Submitted by DANIELE LOPES PEREIRA null (danielelopesp@hotmail.com) on 2016-05-11T22:02:11Z No. of bitstreams: 1 dissertação maio - 2016.doc: 36656128 bytes, checksum: 544a8bb80add41fb7e4e0faa6dc3b70c (MD5) / Rejected by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. E também, o arquivo submetido está sem a folha de aprovações providenciada pela Pós-graduação. Lembramos que a versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija estas informações e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-05-13T16:38:51Z (GMT) / Submitted by DANIELE LOPES PEREIRA null (danielelopesp@hotmail.com) on 2016-08-12T21:37:08Z No. of bitstreams: 1 Terapia celular em fibrose pulmonar.pdf: 14681718 bytes, checksum: ddd650e002e44e6ba3817e66564c1581 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-08-15T19:52:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pereira_dl_me_assis.pdf: 14681718 bytes, checksum: ddd650e002e44e6ba3817e66564c1581 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-15T19:52:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pereira_dl_me_assis.pdf: 14681718 bytes, checksum: ddd650e002e44e6ba3817e66564c1581 (MD5) Previous issue date: 2016-03-15 / A Fibrose Pulmonar (FP), também denominada Alveolite Fibrosante, é uma pneumopatia idiopática, crônica e irreversível, que acomete o tecido pulmonar promovendo a deposição de tecido fibroso cicatricial e consequente remodelamento da arquitetura pulmonar. Considerando a inexistência de um tratamento clínico curativo que não seja apenas paliativo, a terapia com células-tronco desponta como alternativa promissora no tratamento da fibrose pulmonar e diversas outras patologias. Neste contexto, este projeto propôs o emprego da terapia celular com células-tronco mesenquimais de tecido adiposo humano (CTMTA) e “pool” de células mononucleares da medula óssea (BMMC), isoladas ou conjuntamente, em modelo experimental de fibrose pulmonar. Foram utilizados 36 ratos Wistar divididos em 6 grupos. O grupo controle recebeu instilação intratraqueal de tampão fosfato. Cinco grupos foram instilados com bleomicina (2U/animal) para a indução da doença e, após 14 dias, submetidos ou não a diferentes tratamentos utilizando células mononucleares da medula óssea e/ou células-tronco mesenquimais de tecido adiposo, sendo que um grupo recebeu tratamento placebo com tampão fosfato. A análise histológica evidenciou o desenvolvimento de fibrose nos animais instilados com bleomicina (p<0,0001) e uma melhora do quadro fibrótico nos animais submetidos ao tratamento, independentemente do tipo celular utilizado (p<0,001). A ventilação pulmonar basal revelou a presença de esforço respiratório nos animais instilados com bleomicina (p=0,0260), porém nenhum tipo de terapia foi capaz de reverter esse quadro. Não houve diferença significativa entre o perfil de leucócitos encontrados no lavado broncoalveolar dos animais sadios e doentes, entretanto a terapia com CTMTA promoveu a redução da porcentagem de linfócitos e o aumento de macrófagos nos animais doentes. O tratamento com BMMC e CTMTA, realizado de modo isolado ou em conjunto, mostrou remissão significativa do quadro de fibrose instalado. / Pulmonary Fibrosis (PF), also known as fibrosing alveolitis, is an idiopathic, chronic, irreversible lung disease that affects the lung tissue by promoting the deposition of fibrous scar tissue and subsequent lung architecture remodeling. Considering the need for curative medical treatment that is not only palliative, stem cell therapy is emerging as a promising alternative for the treatment of pulmonary fibrosis and many other diseases. ln this context, it is proposed in this study the cell therapy with mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue (CTMTA) in association with the pool of mononuclear bone marrow cells (BMMC) in an experimental model of pulmonary fibrosis. The disease was induced in 4 groups of Wistar rats (n = 6) by intratracheal bleomycin (2U/animal). 14 days after instillation, each group was subjected to a specific treatment with BMMC and CTMTA, isolated or combined mode, while a fourth group was treated with phosphate buffer. The control group was instilled and treated with phosphate buffer. Histological analysis showed the development of disease in animais instilled with bleomycin (p<0,0001) and untreated, and improvement in the fibrous framework of animais subjected to cell therapy (p<0,001 ). The basal ventilation revealed the presence of respiratory effort in animais instilled with bleomycin, submitted or not to therapy (p=0,0260). Treatment with BMMC and CTMTA, performed alone or in conjunction mode showed similar results, since both promoted remission of pulmonary fibrosis.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-05-22T16:58:19Z No. of bitstreams: 1 Bruno Solano de Freitas Souza Terapia... 2012.pdf: 11192595 bytes, checksum: bbf17ad75e0d20605c6fd2274da72034 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T16:58:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno Solano de Freitas Souza Terapia... 2012.pdf: 11192595 bytes, checksum: bbf17ad75e0d20605c6fd2274da72034 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Introdução e objetivos: A insuficiência hepática aguda (IHA), apesar de rara, permanece como uma condição rapidamente progressiva e frequentemente fatal. A intoxicação por acetaminofen (APAP) induz necrose hepática maciça e frequentemente leva à morte por edema cerebral. Terapias celulares são de grande interesse como potenciais tratamentos para IHA. Neste projeto foi avaliado o potencial terapêutico das células mononucleares da medula óssea (CMMO) em um modelo experimental de IHA induzida por APAP em camundongos. Métodos: A IHA foi induzida em camundongos C57Bl/6, previamente submetidos à dieta alcoólica por três semanas, através da administração de APAP na dose de 300 mg/kg por via intraperitoneal. Após a indução da IHA, os camundongos foram transplantados, por via endovenosa, com 107 CMMO obtidas de doadores transgênicos para a proteína verde fluorescente (GFP) ou injetados com salina. As curvas de sobrevivência, os níveis plasmáticos de aminotransferases, amônia, uréia e creatinina, a extensão da necrose hepática, o infiltrado inflamatório e a expressão de citocinas e metaloproteinases foram avaliados. A microscopia confocal foi utilizada para estudar a migração das células transplantadas para o fígado. A permeabilidade da barreira hemato-encefálica foi avaliada pela injeção do corante azul de Evans (AE) por via endovenosa. Resultados: Observou-se que os camundongos tratados com CMMO apresentaram uma redução significativa da mortalidade, com uma taxa de 60% de sobrevivência quando comparados a 20% de sobrevivência do grupo controle. As células transplantadas migraram para o fígado, mas não foi observada a diferenciação destas em células hepáticas ou fusão celular. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na extensão de necrose hepática no fígado, nos níveis plasmáticos de transaminases e amônia, na intensidade do infiltrado inflamatório no fígado entre os dois grupos com IHA, bem como nos níveis hepáticos das citocinas TNF-a e IL-10 e de transcritos para adrenomedula e endotelina 1 no cérebro, assim como na atividade da metaloproteinase 9 no soro. No entanto, observou-se uma redução dos níveis séricos de TNF-a no grupo tratado com CMMO quando comparado ao grupo injetado com salina. Esta redução está correlacionada ao aumento do mRNA para IL-10 na medula óssea e no baço dos animais tratados com CMMO. A avaliação do extravasamento do corante azul de Evans para o cérebro demonstrou que o grupo tratado com células mononucleares da medula óssea apresentou uma redução da permeabilidade da barreira hemato-encefálica quando comparado ao grupo injetado com salina. Conclusão: As CMMO exercem um efeito protetor em camundongos com IHA induzida por APAP, sem alterar o dano hepático, provavelmente através da modulação da resposta inflamatória sistêmica e da diminuição da permeabilidade da barreira hemato-encefálica. / Introduction and objectives: Acute liver failure (IHA), although rare, remains a rapidly progressive and often fatal condition. Poisoning by acetaminophen (APAP) induces a massive hepatic necrosis and often leads to death by cerebral edema. Cell therapies are of great interest as potential treatments for IHA. In this project we evaluated the therapeutic potential of bone marrow mononuclear cells (BMC) in an experimental model of IHA induced by APAP in mice. Methods: The IHA was induced in C57BL/6 mice previously submitted to the alcohol diet for three weeks by the administration of APAP at a dose of 300 mg / kg, intraperitoneally. After induction of IHA, the mice were transplanted intravenously with 107 BMC obtained from donors transgenic for green fluorescent protein (GFP) or injected with saline. The survival curves, plasma levels of aminotransferases, ammonia, urea and creatinine, the extent of hepatic necrosis, inflammatory infiltrate and the expression of cytokines and metalloproteinases were evaluated. Confocal microscopy was used to study the migration of transplanted cells to the liver. The permeability of the blood-brain barrier was assessed by injection of Evans blue dye (AE) intravenously. Results: We found that mice treated with BMC showed a significant reduction in mortality, with a rate of 60% survival compared to 20% survival in the control group. The transplanted cells migrated to the liver, but we did not observe the differentiation of these cells or fusion with liver cells. There were no statistically significant differences in the extent of hepatic necrosis in the liver, plasma levels of transaminases and ammonia, and in the intensity of the inflammatory infiltrate in the liver between the two groups with IHA, as well as in hepatic levels of TNF-α and IL-10, transcripts for endothelin 1 and adrenomedullin in the brain and serum metalloproteinase 9 activity. However, there was a reduction of serum TNF-α in BMC-treated group compared to the group injected with saline. This decrease correlated with the increase in IL-10 mRNA expression in the bone marrow and spleen of BMC-treated mice. The assessment of Evans blue extravasation into the brain showed that the group treated with BMC had a reduced permeability of the blood-brain barrier compared to the group injected with saline. Conclusion: Bone marrow mononuclear cells exert a protective effect in mice with APAPinduced IHA, without changing the liver injury, probably through modulation of systemic inflammatory response and decrease the permeability of the blood-brain barrier.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A disfunção mitocondrial tem sido associada a várias doenças, incluindo a colestase hepática, caracterizada pela ativação de células de Kupffer e células fibrogênicas, as quais produzem matriz extracelular excessiva. O acúmulo de sais biliares tóxicos no parênquima hepático leva à lesão crônica com dano mitocondrial, redução da síntese de ATP, aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) e apoptose, resultando em comprometimento da função hepática. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o efeito positivo do transplante de células mononucleares da medula óssea (CMMO) na resolução da fibrose hepática e recuperação da função hepática em ratos com colestase, induzida pela ligadura de ducto biliar (LDB). Assim, o presente estudo teve como objetivo analisar a bioenergética mitocondrial após o transplante de CMMO no fígado de ratos com fibrose induzida por ligadura de ducto bilar (LDB). Ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos: animais normais, animais com fibrose hepática após 14 e 21 dias de LDB (F14d e F21d, respectivamente), e animais que após 14 dias de LDB receberam 1x107 CMMO, e foram eutanasiados sete dias após. Nossos dados demonstraram aumento do conteúdo de colágeno tipo I no grupo F21d em relação ao grupo normal, indicativo de fibrose, e sua diminuição após o transplante de CMMO. A análise da fisiologia mitocondrial do fígado mostrou diminuição significativa da taxa respiratória máxima estimulada por ADP (estado 3) nos grupos F14d e F21d, indicando redução da capacidade de oxidação de carboidratos e ácidos graxos. Além disso, a razão do controle respiratório (RCR), indicativa de acoplamento da fosforilação oxidativa com a produção de ATP, apresentou-se significativamente diminuída nos grupos F14d e F21d, sugerindo desacoplamento mitocondrial. No entanto, o transplante de CMMO aumentou significativamente nestes grupos tanto a capacidade oxidativa quanto o acoplamento mitocondrial a níveis semelhantes aos do grupo normal. Estes resultados foram confirmados por análise de western blotting, que mostrou aumento significativo no conteúdo de UCP2 e diminuição do conteúdo de PGC-1&#945; no grupo F21d, com consequente restauração após o transplante de CMMO. Além disso, os resultados mostraram um aumento significativo do conteúdo de 4-HNE no grupo F14d com redução após o transplante CMMO. Assim, podemos concluir que o transplante de CMMO tem um efeito positivo sobre a bioenergética mitocondrial de fígados de ratos com colestase, com aumento da capacidade oxidativa e redução do estresse oxidativo, o que, por sua vez, contribui para a recuperação da função hepática. / Mitochondrial dysfunction has been associated with several diseases, including liver cholestatis, which is characterized by activation of Kupffer cells and fibrogenic cells that produce excessive extracellular matrix. Toxic bile salt accumulation in liver parenchyma leads to chronic injury with mitochondrial damage, ATP synthesis reduction, ROS increase and apoptosis, resulting in liver function impairment. Our previous works showed the positive effect of bone marrow mononuclear cells (BMMNC) transplantation on liver fibrosis resolution and hepatic function recover in cholestatic rats. This study aimed to analyze mitochondrial bioenergetics in rats with hepatic fibrosis induced by bile duct ligation (BDL) after BMMNC transplantation. Wistar male rats were divided into four groups: normal animals, animals with cholestasis after 14 and 21 days BDL (F14d and F21d, respectively), and animals with cholestasis after 14 days of BDL that received 1x107 BMMNC, via jugular vein, and were euthanasia after 7 days. The livers were analyzed by high-resolution respirometry and western blotting. Our data demonstrated increased collagen type I content in livers of F21d group compared to normal group, indicative of fibrosis, and its decrease after BMMNC transplantation. Liver mitochondrial physiology analysis showed that F14d and F21d groups have significantly reduced maximum ADP-stimulated respiratory rates (State 3), indicating reduced carbohydrates and fatty acids oxidation capacity. In addition, respiratory control ratio (RCR), indicative of oxidative phosphorilation coupling to ATP production, was significantly decreased in F14d and F21d groups, suggesting mitochondrial uncoupling. However, BMMNC transplantation significantly increased both State 3 respiration and RCR to levels similar to those of normal group, recovering hepatic mitochondrial function. These results were confirmed by WB analysis, which showed that F21d group had a significantly increase in liver mitochondrial uncoupling protein content, UCP2, and reduced PGC-1&#945; content, a mitochondrial biogenesis co-factor. However, after BMMNC transplantation both proteins returned to levels similar to normal group. In addition, F14d group had a significantly increase in 4-HNE content compared to normal group, indicative of oxidative stress, but after BMMNC transplantation 4-HNE content significantly reduced, compared to normal group, suggesting oxidative stress reduction. Therefore, BMMNC transplantation had a positive effect on hepatic mitochondrial bioenergetics of cholestatic rats, increasing oxidative capacity and reducing oxidative stress, which, in turn, contribute to liver function recover.

Several factors, including periodontal disease, can lead to alveolar bone reabsorbtion. The aim of this study was to investigate and compare the efficiency of mononuclear bone marrow cells (MN-BMC) associated with hydroxiapatite with hydroxiapatite alone, to promote bone regeneration. The dogs were separated in two groups (GI and GII) of nine animals. A defect of 4,3 mm diameter was surgically induced by a trephine bur between the dental roots of the fourth pre-molar tooth. In each dog the wound was treated with FMCB associated with HA (GII) or HA alone (GI). Bone marrow was extracted from all four members, the surgical access for this procedure consisted in the major tracanter of the femur and humerus condyle. In order to process the bone marrow a Histopaque® 1.077 gradient was used to separate the layer of mononuclear cells. A small sample of this layer was used for verification of total cell count and viability. The obtained mononuclear cells were then transplanted to the patients as soon as possible. Clinical evaluations for 7 days, radiologic examinations at 14, 45 and 60 days, and histological analyzes at 14, 45 and 60 days were made in order to investigate and compare the efficiency of the treatments in bone regeneration and/or reparation. The surgical procedure was adequate for the investigation purpose and the trephine bur permitted standardization of the bone defects. Adequate cell number and viability were obtained from the four bone marrow extractions followed by their processing. Scarring of the surgical wound was satisfactory and occurred similarly for the two groups. Both groups presented similar progress by radiological examination. Immediate postsurgical exams indicated that the bone defect had an adequate fulfillment. At 14 days, radiopacity had diminished when compared with immediate post-surgical finding; this was followed by an increase in radiopacity at 45 days, in both groups. Even though bone defect was still visible, radiopacity at 60 days was higher than that of 45 days. Histological evaluation indicated a progressive bone formation process in both groups. Immature bone was already visualized at 14 days in GII. In fact, histological and statistical analyzes provide reliable data that bone regeneration occurred in a less amount of time in GII at a probability of 5%. HA was still present at the 60 day group evaluation witch indicates that this biomaterial had not been completely absorbed at this time. Additionally, foreign body reactions were not present proving that the bone grafts used was biocompatible. In summary, this study has shown that the use of MN-BMC in combination with HA resulted in improvement in bone reparation when compared with HA alone. / Vários fatores, dentre eles a doença periodontal, podem levar à reabsorção do osso alveolar. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a fração total de células mononucleares (FTCM) proveniente da medula óssea (MO) na regeneração alveolar da mandíbula de cães, quando associadas à hidroxiapatita sintética (HA). Para isso, foram utilizados 18 cães divididos em 2 grupos (GI e GII). No GI o defeito foi preenchido somente com o biomaterial. O GII foi tratado com HA associado à FTCM. Defeitos de 4,3 mm de diâmetro foram criados entre as raízes do quarto pré-molar direito no osso alveolar. Esses foram preenchidos com o implante correspondente a cada grupo. A MO foi coletada dos quatro membros do animal. O acesso para a coleta no membro pélvico foi o trocanter maior do fêmur, já o acesso no membro torácico consistiu no côndilo maior do úmero. Da MO coletada, foi extraída a camada mononuclear por meio de centrifugação em gradiente de Histopaque® 1.077. As células mononucleares foram transplantadas logo após separação. Com a finalidade de investigar e comparar a eficiência da regeneração óssea foi realizado avaliações clínicas diárias durante uma semana; avaliações radiográficas no pós-operatório imediato, aos 14, 45 e 60 dias; e exames histológicos aos 14, 45 e 60 dias. A cicatrização da ferida ocorreu de forma satisfatória e semelhante para ambos os grupos. O exame radiográfico revelou evolução semelhante para os dois grupos. No pós-operatório imediato, esse exame, permitiu avaliar o adequado preenchimento do defeito no GI e GII. Nos dois grupos, aos 14 dias, observou-se uma diminuição da radiopacidade,em relação ao pós-operatório imediato, seguida por um aumento na mesma aos 45 dias em relação aos 14 dias. Essa evolução é esperada em um processo de reparação ósseo onde é usado como a HA. A radiopacidade aos 60 dias foi superior daquela observada aos 45 dias, mas o defeito ainda era perceptível. Os exames histológicos indicaram um processo de formação ósseo progressivo nos dois grupos. Aos 14 dias, havia presença de trabéculas ósseas no GII, não sendo observadas no GI nessa data. De fato, o GII apresentou um processo de regeneração óssea mais acelerada em relação ao GI até os 45 dias, sendo comprovado estatisticamente pela presença em maior quantidade de matriz óssea no GII aos 45 dias, ao nível de significância de 5%. Ainda era perceptível a presença da HA em algumas amostras aos 60 dias indicando que essa não foi completamente reabsorvida. Nenhuma reação do tipo corpo estranho foi observada, portanto, comprovando a biocompatibilidade do material. Coletivamente, os resultados obtidos neste trabalho mostraram que a associação da FTCM provenientes da medula óssea de cães à HA favoreceu a regeneração óssea em defeitos realizados no osso alveolar da mandíbula de cães. Quando comparada ao uso somente da hidroxiapatita sintética, esse processo de regeneração ocorreu de forma mais rápida em defeitos preenchidos com o biomaterial associado à FTCM.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A fibrose hepática é o resultado de uma resposta cicatrizante frente a repetidas lesões no fígado, e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de proteínas da matriz extracelular (MEC) no parênquima hepático, incluindo colágeno, fibronectina, elastina, laminina e proteoglicanos, com a participação de diferentes populações celulares do fígado. As principais células responsáveis pela síntese de proteínas da MEC na fibrose hepática são as células estreladas hepáticas ativadas e os miofibroblastos, que surgem após estímulo inflamatório e são caracterizadas pela expressão de alfa-actina de músculo liso (&#945;-SMA). Sabe-se que durante a progressão da fibrose hepática, ocorre a morte de hepatócitos e sua substituição por células fibrogênicas &#945;-SMA+. A apoptose dessas células fibrogênicas é de grande relevância para a regressão da fibrose e regeneração hepática. Nos últimos anos, a terapia com células tronco de medula óssea tem sido utilizada para estimular a regeneração hepática em diferentes modelos experimentais e protocolos clínicos. A fração mononuclear da medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas e células-tronco mesenquimais. O objetivo deste estudo foi analisar a expressão de &#945;-SMA e o processo de apoptose de células hepáticas durante a fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) e após o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO). Os fígados foram coletados de ratos dos seguintes grupos: normal, 14 dias de LDB, 21 dias de LDB e animais que receberam CMMO após 14 dias de LDB, e foram analisados após 7 dias (totalizando 21 dias de LDB). Para quantificar a expressão de &#945;-SMA por células fibrogênicas nos grupos experimentais, foi realizada imunoperoxidase para &#945;-SMA, seguida de morfometria no programa Image Pro Plus. Para analisar a apoptose nas células hepáticas, foi realizada imunoperoxidase e Western Blotting (WB) para caspase-3 (proteína apoptótica) e imunofluorescência com dupla-marcação para caspase-3 e &#945;-SMA, seguida de observação em microscópio confocal. Os resultados da quantificação de &#945;-SMA por morfometria mostraram que a expressão de &#945;-SMA aumentou significativamente 14 e 21 dias após a LDB. Entretanto, essa expressão diminuiu significativamente no grupo tratado com CMMO, que apresentou parênquima hepático mais preservado em relação ao grupo com 21 dias de LDB. Os resultados de imunoperoxidase, WB e microscopia confocal para expressão de caspase-3 demonstraram que essa proteína diminuiu nos animais fibróticos com 14 e 21 dias de LDB com relação ao grupo normal, e estava significativamente elevada no grupo tratado com CMMO. A análise por microscopia confocal demonstrou que algumas células coexpressaram &#945;-SMA e caspase-3 nos animais tratados com CMMO, sugerindo a morte de células fibrogênicas e remodelamento do parênquima hepático. / Hepatic fibrosis is the result of a scarring response due to continued injury to the liver, and is featured by excessive accumulation of extracellular matrix (MEC) proteins in hepatic parenchyma. These proteins include collagen, fibronectin, elastin, laminin and proteoglicans, along with the participation of different cell populations within the liver. The main cells responsible for the synthesis of MEC proteins are activated hepatic stellate cells and myofibroblasts, which appear after inflammatory stimuli and are characterized by the expression of alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA). It is known that hepatic fibrosis progression is accompanied by hepatocyte death and its substitution by &#945;-SMA+ fibrogenic cells. Therefore, apoptosis of these fibrogenic cells is of main relevance to fibrosis regression and hepatic regeneration. In the later years, bone marrow stem cell therapy has been used to stimulate hepatic regeneration in different experimental models and clinical protocols. The adult bone marrow mononuclear fraction contains two stem cell populations particularly important in the treatment of diverse hepatic diseases: hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. The aim of this study was to analyze &#945;-SMA expression and the apoptotic process in hepatic cells during hepatic fibrosis induced by bile duct ligation (BDL) and after bone marrow mononuclear cell (BMMC) transplantation. Livers were collect from rats of the following groups: normal, 14 days of BDL, 21 days of BDL and rats that received BMMC 14 days after BDL and were analyzed after 7 days (total of 21 days of BDL). To quantify &#945;-SMA expression by fibrogenic cells in the experimental groups, immunoperoxidase to &#945;-SMA followed by morphometry in the Image Pro Plus software was performed. To analyze apoptosis in hepatic cells, immunoperoxidase and western blotting (WB) against caspase-3 (apoptotic protein) were used, along with double immunofluorescence against caspase-3 and &#945;-SMA to confocal microscopy analysis. Results of &#945;-SMA quantification by morphometry showed that &#945;-SMA expression increased significantly 14 and 21 days after BDL. However, this expression was significantly decreased in the BMMC treated group, which presented a more preserved hepatic parenchyma in relation to the group with 21 days of BDL. Immunoperoxidase, WB and confocal microscopy results showed that caspase-3 is decreased in fibrotic livers with 14 and 21 days of BDL in comparison to normal group, and was significantly augmented in the BMMC treated group. Confocal microscopy analysis showed that were cells coexpressing &#945;-SMA and caspase-3 in rats treated with BMMC, suggesting fibrogenic cells death and hepatic remodeling.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A fibrose hepática é o resultado de uma resposta cicatrizante frente a repetidas lesões no fígado, e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de proteínas da matriz extracelular (MEC) no parênquima hepático, incluindo colágeno, fibronectina, elastina, laminina e proteoglicanos, com a participação de diferentes populações celulares do fígado. As principais células responsáveis pela síntese de proteínas da MEC na fibrose hepática são as células estreladas hepáticas ativadas e os miofibroblastos, que surgem após estímulo inflamatório e são caracterizadas pela expressão de alfa-actina de músculo liso (&#945;-SMA). Sabe-se que durante a progressão da fibrose hepática, ocorre a morte de hepatócitos e sua substituição por células fibrogênicas &#945;-SMA+. A apoptose dessas células fibrogênicas é de grande relevância para a regressão da fibrose e regeneração hepática. Nos últimos anos, a terapia com células tronco de medula óssea tem sido utilizada para estimular a regeneração hepática em diferentes modelos experimentais e protocolos clínicos. A fração mononuclear da medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas e células-tronco mesenquimais. O objetivo deste estudo foi analisar a expressão de &#945;-SMA e o processo de apoptose de células hepáticas durante a fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) e após o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO). Os fígados foram coletados de ratos dos seguintes grupos: normal, 14 dias de LDB, 21 dias de LDB e animais que receberam CMMO após 14 dias de LDB, e foram analisados após 7 dias (totalizando 21 dias de LDB). Para quantificar a expressão de &#945;-SMA por células fibrogênicas nos grupos experimentais, foi realizada imunoperoxidase para &#945;-SMA, seguida de morfometria no programa Image Pro Plus. Para analisar a apoptose nas células hepáticas, foi realizada imunoperoxidase e Western Blotting (WB) para caspase-3 (proteína apoptótica) e imunofluorescência com dupla-marcação para caspase-3 e &#945;-SMA, seguida de observação em microscópio confocal. Os resultados da quantificação de &#945;-SMA por morfometria mostraram que a expressão de &#945;-SMA aumentou significativamente 14 e 21 dias após a LDB. Entretanto, essa expressão diminuiu significativamente no grupo tratado com CMMO, que apresentou parênquima hepático mais preservado em relação ao grupo com 21 dias de LDB. Os resultados de imunoperoxidase, WB e microscopia confocal para expressão de caspase-3 demonstraram que essa proteína diminuiu nos animais fibróticos com 14 e 21 dias de LDB com relação ao grupo normal, e estava significativamente elevada no grupo tratado com CMMO. A análise por microscopia confocal demonstrou que algumas células coexpressaram &#945;-SMA e caspase-3 nos animais tratados com CMMO, sugerindo a morte de células fibrogênicas e remodelamento do parênquima hepático. / Hepatic fibrosis is the result of a scarring response due to continued injury to the liver, and is featured by excessive accumulation of extracellular matrix (MEC) proteins in hepatic parenchyma. These proteins include collagen, fibronectin, elastin, laminin and proteoglicans, along with the participation of different cell populations within the liver. The main cells responsible for the synthesis of MEC proteins are activated hepatic stellate cells and myofibroblasts, which appear after inflammatory stimuli and are characterized by the expression of alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA). It is known that hepatic fibrosis progression is accompanied by hepatocyte death and its substitution by &#945;-SMA+ fibrogenic cells. Therefore, apoptosis of these fibrogenic cells is of main relevance to fibrosis regression and hepatic regeneration. In the later years, bone marrow stem cell therapy has been used to stimulate hepatic regeneration in different experimental models and clinical protocols. The adult bone marrow mononuclear fraction contains two stem cell populations particularly important in the treatment of diverse hepatic diseases: hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. The aim of this study was to analyze &#945;-SMA expression and the apoptotic process in hepatic cells during hepatic fibrosis induced by bile duct ligation (BDL) and after bone marrow mononuclear cell (BMMC) transplantation. Livers were collect from rats of the following groups: normal, 14 days of BDL, 21 days of BDL and rats that received BMMC 14 days after BDL and were analyzed after 7 days (total of 21 days of BDL). To quantify &#945;-SMA expression by fibrogenic cells in the experimental groups, immunoperoxidase to &#945;-SMA followed by morphometry in the Image Pro Plus software was performed. To analyze apoptosis in hepatic cells, immunoperoxidase and western blotting (WB) against caspase-3 (apoptotic protein) were used, along with double immunofluorescence against caspase-3 and &#945;-SMA to confocal microscopy analysis. Results of &#945;-SMA quantification by morphometry showed that &#945;-SMA expression increased significantly 14 and 21 days after BDL. However, this expression was significantly decreased in the BMMC treated group, which presented a more preserved hepatic parenchyma in relation to the group with 21 days of BDL. Immunoperoxidase, WB and confocal microscopy results showed that caspase-3 is decreased in fibrotic livers with 14 and 21 days of BDL in comparison to normal group, and was significantly augmented in the BMMC treated group. Confocal microscopy analysis showed that were cells coexpressing &#945;-SMA and caspase-3 in rats treated with BMMC, suggesting fibrogenic cells death and hepatic remodeling.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas (CTHs) e células-tronco mesenquimais. A regeneração do fígado após a hepatectomia é um processo complexo que requer a proliferação de todas as células hepáticas. Fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular são elementos-chave nesse processo. As lamininas são uma família de proteínas de matriz extracelular, com funções adesivas e quimiotáticas pelo recrutamento de integrinas e outros receptores de superfície celular. No fígado normal, a laminina é expressa nas veias porta e centrolobular. O objetivo desse estudo foi investigar a expressão de laminina durante a regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial e após o transplante de células mononucleares de medula óssea. As células mononucleares de medula óssea foram obtidas dos fêmures e tíbias de ratos, isoladas, marcadas com DAPI e injetadas pela veia porta em ratos recém-hepatectomizados. Os fígados foram coletados 15 minutos, 1 dia e 3 dias após a hepatectomia e o transplante de células de medula óssea e congelados. Os cortes foram imunomarcados com anticorpos primários anti-CD34 e anti-laminina de rato e observados em microscópio confocal de varredura a laser. Os resultados mostraram que 15 minutos após a hepatectomia parcial, as células-tronco hematopoiéticas CD34+ transplantadas foram encontradas em contato com a laminina localizada nas veias porta e centrolobular, indicando que a laminina poderia participar na adesão inicial das células-tronco a esses vasos logo após o seu transplante. Além disso, 1 e 3 dias após a hepatectomia, as células mononucleares de medula óssea transplantadas foram observadas nos sinusóides hepáticos expressando laminina. Esses resultados sugerem que a laminina pode ser um componente da matriz extracelular importante para a adesão e enxerto de células de medula óssea no fígado após uma lesão. Nós também analisamos a expressão de osteopontina (OPN) em células de medula óssea e CTHs. Os resultados por microscopia confocal demonstraram que a maioria das células mononucleares de medula óssea recém-isoladas expressa quantidades variáveis de OPN. Além disso, algumas CTHs CD34+ também expressam OPN. Após 1 e 4 dias de cultura, observamos uma diminuição de células expressando CD34, e um aumento na expressão de OPN pelas células mononucleares de medula óssea. / The adult bone marrow retains two populations of stem cells with emerging importance for the treatment of diverse liver diseases: hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells. Liver regeneration after partial hepatectomy is a complex process that requires the proliferation of all hepatic cells. Growth factors, cytokines and extracellular matrix molecules are key elements in this process. Laminins are a family of heterotrimeric extracellular matrix proteins with adhesive and chemotactic functions, through recruitment of integrins and other cell surface receptors. In the normal liver, laminin is expressed in portal and centrolobular veins. The aim of this study was to investigate laminin expression during liver regeneration induced by partial hepatectomy and after bone marrow mononuclear cells transplantation. Rat bone marrow mononuclear cells were obtained from tibias and femurs, isolated, stained with DAPI and injected in immediately hepatectomyzed rats via portal vein. Livers were collected 15 minutes, 1 day and 3 days after hepatectomy and bone marrow cells transplantation and frozen. Liver sections were immunolabeled with mouse anti-rat CD34 and rabbit anti-rat laminin primary antibodies and observed under a Laser Scanning Confocal Microscope. Results showed that 15 minutes after partial hepatectomy, transplanted CD34+ HSCs were found in contact with laminin, which was localized principally in portal and centrolobular veins of rat livers, indicating that laminin could participate in stem cell initial attachment to these vessels soon after their transplantation. Furthermore, 1 and 3 days after hepatectomy, transplanted bone marrow mononuclear cells were found in the hepatic sinusoids expressing laminin. These results suggest that laminin could be an important extracellular matrix component for bone marrow cell adhesion and grafting in the injured liver. We also analyzed osteopontin (OPN) expression in bone marrow mononuclear cells and HSCs. Results by confocal microscopy showed that the most freshly isolated bone marrow mononuclear cells express variable amounts of OPN. Furthermore, some CD34+ HSCs also expressed OPN. After 1 and 4 days in culture, we observed a decrease in CD34+ cells, and an increase in OPN expression in bone marrow mononuclear cells.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas (CTHs) e células-tronco mesenquimais. A regeneração do fígado após a hepatectomia é um processo complexo que requer a proliferação de todas as células hepáticas. Fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular são elementos-chave nesse processo. As lamininas são uma família de proteínas de matriz extracelular, com funções adesivas e quimiotáticas pelo recrutamento de integrinas e outros receptores de superfície celular. No fígado normal, a laminina é expressa nas veias porta e centrolobular. O objetivo desse estudo foi investigar a expressão de laminina durante a regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial e após o transplante de células mononucleares de medula óssea. As células mononucleares de medula óssea foram obtidas dos fêmures e tíbias de ratos, isoladas, marcadas com DAPI e injetadas pela veia porta em ratos recém-hepatectomizados. Os fígados foram coletados 15 minutos, 1 dia e 3 dias após a hepatectomia e o transplante de células de medula óssea e congelados. Os cortes foram imunomarcados com anticorpos primários anti-CD34 e anti-laminina de rato e observados em microscópio confocal de varredura a laser. Os resultados mostraram que 15 minutos após a hepatectomia parcial, as células-tronco hematopoiéticas CD34+ transplantadas foram encontradas em contato com a laminina localizada nas veias porta e centrolobular, indicando que a laminina poderia participar na adesão inicial das células-tronco a esses vasos logo após o seu transplante. Além disso, 1 e 3 dias após a hepatectomia, as células mononucleares de medula óssea transplantadas foram observadas nos sinusóides hepáticos expressando laminina. Esses resultados sugerem que a laminina pode ser um componente da matriz extracelular importante para a adesão e enxerto de células de medula óssea no fígado após uma lesão. Nós também analisamos a expressão de osteopontina (OPN) em células de medula óssea e CTHs. Os resultados por microscopia confocal demonstraram que a maioria das células mononucleares de medula óssea recém-isoladas expressa quantidades variáveis de OPN. Além disso, algumas CTHs CD34+ também expressam OPN. Após 1 e 4 dias de cultura, observamos uma diminuição de células expressando CD34, e um aumento na expressão de OPN pelas células mononucleares de medula óssea. / The adult bone marrow retains two populations of stem cells with emerging importance for the treatment of diverse liver diseases: hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells. Liver regeneration after partial hepatectomy is a complex process that requires the proliferation of all hepatic cells. Growth factors, cytokines and extracellular matrix molecules are key elements in this process. Laminins are a family of heterotrimeric extracellular matrix proteins with adhesive and chemotactic functions, through recruitment of integrins and other cell surface receptors. In the normal liver, laminin is expressed in portal and centrolobular veins. The aim of this study was to investigate laminin expression during liver regeneration induced by partial hepatectomy and after bone marrow mononuclear cells transplantation. Rat bone marrow mononuclear cells were obtained from tibias and femurs, isolated, stained with DAPI and injected in immediately hepatectomyzed rats via portal vein. Livers were collected 15 minutes, 1 day and 3 days after hepatectomy and bone marrow cells transplantation and frozen. Liver sections were immunolabeled with mouse anti-rat CD34 and rabbit anti-rat laminin primary antibodies and observed under a Laser Scanning Confocal Microscope. Results showed that 15 minutes after partial hepatectomy, transplanted CD34+ HSCs were found in contact with laminin, which was localized principally in portal and centrolobular veins of rat livers, indicating that laminin could participate in stem cell initial attachment to these vessels soon after their transplantation. Furthermore, 1 and 3 days after hepatectomy, transplanted bone marrow mononuclear cells were found in the hepatic sinusoids expressing laminin. These results suggest that laminin could be an important extracellular matrix component for bone marrow cell adhesion and grafting in the injured liver. We also analyzed osteopontin (OPN) expression in bone marrow mononuclear cells and HSCs. Results by confocal microscopy showed that the most freshly isolated bone marrow mononuclear cells express variable amounts of OPN. Furthermore, some CD34+ HSCs also expressed OPN. After 1 and 4 days in culture, we observed a decrease in CD34+ cells, and an increase in OPN expression in bone marrow mononuclear cells.