Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:30:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337730.pdf: 3042114 bytes, checksum: b1db87538875d11b0c2804170ae64711 (MD5) Previous issue date: 2015 / Elevados níveis do aminoácido homocisteína (Hcy) são caracterizados como uma desordem metabólica denominada - hiperhomocisteinemia, a qual está envolvida com a ocorrência de anomalias congênitas. No sistema nervoso central (SNC) especificamente, esta condição está associada ao dano ao DNA, citotoxicidade neuronal, estresse oxidativo e prejuízo na síntese de neurotransmissores. Neste estudo, foi avaliado o efeito da dose alta de Hcy sobre a expressão das proteínas do ciclo celular, diferenciação e sobrevivência neural. Adicionalmente, investigamos o efeito da Hcy sobre a ultraestrutura das células do mesencéfalo em embriões de Gallus domesticus. Para tal, os embriões foram tratados com 48 horas de incubação (E2) onde foram organizados dois grupos experimentais: controle - 50 µl salina e Hcy - 20 µmol Hcy/50 µl salina. Os embriões foram analisados em duas idades - E6 e E10. Através da técnica de imuno-histoquímica, verificou-se uma redução significativa da proliferação celular na camada ependimária do mesencéfalo nos embriões em E6. A avaliação da expressão das demais proteínas envolvidas no ciclo celular como p53, p21, ciclina E e PCNA foi realizada pela combinação das técnicas de citometria de fluxo e imuno-histoquímica. O tratamento com Hcy induziu um aumento na expressão da proteína p53, e uma diminuição na expressão das proteínas p21 e ciclina E. Para as proteínas envolvidas no processo apoptótico, como BCL2 e BAK, não foram encontradas diferenças significativas nas duas idades analisadas. Na análise da diferenciação neural encontramos um aumento significativo na expressão da proteína GFAP em E6, o que caracterizamos como um processo de resposta celular denominado gliose reativa. Porém, esta resposta foi normalizada nos embriões na idade E10. Para a análise de sobrevivência neural, houve uma redução na expressão de BDNF e GDNF nos embriões expostos à Hcy na idade de E6. Por fim, através da técnica de microscopia eletrônica de transmissão, a análise ultraestrutural das células revelou alterações relacionadas ao espaço perinuclear e a formação anômala de membrana nos embriões expostos à Hcy nas idades de E6 e E10. Os resultados demonstram que, embora a Hcy não tenha induzido anomalias congênitas aparentes no SNC, o tratamento comprometeu os processos de proliferação celular, diferenciação glial e sobrevivência neural em G. domesticus.<br> / Abstract : High levels of amino acid homocysteine (Hcy) are characterized as a metabolic disorder named hyperhomocysteinemia, which is related to the occurrence of congenital anomalies. Specifically in the nervous system (CNS), this condition is associated with DNA damage, neuronal cytotoxicity, oxidative stress and impaired neurotransmitter synthesis. This study evaluated the effect of Hcy on the expression of cell cycle proteins, neuronal differentiation and survival. Additionally we investigated the effect of Hcy on the ultrastructure of midbrain in embryos aged E6 and E10. Thus, fertilized eggs of Gallus domesticus were treated at 48 hours of incubation (E2). Two experimental groups were organized: Control - 50 µl saline and Hcy - 20 µmol Hcy/50 µl saline. Embryos were analyzed at two embryonic ages - E6 and E10. Immunohistochemistry showed a significant reduction in expression cell proliferation in the ependymal layer of the midbrain at E6. Evaluation of expression of the other proteins involved in cell cycle such as p53, p21, cyclin E and PCNA were performed by the combination of flow cytometry and immunohistochemistry Hcy treatment induced an increase in p53 expression, and a decrease in the expression of the proteins p21 and cyclin E. Proteins involved in apoptosis, as BCL2 and BAK, not showed significant differences in both ages examined. The analysis of neural differentiation found a significant increase in protein expression GFAP at E6, which characterized as a process of cellular response termed reactive gliosis, but this response was standardized at E10. The quantification of the proteins neuronal survival BDNF and GDNF were quantified by flow cytometry and a significant reduction was found in embryos exposed to Hcy at E6, and this pattern is reversed at E10. Finally, by technique of transmission electron microscopy, the ultrastructural analysis of the cells showed changes related to the perinuclear space and the anomalous formation of membrane in embryos exposed to Hcy at E6 and E10. The results demonstrated that although Hcy did not induce congenital anomalies in the CNS, the treatment impaired the cellular processes of proliferation, differentiation glial and neuronal survival in G. domesticus.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337734.pdf: 3377384 bytes, checksum: 41c3085f595d79158f356834905b6bcd (MD5) Previous issue date: 2015 / Neste estudo, foi avaliado o potencial de um novo tratamento para lesões cutâneas baseado em dois componentes da engenharia de tecidos: células e arcabouço. Foi utilizado como arcabouço o hidrogel de carragenana, um polímero termo reversível de origem natural, associado a células estromais multipotentes (CEM) humanas no tratamento de lesões cutâneas em modelo murino. Inicialmente foi realizada a caracterização química da carragenana teste, obtida da alga Kappaphycus alvarezii cultivada em Florianópolis e da carragenana comercial (Sigma®). Os resultados mostraram que a carragenana teste é da classe kappa e apresenta porcentagem de sulfato semelhante à encontrada na carragenana comercial (Sigma®). Em seguida, foi avaliada a regeneração cutânea após 3, 7 e 14 dias de pós-operatório. Os resultados mostraram que o tratamento com CEM encapsuladas no hidrogel de carragenana teste (HCT) não altera a densidade do infiltrado leucocitário, a vascularização e a espessura da epiderme, além de aumentar o tecido de granulação e o depósito de colágeno quando comparado ao grupo sem tratamento (S/T). Além disso, o tratamento com CEM + HCT apresenta um menor infiltrado leucocitário, não altera a espessura do tecido de granulação e a vascularização, aumenta o depósito de colágeno quando comparado aos grupos HCT e CEM. Os resultados mostraram também que as células humanas permanecem no tecido cicatricial murino após 3 dias de pós-operatório. Em conclusão, este estudo mostrou que a carragenana obtida da alga K. alvarezii cultivada em Florianópolis representa um material de baixo custo com potencial para aplicações terapêuticas. Apesar da associação do hidrogel de carragenana teste com as CEM humanas não apresentar melhora quando comparado ao grupo sem tratamento, demostrou bons resultados quando comparado aos tratamentos isoladamente (grupos HCT e CEM) e representa uma abordagem nova, barata e potencialmente aplicável na engenharia de tecidos.<br> / Abstract : This study evaluated the potential of a new treatment for cutaneous wound based on two components of tissue engineering: cells and scaffold. Carrageenan hydrogel, a thermo reversible polymer of natural origin was used as a scaffold for the delivery of human multipotent stromal cells (MSC) for treatment of cutaneous wound in mice. At first the chemical characterization of native carrageenan obtained from seaweed Kappaphycus alvarezii grown in Florianopolis and commercial carrageenan (Sigma®) was carried out. The results showed that the native carrageenan belongs to the kappa class and shows a percentage of sulphate similar to that found in commercial sample. Evaluation of mouse skin wound healing was carried out by three steps: excisional wound in the dorsal region, treatment application and coating with Tegaderm® dressing. The results after 3, 7 and 14 days post-wounding showed that treatment with MSC encapsulated in native carrageenan hydrogel (NCH) does not change the density of the leukocyte infiltrate, vascularity and the thickness of the epidermis, and increase granulation tissue and collagen deposition when compared to the control untreated group. Furthermore, treatment with MSC encapsulated in NCH has a lower leukocyte infiltration, does not change the thickness of the granulation tissue, epidermis and vascularity, and increase collagen deposition when compared with MSC and NCH groups. In addition, human cells were detected in the scar tissue within 72 h post-wounding. In conclusion, this study showed that the carrageenan obtained of seaweed K. alvarezii cultivated in Florianopolis is a low cost material with potential therapeutic applications. The carrageenan hydrogel association with human MSC did not showed improvement compared to untreated group, but showed good results when compared to NCH and MSC groups. Thus, MSC encapsulated NCH represents a new approach applicable in tissue engineering.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337736.pdf: 2749407 bytes, checksum: 83fc4df7953d4ab58a50f4b11d22723d (MD5) Previous issue date: 2015 / Os efeitos neurotóxicos do metilmercúrio (MeHg) são bem conhecidos, mas informações mais detalhadas sobre a sua ação durante o desenvolvimento embrionário ainda são escassas. Este estudo teve como objetivo caracterizar os efeitos do MeHg sobre a organização ultraestrutural e sobre os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento das camadas da medula espinhal, utilizando embriões de Gallus domesticus como modelo. No terceiro dia embrionário (E3), os embriões foram tratados in ovo com uma única dose de cloreto de metilmercúrio (ClMeHg) (0,1 µg diluído em 50 µL de salina) e avaliados no décimo dia embrionário (E10). As análises morfológicas e morfométricas da medula espinhal foram realizadas a partir de secções histológicas coradas com HE. A localização e quantificação dos marcadores relacionados ao ciclo celular e dano ao DNA foram obtidos a partir de técnicas de imunohistoquímica e citometria de fluxo. Adicionalmente, foram realizados o ensaio de TUNEL, para a identificação de células em apoptose e análise por microscopia eletrônica de transmissão, para investigar possíveis danos ultraestruturais. Nossos resultados mostraram significativa deposição de mercúrio nas três camadas da medula espinhal, as quais apresentaram alteração na expressão de marcadores relacionados ao controle do ciclo celular, proliferação e morte celular. O aumentado número de células ?H2A.X-positivas observado na camada de manto indica dano ao DNA, o qual pode ser a causa do aumento na expressão de p21 e consequente retenção do ciclo celular na fase G1. A exposição ao MeHg também causou alterações nos componentes subcelulares das células da medula espinhal, principalmente nas mitocôndrias que apresentaram edemas e rupturas de membranas, além do aparecimento de formas mitocondriais incomuns cup-like (em cálice) e donut-like (em anel). Esses danos podem estar associados com o aumento da morte celular na camada do manto, a qual parece ser mais afetada após a exposição ao MeHg. A redução da proliferação associada a aumento da morte celular, mostraram que uma única dose de MeHg foi capaz de perturbar mecanismos celulares essenciais causando redução na espessura das camadas da medula espinhal. Do ponto de vista toxicológico, estes resultados são importantes porque mostram que a exposição ao MeHg, in ovo, altera a medula espinhal em desenvolvimento e pode levar a possíveis comprometimentos neuromotores na vida pós-natal.<br> / Abstract : The neurotoxic effects of methylmercury (MeHg) are well known, but more detailed information on its action during embryonic development are still scarce. This study aimed to characterize the effects of MeHg on the ultrastructural organization and on the molecular and cellular mechanisms involved in the development of spinal cord layers, using Gallus domesticus embryos as a model. At third embryonic day (E3), the embryos were treated in ovo with a single dose of methylmercury chloride (ClMeHg) (0.1 µg diluted in 50 µL saline) and evaluated at the tenth embryonic day (E10). The morphological and morphometric analyses of the spinal cord were taken from histological sections stained with HE. The localization and quantification of the cell cycle related and DNA damage markers were performed by immunohistochemistry and flow cytometry techniques. Additionally, TUNEL assay was used to apoptosis identification and transmission electron microscopy was conducted to investigate ultrastructural damage. Our results showed significant mercury deposition in the three spinal cord layers, which had alterations in expression of markers related to cell cycle control, proliferation and cell death. The increased number of ?H2A.X-positive cells observed in the mantle layer indicates DNA damage, which may be the cause of the p21 expression increased and consequent cell cycle arrest in G1 phase. The MeHg exposure also caused changes on subcellular components of spinal cord cells, mainly in mitochondria that showed swelling and membrane disruptions, beyond the appearance of unusual cup-like and donut-like shapes. These damage may be associated with increased cell death in the mantle layer, which appears to be the most affected layer after the MeHg exposure. The decreased cell proliferation associated to the increased cell death showed that a single dose of MeHg was able to disrupt essential cellular mechanisms, causing reduction in thickness of the spinal cord layers. From a toxicological point of view, these results are important because showed that in ovo MeHg exposure changes the developing spinal cord and can leads to potential neuromotor impairments in the postnatal life.