Espécies reativas de oxigênio (ROS) têm sido descritas como potenciais causadoras de doenças como aterosclerose, artrite e câncer. Falhas na regulação das metaloproteinases de matriz (MMP), uma família de proteases que degradam matriz extracelular, parecem estar intimamente relacionadas com essas mesmas doenças. Além disso, autores sugerem uma relação entre a atividade das MMPs e ROS. Em trabalhos anteriores, nosso grupo de pesquisa demonstrou que o tratamento com retinol 7 μM foi capaz de induzir mudanças no metabolismo de células de Sertoli cultivadas, como o aumento da atividade de enzimas antioxidantes, aumento do dano oxidativo a biomoléculas, ativação de ERK1/2 MAPK, alteração do ciclo celular e transformação pré-neoplásica, ligando o tratamento com retinol ao estresse oxidativo. No presente trabalho, nós utilizamos a técnica de zimografia para verificar a atividade da MMP-2 em células de Sertoli tratadas com retinol e ácido retinóico. Nós encontramos que tanto o tratamento por 24 horas com retinol 7 μM, quanto o tratamento por 24 horas com ácido retinóico 1 nM, aumentaram a atividade da MMP-2 em células de Sertoli cultivadas. O cotratamento com diferentes antioxidantes reverteu o aumento da atividade da MMP-2 induzido por retinol, mas não por ácido retinóico. Além disso, o tratamento com retinol, mas não com ácido retinóico, foi capaz de aumentar a produção de ROS quantificada pela oxidação de DCFH-DA. Nós encontramos também que tanto o tratamento com retinol quanto com ácido retinóico foram capazes de aumentar a fosforilação de ERK1/2. Entretanto, somente o aumento da atividade da MMP-2 induzido por tratamento com retinol foi inibido por co-tratamento com UO126, um potente inibidor de fosforização de ERK1/2. Nossos resultados sugerem que o aumento da atividade da MMP-2 induzido por retinol, mas não por ácido retinóico, está relacionado com a fosforilação de ERK1/2 e com a geração de ERO. / Reactive oxygen species (ROS) have been hypothesized to play a causative role in numerous diseases such as atherosclerosis, arthritis and cancer. Failures in the regulation of the matrix metalloproteinases (MMP), a family of extracellular matrixdegrading proteases, appear to be intimately involved in these diseases. In addition, authors suggest a relationship between MPP activity and ROS. In early reports our research group has demonstrated that 7 μM retinol was able to induce changes in Sertoli cell metabolism, such as up-regulation of antioxidant enzyme activities, increase in oxidative damage to biomolecules, activation of ERK1/2 MAPK, cell-cycle alteration and pre-neoplasic transformation, linking retinol treatment and oxidative stress. Here, we verify the MMP activity in cultured Sertoli cells treated with vitamin A using gelatin zymography. We found that both retinol (7 μM by 24 hours) and retinoic acid (1 nM by 24 hours) treatments induces MMP-2 activity in cultured Sertoli cells. Antioxidants cotreatment reversed retinol-induced but not retinoic acid-induced MMP-2 activity. Moreover, retinol but not retinoic acid treatment increased ROS production quantified by DCFH-DA oxidation. We found that both retinol and retinoic acid treatment induced ERK1/2 phosphorylation. However, only retinol-increased MMP-2 activity was inhibited by UO126, a potent ERK1/2 phosphorylation inhibitor. Our results suggested that the increase on MMP- 2 activity induced by retinol, but not by retinoic acid, was related to ERK1/2 phosphorylation and ROS production.

Orientador: Francisco Eduardo Martinez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T19:26:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Segatelli_TaniaMara_D.pdf: 2722114 bytes, checksum: 42553c00f75889ad9e7da916ef3940bd (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O gerbilo (Meriones unguiculatus) é um roedor nativo das regiões áridas da Mongólia e China, é de especial interesse em pesquisas biomédicas e tem sido criado em laboratório desde 1960. Estudos sobre a estrutura e função do testículo do gerbilo são raros, em especial sobre a espermatogênese. O presente trabalho é o primeiro a realizar uma investigação mais detalhada sobre a duração do ciclo espermatogênico e analisar morfométrica e funcionalmente o testículo do gerbilo. Através da técnica de marcação com 3H-timidina, a duração do ciclo do epitélio seminífero foi estimada em 10,55 :f: 1,0 dias e a duração total do processo espermatogênico foi de 47,47 dias, considerando que 4,5 ciclos são necessários para completar o processo. Os compartimentos tubular e intersticial ocuparam volume de 92% e 8%, respectivamente. Baseado no volume ocupado pelo compartimento tubular no parênquima testicular e no diâmetro do túbulo seminífero, aproximadamente 10 metros de túbulos seminíferos foram encontrados por testículo e 18 metros por grama de testículo no gerbilo. Cerca de 12 espermatócitos primários foram formados para cada espermatogônia do tipo AI. O índice meiótico observado foi de 2,8, representando 30% de perdas celulares durante as divisões meióticas. O número de células de Sertoli por grama de testículo foi de 28 milhões, com capacidade de suporte individual de 21 células germinativas. A produção espermática diária por grama de testículo foi de 33 milhões, sugerindo alta eficiência espermatogênica nessa espécie. O gerbilo pode ser utilizado como modelo para futuras investigações do processo espermatogênico / Abstract: The gerbil (Meriones unguiculatus) is a rodent native of the arid regions of Mongolia and China, is of special interest in biomedical research and has been bred in laboratory since 1960. Studies on the structure and function of the gerbil testis are sporadic and, moreover those on spermatogenesis are rare. This is the first study to perform a more detailed investigation about duration of the spermatogenic cycle and morphometric and functional analysis of the gerbil testis. Through 3H-thymidine injection tecnic, the mean duration of seminiferous epithelium cyc1e was determined to be 10.55 :t 1.0 days and the total duration of spermatogenesis based on 4.5 cyc1es was 47.47 days. The volume density of tubular and interstitial compartments was approximately 92% and 8%, respectively. Based on the volume of the testis parenchyma and the volume occupied by seminiferous tubules in the testis and the tubular diameter, about 9 and 18 meters of seminiferous tubules were found per testis and per gram of testis, respectively. About 12 primary spermatocytes were formed for each type A1 spermatogonia. The meiotic index was 2.8. This result shows that 30% of cell loss occurs during the two meiotic divisions. The number of Sertoli cell per gram of the testis was 28 million and the supporting capacity was 21 germ cel1. The daily sperm production per gram of the testis was 33 million. This value suggest high spermatogenic efficiency in this specie. The gerbil could be utilized as an animal model for future investigation of spermatogenic process / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Ernesto Jose Doltaviano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T18:40:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vignado_Jane_M.pdf: 11166364 bytes, checksum: 5c6e796cff729f35ed09f7fb5556d51f (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Embora seja do conhecimento geral que os hormônios tireoidianos estão envolvidos no desenvolvimento e manutenção de vários órgãos, ainda, existem aspectos contraditórios sobre seu papel na fisiologia testicular. Com a proposta de melhor compreender a influência dos hormônios tireoidianos na manutenção testicular, este estudo teve como objetivo avaliar parâmetros biométricos, morfológicos e hormonais em ratos de várias idades, que foram induzidos experimentalmente ao hipotireoidismo com doses diárias de 0,05 mg de Methimazole, confirmado pelas dosagens de Tiroxina (T4). Neste estudo utilizaram-se 68 ratos brancos (Rattus no veraicus, variedade albino), machos e 12 fetos. Estes animais foram sub divididos em 6 grupos experimentais, de acordo com o tempo de tratamento e a data do sacrifício e denominados: Hipotireoidismo materno-fetal (19º dia de vida fetal), 8 dias de idade, 21 dias de idade, 35 dias de idade, 50 dias de idade e 90 dias de idade. Os resultados mostraram que a indução do hipotireoidismo no oitavo dia de prenhez, que corresponde ao início da organogênese do rato, não resulta em aumento da incidência de reabsorção fetal ou de malformações congênitas e também não leva a alterações no comportamento dos animais com hipotireoidismo. Em todos os grupos experimentais analisados, os animais tratados apresentaram redução significativa (p<0,05) do peso corporal em relação aos animais controles da mesma idade. A avaliação biométrica dos testículos mostrou que os animais tratados apresentaram redução significativa (p<0,05) do peso testicular, do diâmetro dos túbulos seminíferos e do volume nuclear das células de Sertoli. Apenas os fetos com 19 dias de vida intra-uterina não mostraram diferenças nos parâmetros acima citados. A morfologia dos testículos dos animais tratados mostrou atraso no início do estadiamento do ciclo do epitélio seminífero, com redução da quantidade de células germinativas e aumento do número de células degeneradas. Nos grupos experimentais 50 dias e 90 dias de idade, os animais tratados apresentaram estadiamento completo do epitélio seminífero, mas a frequência dos estádios I, VII/VIII e XIV foi menor do que a dos animais controles da mesma idade. As dosagens em duplicata da testosterona plasmática, pelo método de fluoroimunoensaio de fase sólida, não mostraram diferenças significativas entre os valores encontrados nos animais controles e tratados. Conclui-se que o hipotireoidismo prejudica acentuadamente a espermatogênese dos ratos jovens, prejuízo detectável através da redução do peso testicular, da diminuição do diâmetro dos túbulos seminíferos, do aumento de células germinativas degeneradas, do atraso da espermatogênese e da redução do volume nuclear das células de Sertoli. Nos animais tratados com 90 dias de idade, ocorre ganho consideravelmente maior do peso testicular, do diâmetro dos túbulos seminíferos em relação aos animais controles da mesma idade e aparente estabilização no volume nuclear das células de Sertoli, sugerindo ausência da participação dos hormônios tireoidianos sobre o testículo do rato adulto / Abstract: Although it is well known that thyroidal hormones are involved in the development and maintenance of many organs, there remain several open questions as to their role in testicular physiology. The present work proposes to contribute to a better understanding of the role of thyroidal hormones in testicular maintenance. The evaluation was based on the biometric, morphologic and hormonal parameters of groups of data of different ages in which a previous experimental hypothyroidism was induced by treating them with daily 0,05mg Methimazole, and confirmed by measuring thyroxine levels. Our study involved an experimental of 68 white male rats and 12 foetuses (albino Rattus novergicus). These animals were subdivided into 6 experimental groups according to the period of treatment and their death date and will here be designated as mother-foetal ( 190 days of intrauterine life), 8 day old, 21 day old, 35 day old, 50 day old and 90 day old hypothyroidism, respectively. Our results showed that induction to hypothyroidism in the eighth day of pregnancy, which corresponds to the beginning of organogenesis in rats, did not result in any increase in the incidence of either foetal reabsorption nor congenital malformations, as well not causing behavioral alteration of animals with hypothyroidism. In all of the experimental groups considered, the treated animals have a significant reduction (p<0,05) in body weight as related to the control animals of same age. Biometric evaluation of testicles has shown that treated animals had significant reduction (p<0,05) in both the testicular weight and the diameter of seminiferous tubules as well as a reduction in the nuclear volume of Sertoli cells. Only the foetuses having 19 days of intrauterine life had no differences in such parameters, while in the treated 90 day old animals testicular recuperation was observed. As to the morphology, the testicular development of treated animals was delayed in the beginning of the seminiferous epithelium cycle, with a reduction in the quantity of germinative cells and an increase in the number of degenerated cells. In both the 50 and 90 day old experimental groups, the treated animals completed staging of the seminiferous epithelium, but the frequency of stages I, VII/VIII and XIV was reduced as compared to the control animals of the same age. Duplicated dosages of plasmic testosterone by means of solid phase fluoroimunoassays showed no significant differences in the values found for both treated and control animals. We conclude that hypothyroidism severely impairs espermatogenesis in young rats as indicated by the reduced testicular weight, the diminished seminiferous tubule diameter, the increased degeneration of germinative cells, the delayed staging in the seminiferous epithelium cycle and the reduced nuclear volume in Sertoli cell. This did not occur in adults rats. In treated animals belonging to the 90 day old experimental group we have observed the occurence of significantly larger gain in both the testicular weight and the seminiferous tubule diameter, as compared to the control animals of the same age, as well as the occurrence an apparent stabilization of the nuclear volume of Sertoli cells, which thereby suggest that there is no influence of the thyroidal hormones upon adult rats testicles / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

O hormônio folículo-estimulante (FSH) produz um efeito dual sobre o potencial de membrana das células de Sertoli, com uma fase inicial rápida, que compreende uma hiperpolarização, por um período de segundos e uma fase de despolarização, que ocorre mais lentamente, por um período de minutos. A fase de despolarização envolve um mecanismo relacionado à entrada de cálcio estimulada pelo FSH. O Isoproterenol, um agonista de receptores β-adrenérgicos, induz uma hiperpolarização imediata e prolongada na membrana de células de Sertoli de ratos imaturos. Este efeito é provavelmente resultante da queda de [ATP]i a qual libera a inibição exercida pelo nucleotídeo sobre o canal de K+ATP. Dessa forma, objetivou-se estudar a ação do Isoproterenol sobre o potencial de membrana das células de Sertoli para melhor avaliar o componente hiperpolarizante produzido por FSH nas células de Sertoli, além de estudar a captação de Ca2+ estimulada pelo FSH e pelo isoproterenol. O potencial de membrana foi registrado utilizando túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos Wistar machos de 15 dias de idade. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares preenchidos com KCl 3mmol/L acoplados a um eletrômetro. Foi realizada a aplicação tópica isolada de FSH (4mU/mL) e Isoproterenol (2μM). Depois, em experimentos individuais, foram aplicados topicamente, FSH e isoproterenol, 5 minutos após a aplicação tópica da Tolbutamida (10μM) e Glibenclamida (10μM), sulfonilureias de ação hipoglicemiante, que exercem efeito de fechamento dos canais de K+ATP. A Tolbutamida (10μM), ainda, foi perfundida 15 minutos antes da aplicação do Isoproterenol, a fim de testar se esta sulfoniluréia impediria de forma mais significativa a ação deste. Na técnica de captação de Ca2+, utilizou-se FSH e isoproterenol com toxina pertussis (PTX), bloqueador da subunidade Gi da proteína G para avaliar o seu envolvimento na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Utilizou-se a toxina colérica, estimulador da proteína Gs, para avaliar o envolvimento do AMPc na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Fez-se uso de SQ22536, inibidor da enzima adenilato ciclase, para avaliar o envolvimento dessa enzima na ação estimulante do FSH nas células de Sertoli de ratos imaturos. Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados da variação do potencial de membrana foram analisados pelo teste ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni. O FSH teve sua hiperpolarização inibida quando foi aplicado tolbutamida (10μM) anteriormente. O SQ22536 também aboliu a hiperpolarização causada pelo FSH. O Isoproterenol, quando aplicado isoladamente produziu uma resposta hiperpolarizante sobre o potencial de membrana, alterando de – 32,4mV ± 1,32 mV para -40,0 ± 0,78 mv, aos 60 segundos após a sua aplicação (*p<0,001) (n=6 células de Sertoli). A aplicação tópica de Tolbutamida (10 μM) bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando uma despolarização de –41,0± 0,47mV variou até -39,0 ± 2,02mV, aos 120 segundos após a aplicação do Isoproterenol (p>0,05) (n=6 células de Sertoli). A perfusão com Tolbutamida foi mais eficaz no bloqueio da resposta beta-adrenérgica, causando uma despolarização de -41,6 ±1,21 mV para -35,4 ± 0,98 mV, aos 120 segundos após a aplicação tópica do Isoproterenol (p>0,05) (n=9 células de Sertoli). A aplicação tópica de Glibenclamida (10μM), a qual é um inibidor do canal de k +ATP, bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando despolarização, demonstrando que a hiperpolarização do isoproterenol está relacionada com a abertura desses canais. A tolbutamida (10μM), quando aplicada topicamente, impediu a fase de hiperpolarização característica causada pelo FSH (4mU/mL), causando despolarização do potencial de membrana das células de Sertoli de ratos imaturos. O Isoproterenol apresentou uma resposta hiperpolarizante rápida sobre o potencial de membrana, causada, provavelmente, por uma abertura dos canais de K+ATP na membrana das células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. PTX quando aplicada topicamente e anteriormente à aplicação de isoproterenol não impediu a hiperpolarização característica causada por isoproterenol. A ação hiperpolarizante de isoproterenol independe de proteína Gi. PTX não impede a captação de 45Ca2+ estimulada pelo isoproterenol. A toxina colérica, que estimula proteína Gs, não estimula a captação de 45Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. / Follicle-stimulating hormone (FSH) produces a dual effect on the membrane potential of Sertoli cells, with an initial rapid phase, which comprises a hyperpolarization for a period of seconds and a depolarization phase, wich occurs more slowly, within minutes. The depolarization phase involves calcium entry stimulated by FSH. Isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, induces an immediate and prolonged hyperpolarization on the membrane of Sertoli cells from immature rats. The aim of this work is to study the involvement of K+ATP channels in the hiperpolarization effect of isoproterenol on the membrane of Sertoli cells. This work also aimed to study the action of Isoproterenol on the membrane potential of Sertoli cells to better understanding the hyperpolarizing component produced by FSH in Sertoli cells, in addition to study the Ca2+ uptake stimulated by FSH and by isoproterenol. Membrane potential was recorded using isolated seminiferous tubules of testes of 15 days-old rats. The record of intracellular Sertoli cell was performed using microcapillary filled with KCl3 mmol/L coupled to an electrometer. We performed a single topical application of FSH(4mU/mL) and Isoproterenol (2μM). Then, inindividual experiments were applied topically, FSH and isoproterenol, 5 minutes after topical application of Tolbutamide (10μM) and glibenclamide(10μM), sulfonylurea a hypoglycemicaction, exercising effect closing of K+ channels ATP. The Tolbutamide (10μM) also was infused 15 minutes before application of Isoproterenol in order totest whether this would prevents ulfonylurea most significantly to the action of isoproterenol. In the technique of 45Ca2+ uptake, we used FSH and isoproterenol with pertussis toxin (PTX), blocking the G protein subunit Gi to evaluate its involvementon Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. We used the cholera toxin, a stimulator of Gs protein, to evaluate the involvement of AMPc on Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. SQ22536, an inhibitor of the enzyme adenylate cyclase, was used to evaluate the involvement this enzyme in the stimulatory action of FSH in Sertoli cells from immature rats. The results were given as mean ± SEM. The data of the change in membrane potential were analyzed by ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test. The hyperpolarization produced by FSH was inhibited when tolbutamide was applied (10μM). The SQ22536 also abolished the hyperpolarization caused by FSH. The Isoproterenol when used alone produced a hyperpolarizing response on the membrane potential , changing from -32.4mV±1.32 mV to -40.0±0.78 mV at 60 seconds after its application (*p<0.001) (n=6Sertoli cells). Topical application of Tolbutamide (10μM) blocked the action of Isoproterenol (2μM), causing a depolarization of -41.0±0.47 mV ranged up to-39.0± 2.02 mV at 120 seconds after application of Isoproterenol (p>0.05) (n=6Sertoli cells). The Tolbutamide infusion was more effective inblocking beta-adrenergic response, causing a depolarization of -41,6 ±1,21 mV to -35,4 ± 0,98 mV at 120seconds after the topical application of Isoproterenol (p>0.05) (n=9Sertoli cells). Isoproterenol produces a rapid hyperpolarization on membrane potential of Sertoli cells. This effect was blocked by tolbutamide, indicating that the activation of beta-adrenergic receptors involves opening of K+ATP channels in the membrane of Sertoli cells from immature rat testes. PTX,when applied topically prior to application of isoproterenol did not prevent the characteristic hyperpolarization caused by isoproterenol. The hyperpolarizing action of isoproterenol is independent of Gi protein. PTX does not prevent the uptake of 45Ca2+ stimulated by isoproterenol. The cholera toxin, which stimulates Gs protein, does not stimulate 45Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats.

O mecanismo não clássico de testosterona induz resposta celular rápida ao nível de membrana, enquanto que a ação clássica se dá pela ligação da testosterona ao seu receptor androgênico intracelular (iAR) que regula a expressão gênica. A Epitestosterona, o 17α-epímero da testosterona, tem sido descrito como um anti-andrógeno, inibindo o efeito da testosterona ou diidrotestosterona sobre o sobre o iAR. No entanto, a epitestosterona apresenta um efeito não clássico similar ao da da testosterona, despolarizando o potencial de membrana das células de Sertoli e induzindo a captação rápida de Ca2+ nos testículos. O objetivo deste estudo foi analizar o efeito do tratamento com epitestosterona e testosterona em animais castrados quimicamente com a utilização de um antagonista do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), o cetrorelix. Ratos imaturos, a partir do 7º dia de idade receberam durante 7 dias o tratamento pela via intraperitoneal de acordo com os seguintes grupos: Controle (apenas o veículo hidroxipropil-beta-ciclodextrina, castrados (Cetrorelix (500 μg/kg/dia)), castrados com reposição de testosterona (2,5mg/kg/dia) (Cetrorelix+testosterona), castrados com reposição de epitestosterona (2,5mg/kg/dia) (cetrorelix+epitestosterona) e epitestosterona. Foram observados os efeitos dos tratamentos em parâmetros de desenvolvimento sexual de ratos imaturos como: peso corporal, peso testicular e medida da distância anogenital (DAG). Também foram feitos registros eletrofisiológicos da ação no potencial de membrana da testosterona nos túbulos seminíferos de testículos de ratos de todos os tratamentos. Para a avaliação a imunorreatividade ao iAR foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração 1:250. Para o controle-negativo da técnica cortes de todas os tratamentos incubados com PBS-T. Para expressão foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração de 1:1000 realizada pela técnica de Western Blot. A castração química com cetrorelix resultou na redução no peso dos testículos e da DAG. O tratamento com epitestosterona e testosterona restaurou tanto o peso testicular como a DAG. O efeito despolarizante em resposta à aplicação tópica da testosterona foi observado no grupo controle e no grupo de cetrorelix. Além disso, o grupo castrado com cetrorelix com reposição de epitestosterona impediu o efeito rápido da testosterona na despolarização da membrana celular. No grupo com reposição de testosterona, a resposta eletrofisiológica da testosterona na membrana também foi alterada. O tratamento com epitestosterona nos ratos castrados com cetrorelix produziu diminuição da expressão do iAR. Foi observada redução da imunorreatividade do iAR nos animais tratados com epitestosterona. Pode-se concluir que a epitestosterona participa do desenvolvimento genital em ratos imaturos, ou seja, produziu recuperação de AGD de forma semelhante à testosterona. Este resultado sugere que ambos os hormônios atuam pela mesma via de desenvolvimento deste parâmetro, provavelmente através de um mecanismo não-clássico. Além disso, o tratamento com o antagonista de GnRH e reposição de epitestosterona suprimiu a resposta não clássica da testosterona, mudando o padrão de via de sinalização da testosterona nas células de Sertoli. / The non-classical mechanism of testosterone induces a rapid cellular response at the membrane level, while the classical action is through the binding to the intracellular androgenic receptor (iAR) and the regulation of gene expression. Epitestosterone, the 17α-epimer of testosterone, has been described as an anti-androgen, inhibiting the testosterone or dihyidrotestosterone effect on the iAR. However, epitestosterone presents a non-classical effect similar to testosterone, depolarizing the membrane potential of Sertoli cells and inducing rapid Ca2+ uptake in testes. The aim of this study was to observe the effect of the treatment with epitestosterone and testosterone in rats chemically castrated with a gonadotropin-releasing hormone (GnRH) antagonist cetrorelix. From pnd 7 to pnd 14, the rats were given daily intraperitoneal injections with (i) hormones solvent, (2-hydroxypropyl β-cyclodextrin) as the control group (CTRL); (ii) 500 μg/kg/day of the GnRH antagonist cetrorelix as the cetrorelix group (CET); (iii) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of testosterone as the cetrorelix plus testosterone group (CET+T); (iv) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of epitestosterone as the cetrorelix plus epitestosterone group (CET+EpiT); and (v) 2.5 mg/kg of epitestosterone alone as the epitestosterone group (EpiT). The effect of different treatments were verified on the body and testicular weight and the anogenital distance (AGD). The potential and the membrane resistance of Sertoli cells were recorded by electrophysiological technique intracellular record. The electrophysiological effect of testosterone on membrane of Sertoli cells were evaluated in seminiferous tubules in testes from rats of the all experimental groups. For evaluating the immunoreactivity to the iAR we used the anti-iAR primary polyclonal antibody type in concentration 1: 250. For the negative control technique cuts all treatments incubated with PBS-T. For iAR expression we used the anti-iAR type polyclonal primary antibody at a concentration of 1: 1000 performed by the Western Blot technique. The chemical castration induced a reduction in testicular weight and AGD. The treatment with both epitestosterone and testosterone restored the AGD and the testicular weight. The depolarizing effect in response to topical testosterone application was observed in the control group and in the GnRH antagonist cetrorelix group. Moreover, in the GnRH antagonist cetrorelix replaced with the epitestosterone group, testosterone was not capable of changing the membrane potential. In the group replaced with testosterone, the membrane response to testosterone was smaller also. The treatment with epitestosterone in castrated rats also reduced the expression of the iAR in testes. The immunoreaction of iAR was reduced in the animals treated with epitestosterone. In conclusion, the effect of epitestosterone on genital development in immature rats, namely recovering of AGD, was similar to testosterone. This result suggest that both hormones act through the same pathway on this development parameter, probably by a non-classical mechanism. Additionally, the treatment with the GnRH antagonist plus epitestosterone suppressed the non-classical testosterone response, changing the pattern of testosterone signaling pathway through a membrane mechanism in Sertoli cells.

A insulina e o IGF-I são hormônios que possuem alta homologia, isto é, apresentam grande semelhança estrutural no que se refere a sequencia de aminoácidos. Assim como os hormônios, seus receptores de membrana também são semelhantes, e a similaridade de suas sequencias de aminoácidos é em torno de 50%. Essas semelhanças permitem que ambos os hormônios se liguem aos seus receptores com alta afinidade e ao receptor do outro hormônio com menor afinidade. Tanto insulina como IGF-I desencadeiam uma série de efeitos sobre as células de Sertoli, como transporte de glicose e produção de lactato. Dessa forma, este estudo tem por objetivo investigar a ação do IGF-I e da insulina sobre a captação de cálcio, o transporte de aminoácido e glicose, além de suas ações eletrofisiológicas em células de Sertoli de ratos de 12 a 15 dias e de 30 dias de idade. Para o registro do potencial de membrana foram utilizados túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos Wistar machos de 12 a 15 dias de idade e de 30 dias de idade. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares de borossilicato preenchidos com KCl 3 M acoplados a um eletrômetro. Foi realizada a aplicação tópica de IGF-I (100 ng/ml) e insulina (100 μM) isoladamente e também após a perfusão com a verapamil (100 μM) e JB1 (1 μg/ml). A captação de 45Ca2+ foi investigada se utilizando testículos inteiros. Os tecidos foram pré-incubados em KRb com 45Ca2+ por 60 minutos para equilibrar o meio intra e extracelular de 45Ca2+. Em seguida, as gônadas foram incubadas por 2 minutos em KRb com 45Ca2+ com ou sem IGF-I ou insulina. O transporte de [14C]MeAIB e [14C]2-DG também foram investigados se utilizando de testículos inteiros. Com pré-incubação de 30 minutos em KRb sem [14C]MeAIB ou [14C]2-DG, e posterior incubação de 45 minutos com [14C]MeAIB ou de 120 minutos com [14C]2-DG, com ou sem o respectivo hormônio a ser investigado. Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados foram analisados pelo teste T student para comparação entre dois grupos ou ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni. IGF-I e insulina produziram um efeito despolarizante sobre o potencial de membrana das células de Sertoli de ratos imaturos. Este efeito é dependente do influxo de cálcio, uma vez que a perfusão com verapamil bloqueou a ação dos dois hormônios. A reposta despolarizante do IGF-I foi bloqueada pelo JB1, enquanto que a resposta à insulina foi parcialmente bloqueada. Em ratos de 30 dias, apenas a insulina apresentou uma despolarização significativa. IGF-I e insulina também estimularam a captação de cálcio, aminoácido e glicose. A ação da insulina sobre o transporte de cálcio foi totalmente bloqueada pelo JB1 enquanto que do IGF-I foi apenas parcialmente bloqueado. Já sobre o transporte de aminoácido, o JB1 não exerceu qualquer efeito sobre a ação da insulina, enquanto que o efeito do IGF-I foi parcialmente bloqueado. E a estimulação do transporte de glicose pelo IGF-I não foi bloqueada pelo JB1, e a da insulina parcialmente bloqueada. Esses dados mostram que IGF-I e insulina, em diferentes parâmetros, se utilizam não apenas de seus receptores cognatos, mas também de outros receptores de membrana. Dessa forma, ficou claro que a sinalização gerada por esses hormônios nas células de Sertoli depende da presença dos receptores de ambos os hormônios na membrana celular para que eles sejam capazes de interferir nos processos metabólicos e funcionais dessas células. / Insulin and IGF-I are hormones which have high homology. In other words, they have high structural similarity with regard to the sequence of amino acids. As well as the hormones, their membrane receptors are also similar, and the similarity of their amino acid sequences is around 50%. These similarities allow both hormones bind to their receptors with high affinity and to each other's receptor with lower affinity. Both insulin and IGF-I trigger a number of effects on the Sertoli cells, such as transporting glucose and lactate production. Thus, this study aims to investigate the action of IGF-I and insulin on calcium uptake, transport of amino acids and glucose, as well as their electrophysiological actions in Sertoli cells from 12- to 15- and 30-days-old rats. To record the membrane potential were used isolated seminiferous tubules from 12- to 15- and 30-days-old rats. The intracellular recording of Sertoli cells was performed using microcapillaries filled with 3 M KCl coupled to an electrometer. Was performed topical application of IGF-I (100 ng/ml) and insulin (100 mM) alone and also after infusion with verapamil (100 mM) and JB1 (1 μg/ml). The uptake of 45Ca2+ was investigated using whole testes. Tissues were pre-incubated in KRb with 45Ca2+ for 60 minutes to equilibrate intra and extracellular medium. Then, the gonads were incubated for 2 minutes in KRb with 45Ca2+ and with or without IGF-I or insulin. The transport of [14C]MeAIB and [14C]2-DG were also investigated using whole testes. Which was pre-incubated for 30 minutes in KRb without [14C]MeAIB or [14C]2-DG, and further was incubated for 45 minute in KRb with [14C]MeAIB or 120 minutes with [14C]2-DG, with or without the respective hormone to be investigated. The results are given as mean ± SEM. Data were analyzed by Student's t test for comparison between two groups or ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test. IGF-I and insulin produced a depolarizing effect on the membrane potential of Sertoli cells from immature rats. This effect is calcium influx dependent, since the verapamil infusion blocked the action of the two hormones. The depolarizing response of IGF-I was blocked by JB1, whereas the depolarizing response of insulin was partially blocked. In 30-day-old rats, only insulin showed a significant depolarization. Insulin and IGF-I also stimulated the uptake of calcium, amino acids and glucose. The action of insulin on calcium uptake was completely blocked by JB1 while IGF-I was only partially blocked. On amino acid transport, JB1 had no effect on the insulin action, while IGF-I effect was partially blocked. And stimulation of glucose transport by IGF-I was blocked by JB1 and partially blocked the insulin effect. These data show that IGF-I and insulin on different parameters, use not only their cognate receptors, but also other membrane receptors. Thus, it became clear that the signal generated by these hormones in Sertoli cells depends on the presence of receptors for both hormones in the cell membrane to they are able to interfere on the functional and metabolic processes of these cells.

O mecanismo não clássico de testosterona induz resposta celular rápida ao nível de membrana, enquanto que a ação clássica se dá pela ligação da testosterona ao seu receptor androgênico intracelular (iAR) que regula a expressão gênica. A Epitestosterona, o 17α-epímero da testosterona, tem sido descrito como um anti-andrógeno, inibindo o efeito da testosterona ou diidrotestosterona sobre o sobre o iAR. No entanto, a epitestosterona apresenta um efeito não clássico similar ao da da testosterona, despolarizando o potencial de membrana das células de Sertoli e induzindo a captação rápida de Ca2+ nos testículos. O objetivo deste estudo foi analizar o efeito do tratamento com epitestosterona e testosterona em animais castrados quimicamente com a utilização de um antagonista do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), o cetrorelix. Ratos imaturos, a partir do 7º dia de idade receberam durante 7 dias o tratamento pela via intraperitoneal de acordo com os seguintes grupos: Controle (apenas o veículo hidroxipropil-beta-ciclodextrina, castrados (Cetrorelix (500 μg/kg/dia)), castrados com reposição de testosterona (2,5mg/kg/dia) (Cetrorelix+testosterona), castrados com reposição de epitestosterona (2,5mg/kg/dia) (cetrorelix+epitestosterona) e epitestosterona. Foram observados os efeitos dos tratamentos em parâmetros de desenvolvimento sexual de ratos imaturos como: peso corporal, peso testicular e medida da distância anogenital (DAG). Também foram feitos registros eletrofisiológicos da ação no potencial de membrana da testosterona nos túbulos seminíferos de testículos de ratos de todos os tratamentos. Para a avaliação a imunorreatividade ao iAR foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração 1:250. Para o controle-negativo da técnica cortes de todas os tratamentos incubados com PBS-T. Para expressão foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração de 1:1000 realizada pela técnica de Western Blot. A castração química com cetrorelix resultou na redução no peso dos testículos e da DAG. O tratamento com epitestosterona e testosterona restaurou tanto o peso testicular como a DAG. O efeito despolarizante em resposta à aplicação tópica da testosterona foi observado no grupo controle e no grupo de cetrorelix. Além disso, o grupo castrado com cetrorelix com reposição de epitestosterona impediu o efeito rápido da testosterona na despolarização da membrana celular. No grupo com reposição de testosterona, a resposta eletrofisiológica da testosterona na membrana também foi alterada. O tratamento com epitestosterona nos ratos castrados com cetrorelix produziu diminuição da expressão do iAR. Foi observada redução da imunorreatividade do iAR nos animais tratados com epitestosterona. Pode-se concluir que a epitestosterona participa do desenvolvimento genital em ratos imaturos, ou seja, produziu recuperação de AGD de forma semelhante à testosterona. Este resultado sugere que ambos os hormônios atuam pela mesma via de desenvolvimento deste parâmetro, provavelmente através de um mecanismo não-clássico. Além disso, o tratamento com o antagonista de GnRH e reposição de epitestosterona suprimiu a resposta não clássica da testosterona, mudando o padrão de via de sinalização da testosterona nas células de Sertoli. / The non-classical mechanism of testosterone induces a rapid cellular response at the membrane level, while the classical action is through the binding to the intracellular androgenic receptor (iAR) and the regulation of gene expression. Epitestosterone, the 17α-epimer of testosterone, has been described as an anti-androgen, inhibiting the testosterone or dihyidrotestosterone effect on the iAR. However, epitestosterone presents a non-classical effect similar to testosterone, depolarizing the membrane potential of Sertoli cells and inducing rapid Ca2+ uptake in testes. The aim of this study was to observe the effect of the treatment with epitestosterone and testosterone in rats chemically castrated with a gonadotropin-releasing hormone (GnRH) antagonist cetrorelix. From pnd 7 to pnd 14, the rats were given daily intraperitoneal injections with (i) hormones solvent, (2-hydroxypropyl β-cyclodextrin) as the control group (CTRL); (ii) 500 μg/kg/day of the GnRH antagonist cetrorelix as the cetrorelix group (CET); (iii) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of testosterone as the cetrorelix plus testosterone group (CET+T); (iv) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of epitestosterone as the cetrorelix plus epitestosterone group (CET+EpiT); and (v) 2.5 mg/kg of epitestosterone alone as the epitestosterone group (EpiT). The effect of different treatments were verified on the body and testicular weight and the anogenital distance (AGD). The potential and the membrane resistance of Sertoli cells were recorded by electrophysiological technique intracellular record. The electrophysiological effect of testosterone on membrane of Sertoli cells were evaluated in seminiferous tubules in testes from rats of the all experimental groups. For evaluating the immunoreactivity to the iAR we used the anti-iAR primary polyclonal antibody type in concentration 1: 250. For the negative control technique cuts all treatments incubated with PBS-T. For iAR expression we used the anti-iAR type polyclonal primary antibody at a concentration of 1: 1000 performed by the Western Blot technique. The chemical castration induced a reduction in testicular weight and AGD. The treatment with both epitestosterone and testosterone restored the AGD and the testicular weight. The depolarizing effect in response to topical testosterone application was observed in the control group and in the GnRH antagonist cetrorelix group. Moreover, in the GnRH antagonist cetrorelix replaced with the epitestosterone group, testosterone was not capable of changing the membrane potential. In the group replaced with testosterone, the membrane response to testosterone was smaller also. The treatment with epitestosterone in castrated rats also reduced the expression of the iAR in testes. The immunoreaction of iAR was reduced in the animals treated with epitestosterone. In conclusion, the effect of epitestosterone on genital development in immature rats, namely recovering of AGD, was similar to testosterone. This result suggest that both hormones act through the same pathway on this development parameter, probably by a non-classical mechanism. Additionally, the treatment with the GnRH antagonist plus epitestosterone suppressed the non-classical testosterone response, changing the pattern of testosterone signaling pathway through a membrane mechanism in Sertoli cells.

O hormônio folículo-estimulante (FSH) produz um efeito dual sobre o potencial de membrana das células de Sertoli, com uma fase inicial rápida, que compreende uma hiperpolarização, por um período de segundos e uma fase de despolarização, que ocorre mais lentamente, por um período de minutos. A fase de despolarização envolve um mecanismo relacionado à entrada de cálcio estimulada pelo FSH. O Isoproterenol, um agonista de receptores β-adrenérgicos, induz uma hiperpolarização imediata e prolongada na membrana de células de Sertoli de ratos imaturos. Este efeito é provavelmente resultante da queda de [ATP]i a qual libera a inibição exercida pelo nucleotídeo sobre o canal de K+ATP. Dessa forma, objetivou-se estudar a ação do Isoproterenol sobre o potencial de membrana das células de Sertoli para melhor avaliar o componente hiperpolarizante produzido por FSH nas células de Sertoli, além de estudar a captação de Ca2+ estimulada pelo FSH e pelo isoproterenol. O potencial de membrana foi registrado utilizando túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos Wistar machos de 15 dias de idade. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares preenchidos com KCl 3mmol/L acoplados a um eletrômetro. Foi realizada a aplicação tópica isolada de FSH (4mU/mL) e Isoproterenol (2μM). Depois, em experimentos individuais, foram aplicados topicamente, FSH e isoproterenol, 5 minutos após a aplicação tópica da Tolbutamida (10μM) e Glibenclamida (10μM), sulfonilureias de ação hipoglicemiante, que exercem efeito de fechamento dos canais de K+ATP. A Tolbutamida (10μM), ainda, foi perfundida 15 minutos antes da aplicação do Isoproterenol, a fim de testar se esta sulfoniluréia impediria de forma mais significativa a ação deste. Na técnica de captação de Ca2+, utilizou-se FSH e isoproterenol com toxina pertussis (PTX), bloqueador da subunidade Gi da proteína G para avaliar o seu envolvimento na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Utilizou-se a toxina colérica, estimulador da proteína Gs, para avaliar o envolvimento do AMPc na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Fez-se uso de SQ22536, inibidor da enzima adenilato ciclase, para avaliar o envolvimento dessa enzima na ação estimulante do FSH nas células de Sertoli de ratos imaturos. Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados da variação do potencial de membrana foram analisados pelo teste ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni. O FSH teve sua hiperpolarização inibida quando foi aplicado tolbutamida (10μM) anteriormente. O SQ22536 também aboliu a hiperpolarização causada pelo FSH. O Isoproterenol, quando aplicado isoladamente produziu uma resposta hiperpolarizante sobre o potencial de membrana, alterando de – 32,4mV ± 1,32 mV para -40,0 ± 0,78 mv, aos 60 segundos após a sua aplicação (*p<0,001) (n=6 células de Sertoli). A aplicação tópica de Tolbutamida (10 μM) bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando uma despolarização de –41,0± 0,47mV variou até -39,0 ± 2,02mV, aos 120 segundos após a aplicação do Isoproterenol (p>0,05) (n=6 células de Sertoli). A perfusão com Tolbutamida foi mais eficaz no bloqueio da resposta beta-adrenérgica, causando uma despolarização de -41,6 ±1,21 mV para -35,4 ± 0,98 mV, aos 120 segundos após a aplicação tópica do Isoproterenol (p>0,05) (n=9 células de Sertoli). A aplicação tópica de Glibenclamida (10μM), a qual é um inibidor do canal de k +ATP, bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando despolarização, demonstrando que a hiperpolarização do isoproterenol está relacionada com a abertura desses canais. A tolbutamida (10μM), quando aplicada topicamente, impediu a fase de hiperpolarização característica causada pelo FSH (4mU/mL), causando despolarização do potencial de membrana das células de Sertoli de ratos imaturos. O Isoproterenol apresentou uma resposta hiperpolarizante rápida sobre o potencial de membrana, causada, provavelmente, por uma abertura dos canais de K+ATP na membrana das células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. PTX quando aplicada topicamente e anteriormente à aplicação de isoproterenol não impediu a hiperpolarização característica causada por isoproterenol. A ação hiperpolarizante de isoproterenol independe de proteína Gi. PTX não impede a captação de 45Ca2+ estimulada pelo isoproterenol. A toxina colérica, que estimula proteína Gs, não estimula a captação de 45Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. / Follicle-stimulating hormone (FSH) produces a dual effect on the membrane potential of Sertoli cells, with an initial rapid phase, which comprises a hyperpolarization for a period of seconds and a depolarization phase, wich occurs more slowly, within minutes. The depolarization phase involves calcium entry stimulated by FSH. Isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, induces an immediate and prolonged hyperpolarization on the membrane of Sertoli cells from immature rats. The aim of this work is to study the involvement of K+ATP channels in the hiperpolarization effect of isoproterenol on the membrane of Sertoli cells. This work also aimed to study the action of Isoproterenol on the membrane potential of Sertoli cells to better understanding the hyperpolarizing component produced by FSH in Sertoli cells, in addition to study the Ca2+ uptake stimulated by FSH and by isoproterenol. Membrane potential was recorded using isolated seminiferous tubules of testes of 15 days-old rats. The record of intracellular Sertoli cell was performed using microcapillary filled with KCl3 mmol/L coupled to an electrometer. We performed a single topical application of FSH(4mU/mL) and Isoproterenol (2μM). Then, inindividual experiments were applied topically, FSH and isoproterenol, 5 minutes after topical application of Tolbutamide (10μM) and glibenclamide(10μM), sulfonylurea a hypoglycemicaction, exercising effect closing of K+ channels ATP. The Tolbutamide (10μM) also was infused 15 minutes before application of Isoproterenol in order totest whether this would prevents ulfonylurea most significantly to the action of isoproterenol. In the technique of 45Ca2+ uptake, we used FSH and isoproterenol with pertussis toxin (PTX), blocking the G protein subunit Gi to evaluate its involvementon Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. We used the cholera toxin, a stimulator of Gs protein, to evaluate the involvement of AMPc on Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. SQ22536, an inhibitor of the enzyme adenylate cyclase, was used to evaluate the involvement this enzyme in the stimulatory action of FSH in Sertoli cells from immature rats. The results were given as mean ± SEM. The data of the change in membrane potential were analyzed by ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test. The hyperpolarization produced by FSH was inhibited when tolbutamide was applied (10μM). The SQ22536 also abolished the hyperpolarization caused by FSH. The Isoproterenol when used alone produced a hyperpolarizing response on the membrane potential , changing from -32.4mV±1.32 mV to -40.0±0.78 mV at 60 seconds after its application (*p<0.001) (n=6Sertoli cells). Topical application of Tolbutamide (10μM) blocked the action of Isoproterenol (2μM), causing a depolarization of -41.0±0.47 mV ranged up to-39.0± 2.02 mV at 120 seconds after application of Isoproterenol (p>0.05) (n=6Sertoli cells). The Tolbutamide infusion was more effective inblocking beta-adrenergic response, causing a depolarization of -41,6 ±1,21 mV to -35,4 ± 0,98 mV at 120seconds after the topical application of Isoproterenol (p>0.05) (n=9Sertoli cells). Isoproterenol produces a rapid hyperpolarization on membrane potential of Sertoli cells. This effect was blocked by tolbutamide, indicating that the activation of beta-adrenergic receptors involves opening of K+ATP channels in the membrane of Sertoli cells from immature rat testes. PTX,when applied topically prior to application of isoproterenol did not prevent the characteristic hyperpolarization caused by isoproterenol. The hyperpolarizing action of isoproterenol is independent of Gi protein. PTX does not prevent the uptake of 45Ca2+ stimulated by isoproterenol. The cholera toxin, which stimulates Gs protein, does not stimulate 45Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats.

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Tem sido proposto que o criptorquidismo, baixa qualidade espermática, hipospádia e tumor testicular de células germinativas (TTCG) compreendem a síndrome de disgenesia testicular (SDT), que tem origem comum durante a vida fetal. A criptorquidia induz degeneração do epitélio seminífero com depleção de células germinativas, distúrbios em células de Leydig e de Sertoli e diminuição do diâmetro dos túbulos seminíferos. A correcção cirúrgica da criptorquidia (orquidopexia) tem sido utilizada a fim de diminuir o risco de infertilidade e câncer testicular. No entanto, o melhor tempo para realizar esta cirurgia, a fim de obter os melhores resultados tem sido uma preocupação. Além disso, não existe um modelo experimental disponível na literatura que explore alterações morfológicas testiculares associadas à criptorquidia e orquidopexia. Neste estudo, criptorquidismo foi induzido em ratos Sprague-Dawley com 3 semanas de vida; orquidopexia foi realizada em três momentos diferentes (3, 5 e 9 semanas após a cirurgia de criptorquidia), e os animais de cada grupo foram sacrificados após 3 e 8 semanas de recuperação. As análises histológicas e estimativas quantitativas como a média do diâmetro do túbulo seminífero (MSTD), incidência de vacúolos no epitélio, e o número de células de Sertoli por túbulo, alepm da imunoistoquímica para citoqueratina 18 foram realizados para avaliar alterações testiculares após as cirurgias de criptorquidia e orquidopexia. A criptorquidia provocou degeneração e esfoliação de células germinativas, aumento da incidência de vacúolos intra-epiteliais e diminuição da MSTD e dos pesos dos testículos. No grupo de recuperação de 3 semanas, muitas das alterações constatadas na criptorquidia ainda estavam presentes, a gravidade destas alterações foi proporcional ao período em que os testículos permaneceram na cavidade abdominal até orquidopexia. Após o período de recuperação de 8 semanas, a orquidopexia reverteu quase todas as alterações, independentemente do momento cirúrgico em que foi realizada. Em conclusão, a intensidade dos danos no testículo foi maior nos animais que permaneceram criptorquídicos por mais tempo, sem alterações no número de células de Sertoli, mas com uma provável perturbação da sua função. O modelo adotado pode ser útil para estudar alterações testiculares induzidas pelo criptorquidismo e a recuperação potencial do testículo de ratos após orquidopexia. / Cryptorchidism, or undescended testis, is one of the most common urogenital abnormalities in newborn boys and one of the main risk factors for infertility and testicular cancer. It has been proposed that cryptorchidism, low sperm quality, hypospadia and testicular germ cell tumor (TGCT) comprise the testicular dysgenesis syndrome (TDS) and that they have a common origin during the fetal life. Cryptorchidism induces seminiferous epithelium degeneration with germ cell depletion, Leydig and Sertoli cell disorders and decreased tubule diameter. The surgical correction of cryptorchidism (orchidopexy) has been applied in order to decrease the risk for infertility and testicular cancer. However, the best moment to perform this surgery in order to obtain successful results has been a concern. Moreover, there is no experimental model available in the literature that explores comprehensively testicular morphological alterations associated to cryptorchidism and orchidopexy. In this study, cryptorchidism was induced in 3-week old Sprague-Dawley rats; orchidopexy was performed at three different moments (3, 5 and 9 weeks after cryptorchidism surgery), and the animals of each group were sacrificed after 3 and 8 weeks of recovery. Histological analyses, and quantitative estimates such as seminiferous tubule diameter (MSTD), incidence of vacuoles in the tubules, and number of Sertoli cells per tubule, and immunohistochemistry for cytokeratin 18 were performed to evaluate testicular alterations after cryptorchidism and orchidopexy surgeries. Cryptorchidism induced germ cell degeneration and exfoliation, increased incidence of intraepithelial vacuoles and decreased MSTD and testes weights. In the 3-week recovery group, many of the alterations seen in cryptorchidism were still present, the severity of these alterations being proportional to the period the testes remained in abdominal cavity until orchidopexy. After the 8-week recovery period, orchidopexy reversed almost all of the alterations irrespective the surgical moment it was performed. In conclusion, the intensity of the damages in the testis was greater in those animals that remained cryptorchid for a longer time, with no alterations in the number of Sertoli cells but with a probable disruption of its function. The adopted model can be useful to study testicular alterations induced by cryptorchidism and the potential recovery of rat testis after orchidopexy. / FAPESP: 2012/09873-4

O hormônio folículo-estimulante (FSH) produz um efeito dual sobre o potencial de membrana das células de Sertoli, com uma fase inicial rápida, que compreende uma hiperpolarização, por um período de segundos e uma fase de despolarização, que ocorre mais lentamente, por um período de minutos. A fase de despolarização envolve um mecanismo relacionado à entrada de cálcio estimulada pelo FSH. O Isoproterenol, um agonista de receptores β-adrenérgicos, induz uma hiperpolarização imediata e prolongada na membrana de células de Sertoli de ratos imaturos. Este efeito é provavelmente resultante da queda de [ATP]i a qual libera a inibição exercida pelo nucleotídeo sobre o canal de K+ATP. Dessa forma, objetivou-se estudar a ação do Isoproterenol sobre o potencial de membrana das células de Sertoli para melhor avaliar o componente hiperpolarizante produzido por FSH nas células de Sertoli, além de estudar a captação de Ca2+ estimulada pelo FSH e pelo isoproterenol. O potencial de membrana foi registrado utilizando túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos Wistar machos de 15 dias de idade. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares preenchidos com KCl 3mmol/L acoplados a um eletrômetro. Foi realizada a aplicação tópica isolada de FSH (4mU/mL) e Isoproterenol (2μM). Depois, em experimentos individuais, foram aplicados topicamente, FSH e isoproterenol, 5 minutos após a aplicação tópica da Tolbutamida (10μM) e Glibenclamida (10μM), sulfonilureias de ação hipoglicemiante, que exercem efeito de fechamento dos canais de K+ATP. A Tolbutamida (10μM), ainda, foi perfundida 15 minutos antes da aplicação do Isoproterenol, a fim de testar se esta sulfoniluréia impediria de forma mais significativa a ação deste. Na técnica de captação de Ca2+, utilizou-se FSH e isoproterenol com toxina pertussis (PTX), bloqueador da subunidade Gi da proteína G para avaliar o seu envolvimento na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Utilizou-se a toxina colérica, estimulador da proteína Gs, para avaliar o envolvimento do AMPc na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Fez-se uso de SQ22536, inibidor da enzima adenilato ciclase, para avaliar o envolvimento dessa enzima na ação estimulante do FSH nas células de Sertoli de ratos imaturos. Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados da variação do potencial de membrana foram analisados pelo teste ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni. O FSH teve sua hiperpolarização inibida quando foi aplicado tolbutamida (10μM) anteriormente. O SQ22536 também aboliu a hiperpolarização causada pelo FSH. O Isoproterenol, quando aplicado isoladamente produziu uma resposta hiperpolarizante sobre o potencial de membrana, alterando de – 32,4mV ± 1,32 mV para -40,0 ± 0,78 mv, aos 60 segundos após a sua aplicação (*p<0,001) (n=6 células de Sertoli). A aplicação tópica de Tolbutamida (10 μM) bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando uma despolarização de –41,0± 0,47mV variou até -39,0 ± 2,02mV, aos 120 segundos após a aplicação do Isoproterenol (p>0,05) (n=6 células de Sertoli). A perfusão com Tolbutamida foi mais eficaz no bloqueio da resposta beta-adrenérgica, causando uma despolarização de -41,6 ±1,21 mV para -35,4 ± 0,98 mV, aos 120 segundos após a aplicação tópica do Isoproterenol (p>0,05) (n=9 células de Sertoli). A aplicação tópica de Glibenclamida (10μM), a qual é um inibidor do canal de k +ATP, bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando despolarização, demonstrando que a hiperpolarização do isoproterenol está relacionada com a abertura desses canais. A tolbutamida (10μM), quando aplicada topicamente, impediu a fase de hiperpolarização característica causada pelo FSH (4mU/mL), causando despolarização do potencial de membrana das células de Sertoli de ratos imaturos. O Isoproterenol apresentou uma resposta hiperpolarizante rápida sobre o potencial de membrana, causada, provavelmente, por uma abertura dos canais de K+ATP na membrana das células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. PTX quando aplicada topicamente e anteriormente à aplicação de isoproterenol não impediu a hiperpolarização característica causada por isoproterenol. A ação hiperpolarizante de isoproterenol independe de proteína Gi. PTX não impede a captação de 45Ca2+ estimulada pelo isoproterenol. A toxina colérica, que estimula proteína Gs, não estimula a captação de 45Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. / Follicle-stimulating hormone (FSH) produces a dual effect on the membrane potential of Sertoli cells, with an initial rapid phase, which comprises a hyperpolarization for a period of seconds and a depolarization phase, wich occurs more slowly, within minutes. The depolarization phase involves calcium entry stimulated by FSH. Isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, induces an immediate and prolonged hyperpolarization on the membrane of Sertoli cells from immature rats. The aim of this work is to study the involvement of K+ATP channels in the hiperpolarization effect of isoproterenol on the membrane of Sertoli cells. This work also aimed to study the action of Isoproterenol on the membrane potential of Sertoli cells to better understanding the hyperpolarizing component produced by FSH in Sertoli cells, in addition to study the Ca2+ uptake stimulated by FSH and by isoproterenol. Membrane potential was recorded using isolated seminiferous tubules of testes of 15 days-old rats. The record of intracellular Sertoli cell was performed using microcapillary filled with KCl3 mmol/L coupled to an electrometer. We performed a single topical application of FSH(4mU/mL) and Isoproterenol (2μM). Then, inindividual experiments were applied topically, FSH and isoproterenol, 5 minutes after topical application of Tolbutamide (10μM) and glibenclamide(10μM), sulfonylurea a hypoglycemicaction, exercising effect closing of K+ channels ATP. The Tolbutamide (10μM) also was infused 15 minutes before application of Isoproterenol in order totest whether this would prevents ulfonylurea most significantly to the action of isoproterenol. In the technique of 45Ca2+ uptake, we used FSH and isoproterenol with pertussis toxin (PTX), blocking the G protein subunit Gi to evaluate its involvementon Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. We used the cholera toxin, a stimulator of Gs protein, to evaluate the involvement of AMPc on Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. SQ22536, an inhibitor of the enzyme adenylate cyclase, was used to evaluate the involvement this enzyme in the stimulatory action of FSH in Sertoli cells from immature rats. The results were given as mean ± SEM. The data of the change in membrane potential were analyzed by ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test. The hyperpolarization produced by FSH was inhibited when tolbutamide was applied (10μM). The SQ22536 also abolished the hyperpolarization caused by FSH. The Isoproterenol when used alone produced a hyperpolarizing response on the membrane potential , changing from -32.4mV±1.32 mV to -40.0±0.78 mV at 60 seconds after its application (*p<0.001) (n=6Sertoli cells). Topical application of Tolbutamide (10μM) blocked the action of Isoproterenol (2μM), causing a depolarization of -41.0±0.47 mV ranged up to-39.0± 2.02 mV at 120 seconds after application of Isoproterenol (p>0.05) (n=6Sertoli cells). The Tolbutamide infusion was more effective inblocking beta-adrenergic response, causing a depolarization of -41,6 ±1,21 mV to -35,4 ± 0,98 mV at 120seconds after the topical application of Isoproterenol (p>0.05) (n=9Sertoli cells). Isoproterenol produces a rapid hyperpolarization on membrane potential of Sertoli cells. This effect was blocked by tolbutamide, indicating that the activation of beta-adrenergic receptors involves opening of K+ATP channels in the membrane of Sertoli cells from immature rat testes. PTX,when applied topically prior to application of isoproterenol did not prevent the characteristic hyperpolarization caused by isoproterenol. The hyperpolarizing action of isoproterenol is independent of Gi protein. PTX does not prevent the uptake of 45Ca2+ stimulated by isoproterenol. The cholera toxin, which stimulates Gs protein, does not stimulate 45Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats.