Danos ao sistema nervoso central (SCN) resultam em perda de conexões axonais, das funções motoras e sensoriais. Uma das estratégias para seu reparo é o transplante de células-tronco mesenquimais (CTMs). Porém essa alternativa requer uma adequada via de aplicação. Nesse sentido, o uso de matrizes alinhadas pode ser usado para apoiar o crescimento e diferenciação das CTMs e, quando incorporadas com fatores de crescimento, otimizam o processo de regeneração tecidual. O objetivo desse trabalho foi avaliar a diferenciação neural das CTMs cultivadas sobre matrizes de nanofibras orientadas com o fator de crescimento epidermal (EGF) incorporado. Os scaffolds com fibras alinhadas foram produzidos por electrospinning de emulsão e avaliados conforme a sua morfologia, o diâmetro das nanofibras, a degradabilidade e a liberação do EGF. As CTMs utilizadas foram provenientes da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Essas células foram cultivadas nos scaffolds e avaliadas conforme os testes biológicos: adesão, viabilidade, proliferação, citotoxicidade e diferenciação neural. Os scaffolds com fibras alinhadas controle (AC) e contendo o EGF (AE) apresentaram morfologia, diâmetro das nanofibras e tempo de degradação semelhantes. Com base no total de EGF presente na matriz AE, 90,14% foi liberado após 28 dias. O citoesqueleto e o núcleo das CTMs cultivadas nos scaffolds AC e AE estavam mais alongados e alinhados quando comparado com as CTMs cultivadas no poço de cultura (controle). As CTMs aderiram mais nas matrizes AE em relação às matrizes AC, porém a proliferação e viabilidade celular foram similares, exceto no tempo de 72 horas, o qual a viabilidade no grupo controle foi maior, em comparação aos demais grupos. Os scaffolds AC e AE não foram tóxicos para as CTMs. Em relação aos resultados da neuro-diferenciação, a expressão de nestina e neurofilamentos consideravelmente maior em todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle. A expressão de βIII-tubulina e GFAP foi maior em todos os grupos diferenciados quando comparada ao grupo controle. A maioria das CTMs cultivadas nas matrizes AC e AE, induzidas ou não à diferenciação neural, apresentaram correntes dependente de voltagem para sódio. O valor de condutância máxima foi maior para todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle onde as células não foram diferenciadas. Portanto, as matrizes com nanofibras orientadas induzem à diferenciação neural das CTMs em neurônios funcionais tanto na ausência como na presença de EGF incorporado. As matrizes AE ainda mostraram ser capazes de melhorar a adesão celular. Dessa forma, conclui-se que as matrizes de nanofibras estudadas são uma possível estratégia para otimização da regeneração de lesões neurológicas. / Damage to the central nervous system (CNS) results in loss of axonal connections and motor and sensory functions. One of the strategies for its repair is the transplantation of mesenchymal stem cells (MSCs). However, this requires a suitable application route. Accordingly, the use of scaffolds support the growth of MSCs and, when incorporated with growth factors, optimize the regeneration process. The purpose of this study was to evaluate the neural differentiation of MSCs cultured on nanofiber matrices oriented with epidermal growth factor (EGF) incorporated. Aligned scaffolds were produced by electrospinning emulsion and evaluated according to their degradation, the morphology and diameter of the nanofibers, and release of EGF from the nanofibers. MSCs used were from human exfoliated deciduous teeth (SHED). These cells were cultured on the scaffolds and evaluated according to biological tests: adhesion, viability, proliferation, cytotoxicity and neural differentiation. The aligned control scaffolds (AC) containing EGF (AE) presented similar morphology, diameter of nanofibers and degradation time. Based on the total EGF present in the scaffold AE, 90.14% was released after 28 days. The cytoskeleton and the core of the MSCs cultured on scaffolds AC and AE were more aligned and elongated when compared to the MSCs grown on plate wells (control). MSCs adhered more to matrices AE when compared to matrices AC, although proliferation and cell viability were similar, except after 72 hours. In this period, the viability of the control group was higher when compared to the rest of the groups. Scaffolds AC and AE were not toxic to MSCs. In regard to the results of neuro-differentiation, the expression of nestin and neurofilament was much higher in all groups than the control group. The expression of βIII tublin and GFAP was higher in all differentiated groups than the control group. Most of the MSCs grown in matrices AC and AE, induced or not to neural differentiation, showed voltage-dependent sodium currents. The maximum value of conductance of these groups was higher for the cells in all groupscompared to the control group, where the cells were not differentiated. Therefore, oriented nanofiber matrices induce neural differentiation of MSCs into functional neurons both in the absence and in the presence of incorporated EGF. The matrices AE also showed improved cell adhesion. Thus, these matrices are a possible strategy for optimizing the regeneration of neurologic lesions.

A cirurgia endoscópica transluminal por orifícios naturais (NOTES) é uma nova modalidade cirúrgica caracterizada pela ausência de incisões cutâneas. Diferentes vias de acesso para a NOTES já foram testadas, porém, existem poucos estudos sobre os efeitos imunomoduladores da via transretal e de sua associação com as células-tronco mesenquimais (MSCs) como adjuvante nos efeitos anti-inflamatórios e na cicatrização retal. Este trabalho objetivou avaliar a exequibilidade da técnica NOTES transretal, os efeitos imunomodulatórios e regenerativos desta abordagem cirúrgica e sua associação com as MSCs em um modelo experimental suíno. A tese foi divida em quatro capítulos sendo que o primeiro trata de uma revisão bibliográfica sobre as vias de acesso para a NOTES e suas implicações. O segundo objetivou testar a exequibilidade da via transretal em três suínos, o que demonstrou ser um acesso alternativo para procedimentos abdominais. O terceiro capítulo avalia a resposta inflamatória da técnica NOTES e da sua associação com MSC derivadas de tecido adiposo. Para isso, 11 suínos foram submetidos a NOTES transretal e distribuídos aleatoriamente em dois grupos: GNOTES e GNOTES+MSC. Amostras de sangue foram coletadas em diferentes tempos para exames de hemograma, albumina, proteína C reativa (PCR) e interleucina- 6 (IL-6). Não houveram alterações entre os grupos quanto aos valores de hemograma, albumina e PCR, sendo que a IL-6 foi indetectável em todos os animais. Histologicamente, foi observado menor quantidade de células inflamatórias no GNOTES+MSC na camada muscular. Estes dados sugerem que tanto a técnica NOTES quanto as MSCs atenuam os efeitos inflamatórios do procedimento. Um prolapso retal ocorrido como complicação da técnica NOTES transretal foi detalhadamente descrito no quarto capítulo. Assim, a técnica NOTES associada ou não às MSCs no sítio da incisão apresenta mínima resposta inflamatória em suínos submetidos à peritoneoscopia transretal. / Natural orifice transluminal endoscopic surgery (NOTES) is an evolving surgical approach to be performed without skin incisions. Different access sites have been tested, however, studies regarding immunomodulation of the transrectal approach and its association with mesenchymal stem cells (MSC) are still lacking. The viability of transrectal NOTES and the associated effects of MSC local therapy on rectal healing and inflammation were tested in a porcine model. The results of the study are depicted in fours chapters. The first chapter presents a literature review and state-of-the-art on the accesses for NOTES. The subsequent paper describes the transrectal approach performed in three pigs and its viability as an alternative access to abdominal endoscopic procedures. In the third chapter, the evaluation of the inflammatory response with transrectal NOTES and adipose tissue MSC therapy is presented. For that, 11 pigs were either submitted to NOTES only or NOTES with local MSC application. Blood samples, peritoneal fluid, and post-mortem rectal tissue specimens were collected. Total blood count, albumin and C-reactive protein showed no significant differences between groups. Interleukin-6 was undetectable in both groups. Histological evaluations demonstrated less inflammatory cells in the muscular layer of rectum of the animals where NOTES was associated with MSC. A possible lessening of the immune response may be seen with NOTES with or without MSCs; however, the presence of MSC attenuate the local inflammatory reaction in the muscular layer of porcine rectum after transrectal NOTES. A rectal prolapse that occurred after transrectal NOTES in one pig is reported in the last chapter. The transrectal NOTES technique with or without the MSCs at the incision site shows minimal inflammatory response in porcine.

As células-tronco mesenquimais humanas derivadas de tecido adiposo, do inglês human adipose-derived stem cells (hADSC), são células progenitoras que residem entre adipócitos e armazenam lipídios neutros, principalmente triglicerídeos e ésteres de colesterol (TG e EC), em gotas lipídicas citoplasmáticas (GLC), contribuindo para o turnover do tecido adiposo. As GLC são organelas que desempenham um papel crucial na homeostasia energética e no metabolismo dessas células. Caveolas são invaginações de 50-100 nm que foram inicialmente caracterizadas por microscopia eletrônica. A forma e a organização estrutural das caveolas deve-se a proteínas especificas da família das caveolinas (caveolina-1, -2 e -3) que se associam em oligômeros para formar cavidades/invaginações na membrana plasmática. A função das caveolinas na formação das GLC está relacionada com a captação de ácidos graxos e seu metabolismo, e a relação existente entre estes dois componentes celulares parece ser crucial para manutenção da homeostasia celular. Muitas organelas que são funcionalmente conectadas ao metabolismo de lipídeos são encontradas justapostas as GLC. Distinções morfológicas observadas reforçam diferenças que podem existir na maneira pelas quais as GLC interagem com outras organelas em adipócitos. Sítios de contatos entre membranas, do inglês membrane contact sites (MCS), são descritos para muitas organelas e parecem funcionalmente importantes nos processos de interações entre as GLC e outras organelas celulares. O presente trabalho avaliou as diferenças ultraestruturais entre hADSC diferenciadas ou não para pré-adipócitos, comparando com células 3T3-L1. Também foram avaliadas, através de microscopia eletrônica de transmissão, as interações das GLC com outras organelas celulares durante a diferenciação adipogênica, pois apesar de sua importância no metabolismo energético e em várias doenças, as GLC são pouco compreendidas como organelas celulares. De fato, o tamanho, a composição e a regulação das GLC variam consideravelmente entre organismos e tipos celulares. A complexidade das interações das GLC com outras organelas também varia consideravelmente em adipócitos e não adipócitos. Este trabalho mostrou a importância de estudos que visam esclarecer como as GLC são formadas, modificadas e reguladas. Através destes estudos poderemos ter uma melhor compreensão acerca da relação existente entre o acúmulo excessivo de lipídios no organismo e a chamada síndrome metabólica (obesidade, diabetes e aterosclerose). / Human adipose-derived stem cells (hADSC) are progenitor cells that reside between adipocytes, store neutral lipids, especially triglycerides and cholesterol esters (TG and CE) into cytoplasmic lipid droplets (CLD), contributing to the turnover of the adipose tissue. The CLD are organelles that play a crucial role in energy homeostasis and cell metabolism. Caveolae are invaginations of 50-100 nm that were initially characterized by transmission electron microscopy. The shape and structural organization of caveolae are held by specific proteins of the family of caveolinas (caveolin-1, -2 and -3) that associate to form oligomers in cavities/invaginations on the plasma membrane. The caveolin functions on the CLD development are related to the fatty acid uptake and its metabolism. The relationship between these cell components seems to be pivotal for the cellular homeostasis maintenance. Many organelles that are functionally connected to lipid metabolism are found juxtaposed to the CLD. Morphologic distinctions reveal the differences that may exist in the way through which the CLD interact with other organelles within adipocytes. The membrane contact sites (MCS) have been described for many organelles and seems to be functionally important in the interaction processes with CLD. This work evaluated the ultrastructural differences between hASDC differentiated or not to pre-adipocyte compared to the 3T3-L1 cells. It was also evaluated through transmission electron microscopy, the CLD interactions to the others cellular organelles in hASDC during adipogenesis induction because, despite its importance in energy metabolism and in various diseases, the CLD are poorly understood as cell organelles. Indeed, the size, composition and regulation of GLC vary considerably between organisms and cell types. The complexity of CLD interactions with other organelles also ranged considerably between adipocytes and undifferentiated. This work showed the importance of studies that aim the clarify how the CLD are formed, modified and regulated. Through these studies it is possible to get a better understanding of the relationship between the excessive accumulation of body lipids and the metabolic syndrome (obesity, diabetes and atherosclerosis).

Orientadora: Profa. Dra. Marcela Sorelli Carneiro Ramos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014. / A ativação de fatores inflamatórios em um quadro de insuficiência renal isquêmica pode afetar outros órgãos, como o coração. Esses fatores lesionam o tecido cardíaco que, então, sofre um remodelamento, com a hipertrofia dos cardiomiócitos e pode evoluir para a hipertrofia cardíaca. O desenvolvimento de pesquisas com células-tronco demonstram que estas células secretam fatores que protegem o tecido cardíaco da injúria, modulam fatores inflamatórios e diminuem a formação de fibrose, o que despertou o interesse pelo seu uso em terapias para algumas cardiopatias. Este projeto teve como intuito avaliar as alterações ocasionadas pela introdução de células-tronco em modelos de hipertrofia cardíaca, devido um quadro de insuficiência renal. Para isso, camundongos C57BL/6 foram submetidos à oclusão unilateral do pedículo renal esquerdo por 60 minutos, com a aplicação de células-tronco mesenquimais via plexo retro-orbital um dia após a cirurgia. Os corações e rins dos modelos animais foram caracterizados por meio de estudos morfológicos. Os resultados obtidos demonstraram que as células-tronco preveniram o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca, uma vez que não se verificou o aumento de massa, aumento de volume ou diminuição do lúmen do ventrículo esquerdo dos animais que receberam uma aplicação dessas células. Além disso, verificou-se também uma ação moduladora das células-tronco nos rins direitos, que não apresentaram um aumento de massa ou volume. No entanto, nenhum dado obtido demonstrou uma ação protetora dessas células nos rins esquerdos, diretamente afetados pela cirurgia de indução de lesão isquêmica. Logo, pela primeira vez, foi demonstrado que a aplicação de células-tronco mesenquimais preveniu o desenvolvimento da hipertrofia nos grupo tratados. / Activation of inflammatory factors in ischemic renal failure condition affects other organs as well as the heart. The inflammatory factors injure the cardiac tissue, modulating heart trophism with cardiomyocytes hypertrophy and this pathologic condition may progress to cardiac hypertrophy. Development of stem cell research has shown that it secrete factors that protect cardiac tissue of the injury, modulate inflammatory factors and decreases fibrosis. These discoveries have motivated studies with stem cells in cardiac diseases. This study aimed to evaluate the morphological alterations caused by the stem cells introduction on renal ischemia/reperfusion induced cardiac hypetrophy models. To analyze the stem cell effect at this model, C57BL/6 mice were subjected to unilateral occlusion of left renal pedicle for 60 minutes and one day after surgical procedures mesenchymal stem cells were applied via retro orbital sinus. Hearts and kidneys of the animal models were characterized by morphological study. and, for the first time, we evidenced that mesenchymal stem cells treatment prevents the renal ischemia/reperfusion induced cardiac hypertrophy. The results evidenced the stem cell capacity to prevent cardiac hypertrophy development, since there were no mass increase, volume increase or decrease of left ventricular lumen area on animals that received a stem cells injection. Moreover, it was verified a modulating capacity of stem cells on right kidneys that didn't presented increase in mass or volume. However, no data indicated a protective role of these cells in the left kidneys. Thus, for the first time, we evidenced that mesenchymal stem cells treatment prevents the renal ischemia/reperfusion induced cardiac hypertrophy.

Orientador: Prof. Dr. Arnaldo Rodrigues dos Santos Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2014. / Na engenharia de tecidos, a utilização de uma fonte de celular juntamente com um biomaterial, representa uma alternativa clínica a ser aplicada a pacientes com graves lesões no tecido ósseo. Este estudo teve como objetivo avaliar células Vero, uma linhagem de célula fibroblásticas, e uma linhagem de células-tronco mesenquimais (Rat (SD) Mesenchymal Stem Cells) em testes de biocompatibilidade in vitro com polímeros de poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV), poli(caprolactona) (PCL) e blendas 75/25 e 50/50 desenvolvidos para a bioengenharia de tecido ósseo. A diferenciação osteogênica das CTMs sobre os polímeros também foi analisada. Os biomateriais foram caracterizados morfologicamente através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Estereoscópio e Micrômetro. Polímeros porosos se mostram mais espesso que os densos. Através das imagens obtidas nota-se a distribuição, tamanho e morfologia dos poros, notando que os polímeros se mostram com características condizentes a de outros trabalhos. As células Vero e células-tronco mesenquimais (CTMs) foram cultivadas sobre as amostras citadas. Realizamos o ensaio com o MTT, análise morfológica e citoquímica. Para as CTMs fizemos ainda ensaios para avaliar a diferenciação osteogênica (fosfatase alcalina e vermelho alizarina). Nenhum dos polímeros foi considerado tóxico para as células Vero e na maioria deles foi notada atividade celular, camadas de células bem distribuídas. As blendas 50/50 mostraram resultados um pouco inferiores, quanto ao MTT, essa blenda porosa demonstrou ser a uma amostra onde adesão ocorre de forma bem mais lenta, os demais polímeros apresentaram resultados semelhantes e até superiores ao controle positivo de adesão, principalmente o PCL denso. Apesar das amostras 50/50 densa e porosa não se mostrarem tóxicas, aparentemente não funcionam com bons substratos como os demais polímeros, também apresentaram várias dificuldades na técnica de preparação, sendo assim descartadas. A relação das CTMs com os biomateriais se mostrou semelhante aos resultados com Vero. As células foram capazes de se espalhar por quase toda a superfície dos polímeros inclusive entre os poros dos materiais porosos. As CTMs apresentaram resultados de adesão (MTT) sobre os polímeros, mais rápido do que a Vero, demonstrando também maior afinidade pelo PCL denso. Através da análise da atividade da enzima fosfatase alcalina (usada como marcador de diferenciação), notamos que as células-tronco se mostraram capazes de se diferenciar em contato com os polímeros. Esses dados foram confirmados com o vermelho de alizarina, que também mostrou que a diferenciação celular se mostra um pouco mais lenta nos materiais do que nas placas. De uma forma geral os polímeros com exceção das blendas 50/50 se mostraram como bons substratos para as células, com ausência de toxicidade, características morfológicas dentro do recomendado e, além disso, não bloqueiam respostas biológicas específicas, como a diferenciação osteogênica. / In tissue engineering, the use of a cell source coupled with biomaterial represents a clinical alternative which can be applied to patients with severe bone damage. This study aimed to evaluate the biocompatibility between Vero a fibroblastic cell line and Mesenquymal stem cells (Rat (SD) MSC) with biomaterials developed as scaffolds for bone tissue engineering, bioresorbable polymers composed of poly ( hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate ) [ PHVB ] and poly ( caprolactone ) [ PCL ] pure and ratios of (75 /25) and (50 /50) blends. The osteogenic differentiation of MSCs on the polymers was also analyzed. Morphological characterization of the materials was performed by Scanning Electron Microscopy (SEM), Stereoscope and micrometer. The porous polymers are thicker than dense. Through the images obtained it is possible to note distribution, morphology and pore size. The biomaterials seem to the same consistent characteristics of other studies. Vero cells and mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured on the samples mentioned. We performed the assay with MTT, morphological and histochemical analysis. About MSCs we also evaluated the osteogenic differentiation (alkaline phosphatase and Alizarin red). None of the polymers was considered toxic to Vero cells and most of them presented cellular activity, layers of well-distributed cells was noted in most of them. However 50/50 blends showed no such significant results as other. In the MTT assay, this porous blend demonstrated to be the only sample where adhesion occurs more slowly, other polymers showed similar and even higher results than the adhesion positive control, especially the dense PCL. Although the dense and porous 50/50 samples do not show toxic, apparently they are not good substrates as the other polymers, also presented several difficulties in their preparation thus being discarded. The ratio of MSCs with biomaterials was similar to the Vero cells results. They were able to spread to almost all surface of the polymers including into the pores of porous materials. MSCs showed adhesion (MTT) faster than the Vero cell, also demonstrated a greater affinity for dense PCL sample. Through analysis of the enzyme alkaline phosphatase activity (used as a marker for differentiation), we noticed that the stem cells showed differentiation into contact with the polymers. These data were confirmed by alizarin red, which also showed that the cell differentiation was slower on the materials than on the plates. In general all the polymer blends but the 50/50 proved to be good substrates for cells, with no toxicity, morphological characteristics within recommended and in addition do not block specific biological responses, such as osteogenic differentiation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-27Bitstream added on 2014-06-13T21:02:18Z : No. of bitstreams: 1 hernandeztovar_mc_dr_jabo.pdf: 3642290 bytes, checksum: c426af96b828f5acd5ad320a0cdb0514 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este projeto tem como proposta avaliar o comportamento biológico das células estromais mesenquimais multipotentes autólogas associadas ou não às matrizes de colágeno, na reconstrução tendínea. Optou-se em trabalhar com ovinos e, para isso, os ovinos foram submetidos à ferida no tendão flexor superficial do membro torácico esquerdo, que consistiu na realização de uma tenectomia parcial medindo 1,5cm de comprimento e 0,3cm de largura. Aos 30, 60 e 90 dias após o procedimento cirúrgico foram retirados os tendões flexores superficiais dos membros torácicos dos animais e os fragmentos colhidos foram destinados para procedimento histológico, e de microscopia eletrônica de varredura. Nas avaliações histopatológicas evidenciou-se aumento na quantidade de fibroblastos aos 30, 60 e 90 dias após a intervenção cirúrgica, além de uma desorganização severa da matriz colágena nos diferentes grupos. A microscopia eletrônica de varredura mostrou nos tendões do grupo controle (G1) aos 30, 60 e 90 dias após o procedimento cirúrgico, fibras colágenas finas, ramificadas com perda do arranjo, quando comparadas com as fibras colágenas do tendão normal. O grupo G2 apresentou melhor organização das fibras, porém similares às observadas no G1. Já no grupo G3 a melhor organização e arranjo das fibras colágenas foram evidentes. Dessa maneira, esses resultados permitem inferir que a engenharia de tecidos utilizando CTMs associadas a enxertos biológicos apresentam tratamento clínico promissor para a reparação de tendões / This project has as purpose to pick, cultivate, characterize and study the biological behavior of the Mesenchymal Stem Cells and the collagen scalffold, in the reconstruction of the connective tissue Tendons. It was decided to work with sheep and, therefore, three treatments were accomplished using Autologous Mesenchymal Stem Cells and applied in the superficial flexor tendon of the left thoracic member of the sheep, injured for the experience. The sheep were submitted to the wound in the superficial flexor tendon of the left thoracic limb that consisted of an accomplishment of a partial tenectomic measuring 1,5cm of length and 0,3cm of width. After 30, 60 and 90 days after the surgical procedure, the superficial flexor tendons of the left thoracic limb of the animals were withdrawed and the picked fragments were sent to histology procedure, and Scan electron microscopy. In the histopatology evaluations, there was an increase of fibroblast amount after 30, 60 and 90 days after the surgical intervention of the control group (G1), the one treated with collagen scalfod, and the one treated with collagen scalffold associated to the Mesenchymal Stem Cells, besides of sever disorganization of the main collage which was more severe at the 30 days in the different groups when compared to the normal tissue. The Scan electron microscopy showed in the tendons of the control group (G1) after, 30, 60 and 90 days after the surgical procedure thin collagen fibers, ramified with lose of arrangement, when compared to the collagen fibers of the normal tendon. Group G2 showed better organization of the fibers, however, similar to the ones observed in G1. In G3, the best organization and arrangement of the collagen fibers were evident. Finally, it can be verified that the implantation of collagen scalfold associated to Mesenchymal Stem Cells is of great importance to the wound healing

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5178.pdf: 2466586 bytes, checksum: be50519a129b12383d84e69ae25b54db (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / The use of mesenchymal stromal cells (MSCs) for clinical therapy has been limited by the low amount of cells that can be obtained directly from tissue, making it necessary to develop techniques for in vitro cell number expansion. The current methods of expansion are laborintensive, exhibit unfavorable environments for cell growth, show still modest levels of expansion and low yield in the recovery of these cells. In the search for better alternatives, several types of bioreactors have been assessed, however, with results still discreet. A littlestudied system, which has showed itself very effective in the use with other types of animal cells, is the hollow fiber bioreactor. This bioreactor has relatively homogeneous culture environment, low level of hydrodynamic stress on cells and the process control is made through manipulation external to the culture. Thus, it is proposed in this work the study of the in vitro expansion of MSCs in 15 mL hollow fiber prototype bioreactor designed and built with a configuration specifically conceived for expansion of MSCs for use in therapeutic applications. The inoculum was prepared with MSCs precultured adhered to microcarrier Cultispher-S at concentration of 4 g/L in spinner flask containing 50 mL of α-MEM culture medium with 15% v/v fetal bovine serum. The preculture was performed in CO2 incubator at pH close to 7.3 and temperature of 37°C. For bioreactor expansion cultures, it was used the same culture medium, with addition of 12 g/L of alginate and 4.25-4.50 mM of CaCl2 as gelling agents to immobilize and keep in suspension the microcarriers, in the conditions of pH and temperature used in the preculture. The oxygenation of the culture medium continuously recirculated through the intracapilar space was carried out by air bubbling in an external flask. The oxygenation levels were of 70 to 90% of saturation with air. The experimental results obtained show that the used configuration of hollow fiber bioreactor promoted good conditions for expansion of MSCs without cell aggregation, reaching 15.3-fold expansion and cell recovery levels of 82%. These results also demonstrate the possibility of improving the efficiency of MSCs expansion through the renewal of medium to maintain suitable levels of arginine, nutrient present in limiting amounts, and ammonium, growth inhibitor metabolite. / A utilização de células estromais mesenquimais (MSCs em inglês) para a terapia clínica tem sido limitada pela baixa quantidade de células que podem ser obtidas diretamente do tecido, tornando necessário o desenvolvimento de técnicas de expansão do número de células in vitro. Os métodos atuais de expansão apresentam necessidade de intensa mão de obra, ambientes desfavoráveis para o crescimento celular, níveis de expansão ainda modestos e baixo rendimento na recuperação destas células. Na procura de melhores alternativas, diversos tipos de biorreatores vêm sendo avaliados, porém, com resultados ainda discretos. Um sistema pouco estudado que tem se mostrado muito eficiente no uso com outros tipos de células animais é o biorreator de fibra oca. Este biorreator apresenta ambiente de cultura relativamente homogêneo, baixo nível de forças hidrodinâmicas sobre as células e o controle do processo é feito através de manipulação externa à cultura. Assim, é proposto neste trabalho o estudo da expansão in vitro de MSCs num protótipo de biorreator de fibra oca de 15 mL projetado e construído com uma configuração especialmente concebida para expansão de MSCs a serem utilizadas em aplicações terapêuticas. O inóculo foi preparado com MSCs précultivadas aderidas ao microcarregador Cultispher-S na concentração de 4 g/L em frasco spinner contendo 50 mL de meio de cultura α-MEM com 15% v/v de soro fetal bovino. O précultivo foi realizado em incubadora de CO2 a pH próximo a 7,3 e temperatura de 37°C. Para os cultivos de expansão no biorreator foi utilizado o mesmo meio de cultura, com adição de 12 g/L de alginato e 4,25-4,50 mM de CaCl2 como agentes geleificantes para imobilizar e manter suspensos os microcarregadores, nas condições de pH e temperatura utilizadas no précultivo. A oxigenação do meio de cultura continuamente recirculado pelo espaço intracapilar foi realizada mediante borbulhamento de ar em um frasco externo. Os níveis de oxigenação foram de 70 a 90% da saturação com ar. Os resultados experimentais obtidos mostram que a configuração utilizada propiciou boas condições para a expansão sem agregação celular das MSCs, chegando-se a fatores de expansão estimados de 15,3 vezes e níveis de recuperação de células de 82%. Esses resultados também evidenciam a possibilidade de melhora da eficiência da expansão das MSCs através da renovação do meio de cultivo para a manutenção de níveis adequados de arginina, nutriente presente em quantidades limitantes, e amônia, metabólito inibidor de crescimento.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6615.pdf: 4694610 bytes, checksum: 288df2441cd04d5e5e4c36da49c66cb9 (MD5) Previous issue date: 2015-03-05 / Financiadora de Estudos e Projetos / Mesenchymal stromal cells (MSCs) are required by the scientific community in the development and enhancement of therapeutic techniques in different fields of medicine. The MSCs are present in small concentrations in tissues, which makes necessary the expansion in vitro for enable studies and therapeutic applicability. These are cells with high sensitivity to environmental conditions of cultivation. So, for increase productivity in vitro is used the technology of bioreactors in the development of processes in order to produce high cell densities in less time, with reduce use of resources and maintaining a safe operation. The new concepts of "disposable bioreactors", as the wave-induced motion bioreactor or Wave bioreactor, with possibility operating in a closed system, controlled and automated, reduced investment cost and operation, less risk of contamination, higher level biosecurity, added to the fact of being a underexplored technology and already approved by the FDA (Food and Drugs Administration) becomes a highly attractive alternative bioprocessing for cultivation of animal cells in large scale. In this context, the present work aims to develop a protocol for cultivation of MSCs in the Wave Bioreactor System 2/10. Experiments were performed to characterize the CEMs's culture behavior in the Wave bioreactor to obtain high cell productivity while maintaining the therapeutic potential of the CEMs. The experiments were carried out with 2 L Cellbag and Cultispher-S microcarrier with 300 ml of α-MEM medium culture supplemented with glucose, glutamine, and arginine and 15% v/v fetal bovine serum at 37 ° C and pH between 6,9-7,4. In the preliminary experiments it was verified that most of the inoculated cells did not adhere to the microcarriers. It was shown that such behavior is due to low relation between adhesion area (AMC = total projected area of the microcarriers) and wet surface area of Cellbag (ASMCellbag), which in the normal condition of operation results an adhesion between 25,7 and 61,7% of the inoculated cells. To solve the problem were performed experiments reducing ACellbag which enabled improvements in cell adhesion by up to 100%. It was also found low performance of the cell expansion phase, presumably linked to operational problems like: microcarriers segregation in certain regions of the bioreactor causing depletion of nutrients, formation of aggregates of MCs colonized with cells and adhesion of MCs to Cellbag. In addition, it was observed that reducing CEM/MC ratio at the start of the culture, the cell expansion factor could be increased to values equal to or greater than 10. These results show that the Wave bioreactor has good potential for expansion of MSCs and that the same can be improved. / As células estromais mesenquimais (CEMs) estão sendo visadas pela comunidade científica no desenvolvimento e aprimoramento de técnicas terapêuticas em diferentes ramos da medicina. As CEMs estão presentes em pequenas concentrações nos tecidos, o que torna necessário a sua expansão in vitro para viabilizar pesquisas e a aplicabilidade terapêutica. Tratam-se de células com elevada sensibilidade em relação às condições do ambiente de cult ivo. Assim, para o aumento da produtividade in vitro utiliza-se a tecnologia de biorreatores no desenvolvimento de processos com objetivo de produzir altas densidades celulares em curto tempo, de forma econômica e respeitando as normas impostas pelos órgãos reguladores. O novo conceito de biorreator descartável, como o do biorreator com movimento induzido em forma de ondas, ou biorreator Wave, apresenta possibilidade de operação em sistema fechado segundo as boas práticas de fabricação (BPF), controlado e automatizado. O custo de investimento e operação reduzido, com menor risco de contaminação, maior nível de biossegurança, somado ao fato de utilizar uma tecnologia pouco explorada e já aprovada pelo FDA (Food and Drugs Administration) se transforma numa alternativa de bioprocessamento altamente atrativa para cultivo de células animais em larga escala. Nesse contexto, o presente trabalho tem por meta avaliar o desempenho do biorreator Wave 2/10 na expansão das CEMs. Para tal, foram realizados experimentos visando caracterizar o comportamento do cultivo nesse biorreator a fim de obter alta produtividade celular mantendo a potencialidade terapêutica das CEMs. Os experimentos foram realizados com saco plástico (doravante Cellbag) de 2 L e microcarregador (MC) Cultispher-S com 300 mL me io de cultivo α-MEM suplementado com glicose, glutamina e arginina e 15% v/v de soro fetal bovino a 37°C e pH entre 6,9-7,4. Nos experimentos preliminares constatou-se que grande parte das células inoculadas não aderiam aos microcarregadores. Comprovou-se que tal comportamento se devia à baixa relação entre área de adesão (AMC = área total projetada dos microcarregadores) e área de superfície molhada da Cellbag (ASMCellbag) que na condição normal de operação resultava numa adesão entre 25,7 e 61,7% das células inoculadas. Para melhorar a adesão foram realizados experimentos reduzindo a ASMCellbag, o que possibilitou melhoria na adesão celular em até 100%. Na etapa de expansão celular verificou-se baixo desempenho, presumivelmente vinculado a problemas de operação como: segregação de microcarregadores em determinadas regiões do biorreator provocando o esgotamento de nutrientes, formação de agregados de MCs colonizados com células e adesão dos MCs à Cellbag. Em adição, notou-se que diminuindo a relação CEM/MC no início do cultivo a expansão celular podia ser aumentada para valores iguais ou maiores que 10. Ao todo, os resultados mostraram que o biorreator Wave possui bom potencial para a expansão de CEMs e que o mesmo ainda pode ser melhorado.

Submitted by DIEGO NOE RODRIGUEZ SANCHEZ null (dnr_51@hotmail.com) on 2016-06-22T16:49:29Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Diego_Final.pdf: 62116504 bytes, checksum: c5a01fb03474d162a65b0ca8041e5d46 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-06-23T19:11:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sanchez_dnr_me_bot.pdf: 62116504 bytes, checksum: c5a01fb03474d162a65b0ca8041e5d46 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-23T19:11:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sanchez_dnr_me_bot.pdf: 62116504 bytes, checksum: c5a01fb03474d162a65b0ca8041e5d46 (MD5) Previous issue date: 2016-05-12 / As lesões de nervos periféricos por neurotmese apresentam resultados paradoxais na recuperação pela ausência na regeneração. Assim, manter o ambiente permissivo de crescimento no coto distal após a lesão é essencial, sendo as células de Schwann chaves neste processo. A terapia celular apresenta potencial para a regeneração nervosa, baseado na substituição celular e promoção do crescimento axonal. As células tronco mesenquimais multipotentes de tecido adiposo (CTMM-TA) são uma fonte promissora pela fácil obtenção, expansão in vitro e por apresentarem propriedades imunomoduladoras e antinflamatórias. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi comparar os efeitos do transplante de CTMM caninas e murinas em combinação com a técnica de tubulação com veia descelularizada, na regerenaração do nervo ciático em modelo experimental de neurotmese em ratos. Ratos Wistar submetidos a neurotmese do nervo ciático foram divididos em 5 grupos: Grupo controle (GC), Grupo denervado (GD), Grupo Transplante de Veia descelularizada (GV), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes caninas (GCTMMc), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes murinas (GCTMMm). Após a marcação com nanocristais fluorescentes e viabilidade celular, 1 x 106 CTMM caninas e murinas foram injetadas depois da realização da lesão experimental por neurotmese com 10mm por tubulação com veia descelularizada nos grupos GCTMMc e GCTMMm, e solução tampão salina de Hank's (HBSS) no grupo veia (GV). Durante o período de 35 dias, o índice de funcionalidade do nervo ciático (IFNC) e a eletroneuromiografia (ENMG) foram realizadas para avaliar a recuperação funcional. Análises histológicas e imunohistoquímicas foram efetuadas para revelar a mielinização, a produção de fatores neurtróficos e a persistencia das CTMM. Observaram-se resultados positivos funcionais nos dias 27 e 35 no grupo tratado com GCTMMm. Os resultados eletrofisiológicos de latência (m/s) e amplitude (mV) no nervo ciático foram superiores nos grupos GCTMMc e GCTMMm. Na avaliação do número e a densidade de fibras nervosas, os grupos GCTMMm e GCTMMc, mostraram melhores resultados. Foi observado uma expressão significativamente alta de BDNF no grupo GCTMMc, associado com o incremento na expressão da proteína S-100 nos grupos GCTMMc e GCTMMm, comparado com o GD. Demonstrou-se, também, que as CTMM derivadas do tecido adiposo canino e murino apresentaram efeitos positivos na regeneração do nervo ciático após neurotmese em ratos. / The peripheral nerves injury by neurotmesis presents confusing results in the recovery by the lack of regeneration. Thus, it is essential to maintain a growth permissive microenvironment in the distal stump following injury for Schwann cells. The cell therapy has therapeutic potential for nerve regenertion, based on cell replacement and promotion of axonal growth. Adipose-derived multipotent mesenchymal stem cells (AdMSC) are a promising source for easy retrieval and expansion in vitro and have immunomodulatory and anti-inflammatory properties. The objective of this study was to compare the effects of canine and murine MSC transplantation in combination with the tubulization of decellularized vein in sciatic nerve regeneration. Wistar rats were divided into 5 groups: control group (CG), denervated group (DG), decellularized vein transplantation group (VG), vein + canine MSC group (cMSC) and vein + murine MSC group (mMSC). After labeling with fluorescent nanocrystals and cell viability, 1 x 106 canine and murine MSC were injected after experimental injury for neurotmesis with 10mm and tubulization with decellularized vein in the cMSC and mMSC groups. During a period of 35 days the sciatic nerve functional index (SFI) and electroneuromyography (EMG) were performed to access functional recovery. Histological analysis and immunohistochemistry were performed to evaluate myelination, neurotrophic factor production and persistence of MSC. It was observed functional postive results at 27th and 35th days in the group treated with mMSC. The electrophysiologycal results of latency (m/s) and amplitude (mV) in the sciatic nerve, they were higher in groups cMSC and mMSC. In assessing the number and density of nerve fibers, mMSC and cMSC groups showed better results. It was observed a significantly higher BDNF expression than the cMSC group, associated with increased xvi expression of S-100 protein in the cMSC and mMSC groups compared to the GD. Also, it has been shown that MSC canine and murine derived of adipose tissue (AdMSC) showed positive effects on the sciatic nerve regeneration in the rat model neurotmesis.

Orientador: Rogerio Martins Amorim / Resumo: As lesões de nervos periféricos por neurotmese apresentam resultados paradoxais na recuperação pela ausência na regeneração. Assim, manter o ambiente permissivo de crescimento no coto distal após a lesão é essencial, sendo as células de Schwann chaves neste processo. A terapia celular apresenta potencial para a regeneração nervosa, baseado na substituição celular e promoção do crescimento axonal. As células tronco mesenquimais multipotentes de tecido adiposo (CTMM-TA) são uma fonte promissora pela fácil obtenção, expansão in vitro e por apresentarem propriedades imunomoduladoras e antinflamatórias. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi comparar os efeitos do transplante de CTMM caninas e murinas em combinação com a técnica de tubulação com veia descelularizada, na regerenaração do nervo ciático em modelo experimental de neurotmese em ratos. Ratos Wistar submetidos a neurotmese do nervo ciático foram divididos em 5 grupos: Grupo controle (GC), Grupo denervado (GD), Grupo Transplante de Veia descelularizada (GV), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes caninas (GCTMMc), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes murinas (GCTMMm). Após a marcação com nanocristais fluorescentes e viabilidade celular, 1 x 106 CTMM caninas e murinas foram injetadas depois da realização da lesão experimental por neurotmese com 10mm por tubulação com veia descelularizada nos grupos GCTMMc e GCTMMm, e solução tampão salina de Hank's (HBSS) no grupo veia (GV). Durante o ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The peripheral nerves injury by neurotmesis presents confusing results in the recovery by the lack of regeneration. Thus, it is essential to maintain a growth permissive microenvironment in the distal stump following injury for Schwann cells. The cell therapy has therapeutic potential for nerve regenertion, based on cell replacement and promotion of axonal growth. Adipose-derived multipotent mesenchymal stem cells (AdMSC) are a promising source for easy retrieval and expansion in vitro and have immunomodulatory and anti-inflammatory properties. The objective of this study was to compare the effects of canine and murine MSC transplantation in combination with the tubulization of decellularized vein in sciatic nerve regeneration. Wistar rats were divided into 5 groups: control group (CG), denervated group (DG), decellularized vein transplantation group (VG), vein + canine MSC group (cMSC) and vein + murine MSC group (mMSC). After labeling with fluorescent nanocrystals and cell viability, 1 x 106 canine and murine MSC were injected after experimental injury for neurotmesis with 10mm and tubulization with decellularized vein in the cMSC and mMSC groups. During a period of 35 days the sciatic nerve functional index (SFI) and electroneuromyography (EMG) were performed to access functional recovery. Histological analysis and immunohistochemistry were performed to evaluate myelination, neurotrophic factor production and persistence of MSC. It was observed functional postive results a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre