Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4455.pdf: 6484329 bytes, checksum: 0fee43406bc059da2f0e202d0d04a19e (MD5) Previous issue date: 2011-08-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cell migration, invasion of the surrounding tissues, blood vessels and proliferation are cellular processes involved in metastases. These events are mediated by integrins, adhesion receptors present on cell surfaces and responsible for the extracellular matrix and cells binding. Disintegrins, snake venoms polypeptides, are known to inhibit integrins action, and thus metastatic events such as cell migration. They also have influence on metallopeptidases activity, enzymes that cleave ECM components facilitating tumor cells invasion. DisBa-01 is a recombinant RGD disintegrin from Rhinocerophis alternatus (Bothrops alternatus) venom gland. In previous studies we have demonstrated that DisBa-01 binds to _v_3 integrin with high affinity and has an anti-metastatic activity. Therefore the aim of this study was to investigate the effect of DisBa-01 on migration and MMPs activities in fibroblasts and cell lines of breast cancer, MDA-MB-231, prostate, DU-145 and murine melanoma, B16F10. Transwell migration tests, wound healing and gelatin gel zymography were performed using DisBa-01 at concentrations of 10, 100, 500 and 1000 nM. Transwell migration was significantly inhibited in fibroblasts, MDA-MB-231 and DU-145 but had no effect on B16F10 cells, which had fibroblast conditioned medium as chemoattractant. In wound healing assays only DU-145 migration in a 1000nM concentration was significantly inhibited. Finally, zymography was performed using wound healing assay conditioned medium to analyze the presence of MMPs 2 and 9. In fibroblasts and B16F10 cells MMP-2 and MMPs 2 and 9 were decreased respectively. On the other hand, MDA-MB-231 cells showed increased MMP-9 activity, in all concentrations tested. Given the results, DisBa-01 can be used to build models for possible drugs rational design that may act in anti-metastatic therapy, in addition to its use as a research tool to elucidate integrins related mechanisms. / Uma série de processos celulares está envolvida na metástase, entre eles a migração e invasão celular dos tecidos vizinhos, vasos sanguíneos e proliferação. Esses eventos são mediados por integrinas, receptores de adesão, presentes nas superfícies celulares, responsáveis pela ligação das células com a matriz extracelular. As desintegrinas, polipeptídeos provenientes de venenos de serpentes, são conhecidos por inibir a ação das integrinas e, consequentemente, eventos como a migração, que ocorrem durante a metástase. Possuem ainda, influência sobre a atividade das metalopeptidases (MMPs), enzimas que clivam a MEC facilitando a invasão das células tumorais. A DisBa-01 é uma desintegrina recombinante que possui motivo RGD e é proveniente do veneno da Rhinocerophis alternatus (Bothrops alternatus). Estudos anteriores comprovaram sua alta afinidade pela integrina _v_3 e atividade anti-metastática in vivo. Portanto, o objetivo desse estudo foi investigar a ação da DisBa-01 sobre a migração e atividade das MMPs de fibroblastos e das linhagens de câncer de mama, MDA-MB-231, próstata, DU-145 e melanoma murino, B16F10. Foram realizados ensaios de migração em transwell, wound healing, e zimografia em gel de poliacrilamida acrescido de gelatina utilizando a DisBa-01 nas concentrações de 10, 100, 500 e 1000nM. A inibição da migração em transwell foi significativa nos fibroblastos, MDA-MB-231 e DU-145, porém não houve efeito sobre a linhagem B16F10, que teve como quimioatraente o meio condicionado de fibroblastos. Nos ensaios de wound healing apenas a concentração de 1000 nM da DU-145 foi inibida de forma significativa. Finalmente, a zimografia foi realizada utilizando meio condicionado de ensaios wound healing para analisar a presença das MMPs 2 e 9. Nos fibroblastos e B16F10 a atividade da MMP-2 e as MMPs 2 e 9 foram inibidas respectivamente. Enquanto a linhagem MDA-MB-231 teve a secreção da MMP-9 estimulada, em todas as concentrações, de forma significativa. Tendo em vista os resultados, a DisBa-01 pode ser utilizada na construção de modelos para o desenho racional de possíveis fármacos que atuem na terapia anti-metastática, além da sua utilização como instrumento de pesquisa para elucidação de mecanismos relacionados as integrinas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3510.pdf: 4191245 bytes, checksum: 06d51dcbc27b48e71902ca9fa212b568 (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cancer metastasis is the major cause of death, consequently studies to understand the molecular mechanisms involved in this process are essential to the knowledge of this disease. Cell migration and invasion are part of the metastatic process; therefore, molecules that are able to prevent cell migration can be used as model to develop new anti-metastasis drugs. The aim of this project was to study the mechanisms involved on metastasis, then the disintegrin domain of a human ADAM9 (A Disintegin and Metalloprotease), ADAM9D, was cloned in the pGEX-4T-1 plasmid and was expressed in E. coli AD494(DE3) in a soluble and active form. Assays were performed using mama and prostate cancer cells (MDA-MB-231 and DU- 145 respectively) with ADAM9D to verify its functions and the interactions with its ligands. ADAM9D was able to bind to different integrins, β1, αvβ5, αvβ3 and α2 in both cell lines, but only with α6 in DU-145 cells. ADAM9D inhibited cell adhesion to collagen type I in MDAMB- 231 cell, however it did not have the same effect in DU-145 cells. During the proliferation assay ADAM9D did not affect the proliferation in all cell lines tested (MDAMB- 231, DU-145 and human fibroblasts). ADAM9D decreased cell invasion and migration in the transwell and wound healing assays, MMP-2 and MMP-9 had lower expression. ADAM9D decreased cell invasion and migration (wound healing assay), although in the transwell migration assay, ADAM9D increased cell migration and MMP-2/-9 expression. Therefore, this project provides more information about the disintegrin domain of ADAM9 and its role in cell invasion and migration of prostate and mama cancer cells. / A metástase é a maior causa de morte no câncer, desta forma estudos que visam compreender os mecanismos nela envolvidos são importantes para o entendimento deste processo. A migração e invasão celular participam do processo metastático, portanto, estudos de moléculas que impeçam a migração podem fornecer as bases para o desenvolvimento de fármacos anti-metastáticos. Com o objetivo de estudar os mecanismos envolvidos na metástase, o domínio desintegrina de uma ADAM (A Desintegrin And Metalloprotease) humana, a ADAM9D foi clonada em vetor bacteriano pGEX-4T-1 e expresso em células E. coli AD494(DE3) de forma solúvel e ativa. Ensaios celulares nas linhagens de câncer de mama (MDA-MB-231) e próstata (DU-145) foram realizados utilizando a ADAM9D no intuito de verificar suas funções e interações com ligantes. A ADAM9D é capaz de interagir com as integrinas β1, αvβ5, αvβ3 e α2 nas duas linhagens celulares e com a subunidade α6 somente na linhagem DU-145. A ADAM9D inibiu a adesão ao colágeno tipo I na linhagem MDA-MB-231, entretanto, não teve a mesma capacidade na linhagem DU-145. No ensaio de proliferação celular a ADAM9D não apresentou atividade em nenhuma das linhagens celulares testadas (Fibroblastos humanos, MDA-MB-231 e DU-145). Nas células MDA-MB- 231 a ADAM9D inibiu a invasão e migração em ensaios transwell e de wound healing, além de inibir a expressão das metalopeptidases de matriz, MMP2 e MMP-9. A ADAM9D, nas células de câncer de próstata, inibiu a invasão e a migração em ensaio de wound healing. Entretanto, no ensaio de migração transwell a ADAM9D provocou um aumento da migração celular e um aumento na expressão das MMP-2 e MMP-9 no ensaio wound healing. Portanto, este estudo foi capaz de fornecer mais informações sobre as funções do domínio desintegrina, e sobre seu papel na migração e invasão de células tumorais de câncer de mama e de próstata.