Peroxidase Sigma na diluição de 1:90.000, com soros diluídos em 1:100 e o antígeno em 1:400. Utilizou-se 60 soros como controle negativo testados frente à FC para determinação do ponto de corte o qual ficou em 0,042nm. Feitas as padronizações, foram testadas 300 amostras, onde 99% (297) foram concordantes com os resultados obtidos na FC. Ao final, o ensaio apresentou 100% de sensibilidade e 98,2% de especificidade, com valores preditivo positivo e negativo de 97,7% e 100% respectivamente. O teste de concordância kappa foi 0,98 e a repetibilidade intra e interplaca ficaram em 8,8% e 10,3% respectivamente. Diante dos resultados obtidos durante os ensaios, atesta-se que o teste de ELISA indireto pode ser utilizado como uma ferramenta de diagnóstico eficiente. Entretanto, mais ensaios devem ser realizados visando consolidar a confiabilidade do referido teste.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-06-12T14:14:59Z No. of bitstreams: 1 Cecilia Maria de Souza Leao e Silva.pdf: 1493945 bytes, checksum: 8bcc1ab9e28f749b73d9d7ff2cbaa285 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-12T14:16:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cecilia Maria de Souza Leao e Silva.pdf: 1493945 bytes, checksum: 8bcc1ab9e28f749b73d9d7ff2cbaa285 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Glanders is a highly contagious disease caused by Burkholderia mallei solipeds, a Gram - negative bacterium, not motility and aerobic coccobacillus, primarily infecting horses, donkeys and mules, though humans are considered accidental hosts . The Burkholderia mallei is listed in the list of the World Organisation for Animal Health (OIE) as an important public health disease, and due to its high potential for infection is referred to as a bioterrorism agent. According to the OIE comprises the serological diagnosis, allergy testing and bacterial isolation, and complement fixation, the official test to be performed for trade of animals. This method of diagnosis is recommended in Brazil by Instruction Nº 22, 16 of march of 2018, Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply by its high sensitivity and specificity. According to the OIE comprises the serological diagnosis, allergy testing and bacterial isolation, and complement fixation, the official test to be performed for trade of animals and bacterial isolation is considered gold test for identification of the agent. From the bacterial isolation the presence of Burkholderia was identified in 11 samples from epidemiological surveillance in the disease outbreaks. Sequencing demonstrated the circulation of the strains Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei in Brazilian territory where Mormo is present. The results show the differentiation of the circulating strains in the national territory and provides the knowledge of their epidemiology and virulence, later assisting in formulations of disease control and eradication measures / O Mormo constitui-se em uma doença altamente contagiosa dos solípedes causada pela Burkholderia mallei, uma bactéria Gram-negativa, não móvel e cocobacilo aeróbio, infectando primariamente equínos, asininos e muares, entretanto humanos são considerados hospedeiros acidentais. Burkholderia mallei está relacionada na lista de doenças da Organização Mundial para a Saúde Animal (OIE) como doença de importância de saúde pública, e devido ao seu alto potencial de infecção é referenciada como agente de bioterrorismo. De acordo com a OIE o diagnóstico compreende o teste sorológico, alérgico, isolamento bacteriano e testes de biologia molecular, sendo a fixação do complemento, o teste oficial a ser realizado para trânsito de animais. O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, através da Portaria Nº 22, de 16 de março de 2018 do Ministério, utiliza o teste da Fixação do Complemento e Elisa para triagem dos animais, sendo aqueles reagentes, testados posteriormente com o Western Blotting para confirmação. Neste trabalho, temos como objetivo identificar filogeneticamente as cepas circulantes em território nacional para os animais suspeitos de Mormo. A partir do isolamento bacteriano foram identificados 08 resultados compatíveis com a Burkholderia em amostras oriundas de vigilância epidemiológica em áreas focos da doença. O sequenciamento demonstrou a circulação das cepas Burkholderia pseudomallei e Burkholdeia mallei, em território brasileiro onde há presença do Mormo. Os resultados mostram a diferenciação das estirpes circulantes em território nacional e proporciona o conhecimento de sua epidemiologia e virulência, auxiliando posteriormente em formulações de medidas para controle e erradicação da enfermidade.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-02-22T14:08:58Z No. of bitstreams: 1 Paulo Castelo Branco de Gouveia Filho.pdf: 1165549 bytes, checksum: 16f843e48f36122b99e932a78381d634 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-22T14:08:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paulo Castelo Branco de Gouveia Filho.pdf: 1165549 bytes, checksum: 16f843e48f36122b99e932a78381d634 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Glanders is an often fatal zoonosis that affects horses, donkeys and mules, caused by Burkholderia mallei. Complement Fixation (CF) is the test prescribed by the World Organization for Animal Health (OIE) for its diagnosis. This work was conducted with the objective of evaluating the performance of CF using antigen produced with Brazilian strains of B. mallei (Biovetech, Recife Brazil) for the diagnosis of glanders compared to the antigen c.c.pro (GmbH, Oberdorla, Germany), which employs strains from Yugoslavia, India and Indonesia. The tests were performed in parallel using the protocol of cold incubation (4 ° C, 12 hours) of the serum, complement and antigen mixture. Of the 259 sera evaluated, 102 and 133 presented positive and negative results, respectively, in both tests. Twenty-four negative sera in the c.c.pro antigen test showed a positive result in the Biovetech antigen test. The calculated concordance index kappa was 0.81, considered almost perfect. / O mormo é uma zoonose frequentemente fatal que afeta equinos, asininos e muares, causada pela Burkholderia mallei. A Fixação do Complemento (FC) é o teste prescrito pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para seu o diagnóstico. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar o desempenho da FC empregando antígeno (Biovetech, Recife Brasil), produzido com cepas brasileiras de B. mallei para diagnóstico do mormo comparativamente ao antígeno c.c.pro (GmbH, Oberdorla, Alemanha), que emprega cepas da Iuguslávia, India e Indonésia. Os testes foram realizados em paralelo utilizando o protocolo de incubação a frio (4ºC, 12 horas) da mistura soro, complemento e antígeno. Dos 259 soros avaliados, 102 e 133 apresentaram resultado positivo e negativo, respectivamente, em ambos os testes. Vinte e quatro soros negativos no teste com antígeno c.c.pro apresentaram resultado positivo no teste com antígeno Biovetech. O índice de concordância ajustada kappa calculado foi 0,81, considerado quase perfeito.

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