Orientador: José Mauricio Sforcin / Resumo: Própolis e seus compostos fenólicos são conhecidos por apresentarem propriedades antioxidantes e anticâncer. Recentemente, os mecanismos de ação da propolis têm sido objeto de investigação. Este estudo teve como objetivo elucidar os efeitos da própolis e três compostos fenólicos (ácido cafeico - Caf, ácido dihidrocinâmico - Cin; ácido p-cumárico - Cou) na mesma proporção que são encontrados em nossa amostra de própolis, isoladamente ou em combinação, sobre células de carcinoma epidermóide de laringe humano (HEp-2). A viabilidade celular, tipo de morte e parada do ciclo celular, geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a possível capacidade da própolis em induzir o efluxo de doxorrubicina (DOX) via inibidor de glicoproteína-P (P-gp) foram avaliadas. A própolis exerceu um efeito citotóxico em células HEp-2 e apresentaram um valor de IC50 igual a 80 µg/mL, enquanto que os compostos isolados (isoladamente ou em combinação) não mostraram efeito sobre a viabilidade celular após 72 h. Assim, concentrações mais elevadas destes compostos foram testadas e Caf (IC50: 1.332 µM) induziu necrose em células HEp-2, enquanto que a própolis induziu apoptose em células HEp-2, ambos, provavelmente devido à geração de ROS. A amostra de própolis induziu parada do ciclo celular na fase G2/M e Caf na fase S. Própolis ou seus componentes, com exceção de Caf, pode agir como um potencial inibidor de P-gp por modulação da atividade da P-gp, inibindo o efluxo de DOX. Sendo assim, os dados sugerir... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Propolis and its phenolic compounds are known for their antioxidant and anticancer properties. Propolis mechanisms of action have been the subject of research recently. This study aimed to elucidate the effects of propolis and three phenolic compounds (caffeic acid – Caf; dihydrocinnamic acid – Cin; p-coumaric acid – Cou) in the same proportion they are found in our propolis sample, alone or in combination, towards human larynx epidermoid carcinoma (HEp-2) cell. Cell viability, apoptosis/necrosis and cell cycle arrest, generation of reactive oxygen species (ROS) and the ability of propolis to induce doxorubicin (DOX) efflux using a P-glycoprotein (P-gp) inhibitor (verapamil) were assayed. Propolis exerted a cytotoxic effect in HEp-2 cells and exhibited an IC50 value of 80 µg/mL, whereas the isolated compounds (alone or in combination) had no effect on cell viability after 72 h. Hence, higher concentrations of these compounds were tested and Caf (IC50: 1.332 µM) induced necrosis in HEp-2 cells, while propolis induced apoptosis, both, probably due to ROS generation. Propolis induced cell cycle arrest at G2/M phase and, Caf at S phase. Propolis or its components, except Caf, can act as a P-gp inhibitor by modulating P-gp activity and inhibiting the efflux of DOX. Altogether, data suggested that propolis exerted cytotoxic effects against HEp-2 cells and some mechanisms are discussed. Its potential as an antitumor drug should be investigated in further assays. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:25:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese Jozelia rego.pdf: 289983 bytes, checksum: 81f90ad780122cbecb664ab66f6306c0 (MD5) Previous issue date: 2009-12-17 / Autoimmune diseases are a clinical syndrome caused by the activation of T and/or B cells. They are multifactorial in nature and characterized by the presence of autoantibodies directed against cellular components. These autoantibodies can act as diagnostic markers or as predictors for these diseases. The ANA test is a very useful tool in the investigation of autoimmune diseases. OBJECTIVES: a) establishing a correlation between clinical diagnoses and fluorescence patterns in ANA tests on HEp-2 cells; b) determining the frequency of fluorescence patterns; c) establishing a correlation between clinical diagnosis and fluorescence titers; d) establishing possible correlations of changes in fluorescence patterns. CASES AND METHODS: All the ANA requests sent to the Immunorheumatology Laboratory of the Teaching Hospital of the Federal University of Goias, from January / 2000 to December / 2007 were analyzed and those with positive results were selected. For the ANA research, the investigator used the IFI technique and HEp-2 cells as substrate. To classify the fluorescence patterns decision trees proposed by the Brazilian Consensus for Standardization of ANA in HEp-2 cells were used. RESULTS: Among the 8,631 ANA requests, 1,167 presented positive results (13,52%). These positive tests were divided into two groups: Group I (tests requested in one occasion) and Group II (tests requested in more than one occasion). In Group I, nuclear patterns were more prevalent (89,41%). Speckled nuclear patterns were seen more frequently (78,81%), with special notice to fine speckled nuclear patterns (32,74%), coarse speckled nuclear patterns (29,86%) and fine dense speckled nuclear patterns (9,79%). Among the clinical diagnoses, rheumatic autoimmune diseases were the most prevalent (59,87%) and they correlated mostly with speckled nuclear patterns. A positive ANA was noted in 216 cases (34,67%) of non-immune conditions and in 22 cases (3,53%) of undetermined diagnosis. Cases with moderate (1:160) and high (1:640 and > 1:640) titers presented a high association with autoimmune diseases (54,25%; 73,23%; 83,91%, respectively). In Group II, the analytic clinical diagnosis and fluorescence titer factors showed a significant association with the change in the fluorescence pattern. CONCLUSIONS: 1) ANA was found to be positive in autoimmune (61,80%) and in non-autoimmune diseases (34,67%). 2) The most frequently found positive ANA correlation was seen with a diagnosis of lupus erythematosus (38,04%), mainly with coarse speckled nuclear pattern (32,91%), fine speckled nuclear pattern (25,73%), homogeneous nuclear pattern (19,40%) and fine dense speckled nuclear pattern (10,12%). 3) Nuclear patterns were more frequently found (89,41%), and among them, speckled patterns were prevalent (78,81%). 4) Low titers can be found in rheumatic autoimmune diseases and, therefore, can not be interpreted as an exclusion criteria for autoimmune disease, as long as there are clinical indications. 5) High titers can be found in non-autoimmune diseases and, therefore, can not be interpreted as specific to autoimmune diseases. 6) When the ANA test was requested in more than one occasion for the same patient, the clinical diagnosis (especially SLE) and the fluorescence titer (1:40 and 1:160) showed an association with the change of the fluorescence pattern. 7) A correct valuation of the ANA test should associate information from positive results to the clinical history and the physical examination of the patient when they are suggestive of an autoimmune disease, most notably, of rheumatic autoimmune diseases / As doenças autoimunes são síndromes clínicas causadas pela ativação de células T e/ou B, de origem multifatorial, caracterizadas pela presença de autoanticorpos dirigidos contra componentes celulares. Os autoanticorpos podem atuar como marcadores diagnósticos ou como marcadores preditores destas doenças. O teste de FAN é um exame útil na investigação de doenças autoimunes. OBJETIVOS: a) verificar a correlação entre os diagnósticos clínicos e os padrões de fluorescência na pesquisa de FAN em células HEp-2; b) determinar a freqüência dos padrões de fluorescência; c) verificar a correlação entre os diagnósticos clínicos e os títulos de fluorescência; d) verificar as possíveis correlações da mudança dos padrões de fluorescência. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Foram analisadas todas as solicitações de FAN encaminhadas ao Laboratório de Imuno-Reumatologia do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás, durante o período de jan./ 2000 a dez./ 2007, e selecionadas as solicitações com resultados positivos. A pesquisa do FAN foi realizada pela técnica de IFI, utilizando-se como substrato células HEp-2. Para a classificação dos padrões de fluorescência utilizou-se as árvores de classificação definidas pelo I Consenso Nacional para padronização dos laudos de FAN em células HEp-2. RESULTADOS: Das 8631 solicitações de FAN, 1167 apresentaram resultados positivos (13,52%). Os testes positivos foram divididos em dois grupos: Grupo I (exames solicitados em uma ocasião) e Grupo II (exames solicitados em mais de uma ocasião). No Grupo I, os padrões encontrados em maior freqüência foram os nucleares (89,41%). Os padrões nucleares pontilhados foram observados em maior freqüência (78,81%), destacando-se os padrões nuclear pontilhado fino (32,74%), nuclear pontilhado grosso (29,86%) e nuclear pontilhado fino denso (9,79%). Dentre os diagnósticos clínicos descritos, as doenças autoimunes reumáticas foram observadas em maior freqüência (59,87%) e correlacionaram-se, principalmente, com os padrões nucleares pontilhados. FAN positivo foi observado em 216 casos (34,67%) de situações não-autoimunes e em 22 casos (3,53%) de diagnóstico não definido. Os casos com títulos moderados (1:160) e elevados (1:640 e > 1:640) apresentaram maior associação com enfermidades autoimunes (54,25%; 73,23%; 83,91%, respectivamente). No Grupo II, os fatores analíticos diagnóstico clínico e título de fluorescência mostraram associação significativa com a mudança do padrão de fluorescência. CONCLUSÕES: 1) A positividade do teste de FAN foi observada em doenças autoimunes (61,80%) e em doenças não-autoimunes (34,67%). 2) A correlação mais freqüente do FAN positivo foi observada com o diagnóstico de lupus eritematoso (38,04%), principalmente com os padrões nuclear pontilhado grosso (32,91%), nuclear pontilhado fino (25,73%), nuclear homogêneo (19,40%) e nuclear pontilhado fino denso (10,12%). 3) Os padrões nucleares foram observados em maior freqüência (89,41%), sendo os pontilhados os mais comuns (78,81%). 4) Títulos baixos podem ser encontrados em doenças autoimunes reumáticas e, portanto, não devem ser interpretados como critério para exclusão de doença autoimune, desde que exista suspeita clínica. 5) Títulos altos podem ser encontrados em doenças não-autoimunes e, portanto, não devem ser interpretados como específicos de doença autoimune. 6) Quando o teste de FAN foi solicitado em mais de uma ocasião, para o mesmo paciente, o diagnóstico clínico (principalmente de LES) e o título de fluorescência (1:40 e 1:160) mostraram associação com a mudança do padrão de fluorescência. 7) A valorização correta do teste de FAN deve associar as informações fornecidas pelo resultado positivo à história clínica e exame físico do paciente, quando sugestivos de doença autoimune, principalmente de doenças autoimunes reumáticas.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A célula epitelial é o primeiro contato entre os micro-organismos e o hospedeiro. Essa interação pode levar a produção de diversas citocinas, quimiocinas, moléculas inflamatórias e também estimular a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Neste trabalho avaliamos se a interação com as células HEp-2 poderia ser genotóxica para os mutantes derivados de Escherichia coli K-12 deficientes em algumas enzimas que fazem parte do sistema de reparo por excisão de base (BER). Além disto, avaliamos a expressão do sistema SOS, que é induzido pela presença de danos no genoma bacteriano. Os resultados obtidos mostraram a presença de filamentos, na interação com células HEp-2, principalmente, no mutante xthA (BW9091) e no triplo mutante xthA nfo nth (BW535). Quando a interação foi quantificada na ausência da D-manose, observamos um aumento das bactérias aderidas. Além disto, a quantidade e o tamanho dos filamentos também aumentaram, mostrando que as adesinas manose-sensíveis estavam envolvidas na filamentação bacteriana. Para comprovar se o aumento da filamentação observada neste ensaio foram uma consequência da indução do sistema SOS, desencadeada pela interação com as células HEp-2, quantificamos a expressão do SOS, na presença e na ausência da D-manose. De fato, observamos que a indução do SOS na ausência da D-manose foi maior, quando comparada, com o ensaio realizado na presença de D-manose. Além disto, observamos que a ausência de xthA foi importante para o aumento da filamentação observada na ausência de D-manose. Diante destes resultados, verificamos se a resposta de filamentação ocorreria quando as bactérias interagiam com uma superfície abiótica como o vidro. Observamos também inúmeros filamentos nos mutantes BER, BW9091 e BW535, quando comparados a cepa selvagem AB1157. Essa filamentação foi associada à indução do SOS, em resposta a interação das bactérias com o vidro. Em parte a filamentação e a indução do SOS observadas na interação ao vidro, foram associadas à produção de ERO. Quantificamos também o número de bactérias aderidas e observamos que as nossas cepas formavam biofilmes moderados. Contudo, a formação de biofilme dependia da capacidade da bactéria induzir o sistema SOS, tanto em aerobiose como em anaerobiose. A tensão do oxigênio foi importante para interação dos mutantes BER, uma vez que os mutantes BW9091 e BW535 apresentaram uma quantidade de bactérias aderidas menor em anaerobiose. Contudo, a diminuição observada não estava vinculada a morte dos mutantes BER. Também realizamos microscopia de varredura na cepa selvagem e nos mutantes, BW9091 e BW535 e confirmamos que as três cepas formavam biofilmes tanto em aerobiose como em anaerobiose. Observamos uma estrutura sugestiva de matriz extracelular envolvendo os biofilmes da cepa selvagem AB1157 e do mutante BW9091. No entanto, a formação desta estrutura por ambas as cepas dependia da tensão de oxigênio, pois nos biofilmes formados em anaerobiose essa estrutura estava ausente. Em conclusão, mostramos que na interação das bactérias com a superfície biótica e abiótica, ocorreu lesão no genoma, com indução do SOS e a resposta de filamentação associada. / The epithelial cell is the first contact between microorganisms and host. This interaction results in production of several cytokines, chemokines, and inflammatory molecules by epithelial cells and also stimulate the generation of reactive oxygen species (ROS). In the present study, we have evaluated whether the interaction to HEp-2 cells causes genotoxicity to mutants derived from Escherichia coli K-12 deficient in some enzymes that are part of the system of base excision repair (BER). Moreover, we measured the expression of SOS system, which is induced by the presence of damage to the bacterial genome. Our results showed mainly presence of filamentous bacterial growth in xthA mutant (BW9091) and triple xthA nfo nth mutant (BW535) when submitted to HEp-2 cells interaction assays. When experiments were performed in the absence of mannose, data showed enhanced interaction of viable bacteria to HEp-2 cells for all strains tested. Furthermore, the removal of D-mannose resulted in an increase in both number and size of bacterial filamentous forms, indicating the involvement of mannose-sensitive adhesins in the filamentation of these strains. In order to verify whether the increased filamentation growth in this assay was a consequence of SOS induction, triggered by interaction to HEp-2 cells, we measured expression of SOS in the presence and absence of D-mannose. Indeed, we observed higher expression of SOS response in the absence of mannose than in experiments performed in the presence of D-mannose. Moreover, we observed that the absence of xthA was important to filamentation increasing in absence of D-mannose. Based on these results, we verified if interaction to abiotic surfaces, like glass, could lead to filamentation of these strains. We also observed numerous filaments in BER mutants, BW9091 and BW535, when compared to wild-type strain AB1157. The filamentation observed was a consequence of SOS induction, triggered by attachment to the glass surface. In part, the filamentation and SOS induction observed in these experiments were related to ROS production. We also quantified interacted bacterial cells and it was observed moderated biofilm formation in all strains tested. However, biofilm formation depended on the ability of the bacteria to induce the SOS response, under both aerobic and anaerobic conditions. The oxygen tension was important factor for interaction of the BER mutants, since these mutants exhibited decreased quantitative adherence under anaerobic conditions. However, this decrease was not related to BER mutants death. Scanning electron microscopy was also performed in the wild-type strain and BER mutants (BW9091 e BW535) and biofilm formation was confirmed under both aerobic and anaerobic conditions. We observed a structure similar to a extracellular matrix which involved biofilms of wild type strain (AB1157) and xthA mutant (BW9091). However, the formation of this structure by both strains depended on the oxygen tension, since biofilm formation, under anaerobiosis condition, did not presented this structure. In conclusion, was provided that bacterial interaction to biotic and abiotic surfaces can lead to damage of bacterial genome, resulting in SOS induction and associated filamentation.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A célula epitelial é o primeiro contato entre os micro-organismos e o hospedeiro. Essa interação pode levar a produção de diversas citocinas, quimiocinas, moléculas inflamatórias e também estimular a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Neste trabalho avaliamos se a interação com as células HEp-2 poderia ser genotóxica para os mutantes derivados de Escherichia coli K-12 deficientes em algumas enzimas que fazem parte do sistema de reparo por excisão de base (BER). Além disto, avaliamos a expressão do sistema SOS, que é induzido pela presença de danos no genoma bacteriano. Os resultados obtidos mostraram a presença de filamentos, na interação com células HEp-2, principalmente, no mutante xthA (BW9091) e no triplo mutante xthA nfo nth (BW535). Quando a interação foi quantificada na ausência da D-manose, observamos um aumento das bactérias aderidas. Além disto, a quantidade e o tamanho dos filamentos também aumentaram, mostrando que as adesinas manose-sensíveis estavam envolvidas na filamentação bacteriana. Para comprovar se o aumento da filamentação observada neste ensaio foram uma consequência da indução do sistema SOS, desencadeada pela interação com as células HEp-2, quantificamos a expressão do SOS, na presença e na ausência da D-manose. De fato, observamos que a indução do SOS na ausência da D-manose foi maior, quando comparada, com o ensaio realizado na presença de D-manose. Além disto, observamos que a ausência de xthA foi importante para o aumento da filamentação observada na ausência de D-manose. Diante destes resultados, verificamos se a resposta de filamentação ocorreria quando as bactérias interagiam com uma superfície abiótica como o vidro. Observamos também inúmeros filamentos nos mutantes BER, BW9091 e BW535, quando comparados a cepa selvagem AB1157. Essa filamentação foi associada à indução do SOS, em resposta a interação das bactérias com o vidro. Em parte a filamentação e a indução do SOS observadas na interação ao vidro, foram associadas à produção de ERO. Quantificamos também o número de bactérias aderidas e observamos que as nossas cepas formavam biofilmes moderados. Contudo, a formação de biofilme dependia da capacidade da bactéria induzir o sistema SOS, tanto em aerobiose como em anaerobiose. A tensão do oxigênio foi importante para interação dos mutantes BER, uma vez que os mutantes BW9091 e BW535 apresentaram uma quantidade de bactérias aderidas menor em anaerobiose. Contudo, a diminuição observada não estava vinculada a morte dos mutantes BER. Também realizamos microscopia de varredura na cepa selvagem e nos mutantes, BW9091 e BW535 e confirmamos que as três cepas formavam biofilmes tanto em aerobiose como em anaerobiose. Observamos uma estrutura sugestiva de matriz extracelular envolvendo os biofilmes da cepa selvagem AB1157 e do mutante BW9091. No entanto, a formação desta estrutura por ambas as cepas dependia da tensão de oxigênio, pois nos biofilmes formados em anaerobiose essa estrutura estava ausente. Em conclusão, mostramos que na interação das bactérias com a superfície biótica e abiótica, ocorreu lesão no genoma, com indução do SOS e a resposta de filamentação associada. / The epithelial cell is the first contact between microorganisms and host. This interaction results in production of several cytokines, chemokines, and inflammatory molecules by epithelial cells and also stimulate the generation of reactive oxygen species (ROS). In the present study, we have evaluated whether the interaction to HEp-2 cells causes genotoxicity to mutants derived from Escherichia coli K-12 deficient in some enzymes that are part of the system of base excision repair (BER). Moreover, we measured the expression of SOS system, which is induced by the presence of damage to the bacterial genome. Our results showed mainly presence of filamentous bacterial growth in xthA mutant (BW9091) and triple xthA nfo nth mutant (BW535) when submitted to HEp-2 cells interaction assays. When experiments were performed in the absence of mannose, data showed enhanced interaction of viable bacteria to HEp-2 cells for all strains tested. Furthermore, the removal of D-mannose resulted in an increase in both number and size of bacterial filamentous forms, indicating the involvement of mannose-sensitive adhesins in the filamentation of these strains. In order to verify whether the increased filamentation growth in this assay was a consequence of SOS induction, triggered by interaction to HEp-2 cells, we measured expression of SOS in the presence and absence of D-mannose. Indeed, we observed higher expression of SOS response in the absence of mannose than in experiments performed in the presence of D-mannose. Moreover, we observed that the absence of xthA was important to filamentation increasing in absence of D-mannose. Based on these results, we verified if interaction to abiotic surfaces, like glass, could lead to filamentation of these strains. We also observed numerous filaments in BER mutants, BW9091 and BW535, when compared to wild-type strain AB1157. The filamentation observed was a consequence of SOS induction, triggered by attachment to the glass surface. In part, the filamentation and SOS induction observed in these experiments were related to ROS production. We also quantified interacted bacterial cells and it was observed moderated biofilm formation in all strains tested. However, biofilm formation depended on the ability of the bacteria to induce the SOS response, under both aerobic and anaerobic conditions. The oxygen tension was important factor for interaction of the BER mutants, since these mutants exhibited decreased quantitative adherence under anaerobic conditions. However, this decrease was not related to BER mutants death. Scanning electron microscopy was also performed in the wild-type strain and BER mutants (BW9091 e BW535) and biofilm formation was confirmed under both aerobic and anaerobic conditions. We observed a structure similar to a extracellular matrix which involved biofilms of wild type strain (AB1157) and xthA mutant (BW9091). However, the formation of this structure by both strains depended on the oxygen tension, since biofilm formation, under anaerobiosis condition, did not presented this structure. In conclusion, was provided that bacterial interaction to biotic and abiotic surfaces can lead to damage of bacterial genome, resulting in SOS induction and associated filamentation.