Es una guía de prácticas de laboratorio del curso de Biología General (MA155) que corresponde al ciclo 2014-2. Este curso es una asignatura destinada al estudio de la célula, los componentes celulares, la fisiología y su relación con el medio ambiente.

Submitted by Gilvan Almeida (gilvan.almeida@icict.fiocruz.br) on 2016-10-11T17:34:20Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 72038.pdf: 3196059 bytes, checksum: 8c47650717cf5a0ee1266bcc0b5d389d (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-10-24T11:51:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 72038.pdf: 3196059 bytes, checksum: 8c47650717cf5a0ee1266bcc0b5d389d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-24T11:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 72038.pdf: 3196059 bytes, checksum: 8c47650717cf5a0ee1266bcc0b5d389d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A dengue é caracterizada como a principal arbovirose humana, representando um grave problema de saúde pública. A superativação de células do sistema imune pode ser destacada como um dos fatores envolvidos na progressão da doença para as formas mais graves. Embora os monócitos sejam reconhecidos como importante fonte de citocinas, a participação das plaquetas na patogênese da dengue permanece pouco explorada. Recentemente, nosso grupo mostrou a contribuição da interação plaqueta-monócito na resposta inflamatória observada durante a dengue. De fato, o papel das plaquetas na resposta imune e inflamatória é cada vez mais frequente. Dentro deste contexto, foi proposto que plaquetas ativadas por estímulo específico sinalizam para mudanças fenotípicas nos monócitos, incluindo a diferenciação em células espumosas que é caracterizada pelo aumento da biogênese de corpúsculos lipídicos (CL) \2013 organelas citoplasmáticas dinâmicas ricas em lipídios relacionadas a processos inflamatórios e infecciosos. Nossos estudos prévios demonstraram um aumento da biogênese de CL tanto em leucócitos isolados de pacientes com a forma grave da doença quanto em células infectadas com o vírus dengue (DENV) in vitro, com participação na localização da proteína do capsídeo viral e na produção de partículas virais infecciosas. Entretanto, os mecanismos que regulam a biogênese e a função destas organelas durante a infecção pelo DENV precisam ser melhor caracterizados. Assim, pretende-se com este trabalho (i) analisar os mecanismos que levam à biogênese de CL em distintos tipos celulares infectados com o DENV in vitro; (ii) estudar os efeitos de plaquetas ativadas com o DENV in vitro sobre a imunomodulação dos monócitos, no que diz respeito, principalmente, à formação de CL; (iii) investigar o efeito de drogas que atuam na gênese de CL e o seu impacto na replicação viral e na secreção de mediadores inflamatórios Inicialmente, nossos resultados demonstram um aumento na formação e/ou tamanho de CL em distintos tipos celulares infectados in vitro, de uma maneira dependente da integridade viral, visto que o vírus inativado por aquecimento falhou em induzir a biogênese destas organelas. Observamos que a modulação da lipogênese e da formação de CL afetam a capacidade replicativa do vírus. Além disso, constatamos que o DENV é capaz de modular positivamente a expressão de genes envolvidos no metabolismo de lipídios, de forma independente do MIF \2013 citocina que induz a gênese de CL em monócitos \2013 secretado durante a infecção. Na segunda parte deste estudo, observamos que plaquetas ativadas com o DENV in vitro rapidamente formam agregados com monócitos quando comparado com plaquetas estimuladas com mock. Adicionalmente, plaquetas ativadas com o DENV sinalizam para que monócitos aumentem a expressão de COX-2 e a secreção de PGE2 e CXCL8/IL-8. De forma recíproca, observamos que estas células contribuem para uma maior ativação das plaquetas, que então secretam níveis elevados de CCL5/RANTES e CXCL4/PF4. Em seguida, constatamos que plaquetas ativadas com o DENV in vitro são capazes de promover a biogênese de CL em monócitos, de uma maneira dependente da enzima ácido graxo sintase Ao utilizarmos o C75, inibidor desta enzima, também observamos uma redução nos níveis de PGE2, mas não de CXCL-8/IL-8, sugerindo um papel dos CL na produção deste mediador lipídico. O MIF, secretado durante a ativação de plaquetas pelo DENV in vitro, também está envolvido na sinalização que culmina na formação de CL em monócitos expostos a plaquetas ativadas. De forma surpreendente, o sobrenadante de plaquetas ativadas com o DENV não induz a biogênese de CL em monócitos, sugerindo a importância do contato direto entre essas células. De fato, a interação com plaquetas ativadas mostrou-se crucial para que os monócitos respondam funcionalmente, incluindo a secreção de mediadores inflamatórios e o aumento da formação de CL. Por fim, a biogênese destas organelas é maior nos agregados formados com plaquetas ativadas com o DENV, corroborando esta hipótese. Sendo assim, esses dados fortemente sugerem que a interação direta com plaquetas ativadas com o DENV seja crucial para que os monócitos respondam com funções específicas e contribuam para a patogênese da doença. Portanto, o conjunto dos resultados obtidos nos revela a importância em estabelecer estratégias terapêuticas adequadas para controlar a resposta do hospedeiro frente à infecção, onde a própria modulação dos CL possa vir a representar um potencial alvo terapêutico para o tratamento da dengue / Dengue is characterized as the most important arthropod-borne human viral disease worldwide, representing a public health problem. Increased activation of immune cells could be involved in the progression of disease to severe forms. Although monocytes have been recognized as important sources of cytokines, the role of platelets in dengue pathogenesis remains understood. Recently our group showed the contribution of platelet-monocyte interaction to inflammatory responses observed in dengue. In fact, it is becoming increasingly clear that platelets have inflammatory functions and can influence innate response. Evidences suggest that specific stimuli-activated platelets can promote phenotypic changes in monocytes, including enhanced foam cell formation, that is characterized by an increase in lipid droplets (LD) \2013 dynamic cytoplasmic lipid-rich organelles, associated to inflammatory and infectious conditions \2013 biogenesis. Our previous works showed a significant increase in LD accumulation in leukocytes from dengue hemorrhagic fever patients, as well as in different cell types infected in vitro. Besides, these organelles were involved in capsid protein localization and virus particle morphogenesis. However, the mechanisms involved in LD biogenesis and function during dengue virus (DENV) infection still unclear. Therefore, this study aim to (i) investigate the mechanisms related to LD formation in distinct cell types during DENV infection; (ii) evaluate the roles of DENV-activated platelets on monocytes immunomodulation in vitro, focusing on LD biogenesis; (iii) analyze the effects of drugs that abrogate LD formation and your impact on viral replication and secretion of inflammatory mediators Our results demonstrate a significant increase in LD number and/or area in distinct cell types infected in vitro. Importantly, heat inactivated DENV failed to induce LD biogenesis in vitro. Besides, modulation of lipogenesis and LD formation, by C75- or triacsin C-treated cells, impair DENV replication. We also observe that DENV is able to modulate genes involved in lipid metabolism, in a MIF \2013 cytokine that induces LD genesis in monocytes \2013 independent fashion. In the second part of this study, we show that platelets exposed to DENV in vitro form aggregates with monocytes and activate signaling cascade in these cells, which culminates in CXCL8/IL-8 secretion. In addition, platelet-monocyte aggregates formation reciprocally increase platelet activation, observed by an enhanced production of CCL5/RANTES and CXCL4/PF4. DENV-activated platelets increase LD formation and COX-2 activation in monocytes, leading to secretion of PGE2. Damping LD biogenesis through treatment with the fatty acid synthase (FAS) inhibitor C75 prevents PGE2, but not CXCL8/IL-8, secretion by platelet-monocyte aggregates. We also demonstrate that DENV-activated platelets secrete high levels of MIF. LD formation in monocytes exposed to DENV-activated platelets is partially dependent on platelet-derived MIF However, the supernatant from DENV-activated platelets is not sufficient to induce LD biogenesis in monocytes. Finally, LD formation is higher in monocytes which have platelets adhered on surface compared to monocytes that do not contact platelets, suggesting that beyond soluble mediators, platelet adhesion is a major event in platelet-mediated modulation of lipid metabolism in monocytes. Thus, our results indicate that DENV infection promotes LD biogenesis and that this event seems to be dependent of host lipid metabolism, since specific inhibition of enzymes involved in lipogenesis blocks the formation of these organelles. This inhibition also leads to decreased DENV replication, suggesting a role of LD in this process. Moreover, our data provide new evidence that DENV-activated platelets modulate LD formation as well as cytokine signaling in monocytes, during cellular aggregates formation, and these events may contribute to dengue pathogenesis. Therefore, the modulation of LD formation might represent an attractive therapeutic target for dengue

Orientador: Vitor Fernandes Oliveira de Miranda / Resumo: Utricularia e Genlisea são gêneros irmãos de plantas carnívoras da família Lentibulariaceae. Possuem aproximadamente 260 espécies representadas em diversas formas de vida. Para o Brasil foram catalogadas 82 espécies, das quais 27 são consideradas endêmicas. Além de dispor das armadilhas carnívoras mais complexas entre plantas, algumas de suas espécies apresentam os menores genomas e as maiores taxas de mutações entre as angiospermas relatadas até o momento. A respeito de seus genomas organelares, os estudos são pífios. Neste contexto, há a necessidade de se investigar como são os genomas organelares, suas estruturas, seus genes e como se deu a evolução das organelas nos gêneros. Portanto este estudo teve como objetivo, a partir de sequenciamento de nova geração e montagem de genomas, estudar e comparar os genomas organelares de Utricularia e Genlisea. Neste âmbito, foram montados e sequenciados os cloroplastos das espécies Utricularia foliosa, U. reniformis, G. aurea, G. filiformis, G. pygmaea, G. repens e G. tuberosa, e o genoma mitocondrial de U. reniformis. Os resultados obtidos revelaram que possivelmente há relação entre forma de vida e presença de genes ndhs nos gêneros, em razão de que para as espécies terrestres há deleção e “pseudogenização” de genes ndhs, já as espécies aquáticas detêm todo repertório de ndhs intacto. A partir das evidências encontradas, foi possível constatar transferência horizontal de genes, inclusive de genes ndhs, em mitocôndrias. / Abstract: Utricularia and Genlisea are sister genera in the carnivorous family Lentibulariaceae. There are aprproximately 260 species representing diverse life forms. For Brasil there are 82 species, 27 considered endemic. At the moment, besides having the most complex carnivorous traps between all plants, some of its species have miniature genomes and the highest mutational rates among angiosperms. There are few studies regarding its organellar genome. In this context, it is necessary to investigate how are these organellar genomes, its structure, genes, and how evolutionary forces govern these organelles in the different genera. Therefore, the aim of this study is to study and compare the organellar genomes of Utricularia and Genlisea, using next generation sequencing and genome assembly. In this context, chloroplasts of the species Utricularia foliosa, U. reniformis, Genlisea aurea, G. filiformis, G. pygmaea, G. repens and G. tuberosa, and the mitochondrial genome of U. reniformis were assembled and sequenced. The results show that possibly there is a connection between life form and the presence of ndhs genes in the genera, since for the terrestrial species there are ndhs genes that are deleted and pseudogenization, in contrary to the aquatic species which have all intact ndhs repertoir. Concerning the evidences, it was possible to verify horizontal transfer of ndhs and other genes as there are chloroplasts genes in the mitochondria. / Doutor

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-11-29T23:10:02Z No. of bitstreams: 1 giselle_b_lima_ioc_bcm_0040_2011.pdf: 7861380 bytes, checksum: c1b5adc38492ad939e7501fe4217d53a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-29T23:10:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 giselle_b_lima_ioc_bcm_0040_2011.pdf: 7861380 bytes, checksum: c1b5adc38492ad939e7501fe4217d53a (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A dengue, em termos de morbidade e mortalidade, é caracterizada como a principal arbovirose humana, sendo responsável pela infecção de milhares de pessoas nas regiões tropical e subtropical do mundo, causando a morte de adultos e crianças. Uma das razões para a ausência de abordagens terapêuticas adequadas se deve ao pouco conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na interação do vírus dengue com as células hospedeiras. No entanto, evidências sugerem que a regulação de diferentes etapas do metabolismo celular desempenhe funções cruciais tanto na replicação viral quanto na resposta do hospedeiro à infecção. Estudos têm demonstrado que o acúmulo intracelular de lipídios em corpúsculos lipídicos – organelas citoplasmáticas dinâmicas e funcionalmente ativas – está associado a doenças de grande relevância para a saúde pública, incluindo a hepatite C. Além disso, foi observado que estas organelas desempenham funções não apenas na replicação do vírus da hepatite C, mas também na produção de partículas infecciosas; entretanto, o envolvimento dos corpúsculos lipídicos durante a infecção pelo vírus dengue ainda não foi avaliado. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a formação e função dos corpúsculos lipídicos durante a infecção pelo vírus dengue, com foco na interação com proteínas virais, na modulação da capacidade replicativa e/ou infecciosa do vírus e na geração aumentada de mediadores inflamatórios. Nossos resultados demonstraram um aumento no número de corpúsculos lipídicos em leucócitos isolados de pacientes com a forma grave da doença, bem como indução da biogênese destas organelas em diferentes tipos celulares infectados com distintos sorotipos do vírus dengue in vitro. A exposição de células ao vírus dengue inativado por aquecimento não promoveu a formação de corpúsculos lipídicos. Em paralelo à indução da formação destas organelas, em células infectadas in vitro, observamos um aumento na produção de PGE2. Adicionalmente, demonstramos que a proteína do capsídeo viral, bem como o MIF – mediador proinflamatório cuja concentração está diretamente correlacionada com a gravidade da doença – se encontravam colocalizados nos corpúsculos lipídicos durante a infecção. Por fim, observamos que a modulação da lipogênese e da formação de corpúsculos lipídicos, através do tratamento das células com as drogas C75 e triacsin C, afetaram a capacidade replicativa do vírus. Desta forma, os nossos resultados indicam que a infecção pelo vírus dengue promove a biogênese de corpúsculos lipídicos de uma maneira dependente das enzimas ácido graxo sintase e acil-CoA sintetase, uma vez que a inibição destas por drogas específicas leva ao bloqueio da formação destas organelas. Esta inibição também promove uma redução na replicação viral, propondo um papel dos corpúsculos lipídicos neste processo. Além disso, o aumento na geração de PGE2 induzido pelo vírus, bem como a localização do MIF e da proteína do capsídeo viral nestas organelas sugerem que os corpúsculos lipídicos atuem na produção aumentada de mediadores inflamatórios e na regulação temporária do processo viral. Assim, a modulação dos corpúsculos lipídicos pode vir a representar um potencial alvo terapêutico para o tratamento da dengue. / Dengue, in terms of disease and mortality, is characterized as the most important arthropod-borne human viral disease, infecting millions of people in tropical and subtropical regions of the world and being responsible for many deaths in children and adults. The lack of adequate therapeutic approaches for treatment of dengue is a consequence of our limited understanding about the molecular mechanisms that underlie the interaction between dengue virus and human host. However, evidence suggests that the regulation of different steps of cellular metabolism play crucial roles in both viral replication and the host response to infection. Recent studies have shown that intracellular accumulation of lipids within lipid droplets – dynamic and functionally active organelles – is associated with diseases of major relevance to public health, including hepatitis C. Furthermore, it was observed that these organelles play roles not only in hepatitis C virus replication, but also in the production of infectious particles; however the involvement of lipid droplets in dengue virus infection has never been addressed. Therefore, this work aimed to investigate lipid droplets formation and function during dengue virus infection, focusing on interaction with viral proteins, modulation of replication and/or production of infectious virus and increased generation of inflammatory mediators. Our results demonstrated a significant increase in lipid droplets accumulation in leukocytes from dengue hemorrhagic fever patients, as well as induction of biogenesis in different cell types infected with distinct serotypes of dengue virus in vitro. Importantly, heat inactivated dengue virus failed to induce lipid droplets formation in cells infected in vitro. In paralleled to an increased lipid droplets biogenesis, in cells infected in vitro, we observed an increase in PGE2 generation. Additionally, we also demonstrated that the virus core protein and MIF – proinflammatory mediator whose concentration is directly related to disease severity – co-localizes in lipid droplets during infection. Finally, we observed that modulation of lipogenesis and lipid droplets formation, by treatment of the cells with C75 and triacsin C, impaired dengue virus replication. Thus, our results indicate that dengue virus infection promotes lipid droplets biogenesis and that this event seems to be dependent of the enzymes fatty acid synthase and acyl-CoA synthetase, since specific inhibition of these enzymes blocks the formation of these organelles. This inhibition also leads to decreased viral replication, suggesting a role of lipid droplets in this process. Moreover, the increased production of PGE2 induced by dengue virus, as well as MIF and virus core protein localization in these organelles propose that lipid droplets are involved in both increased generation of inflammatory mediators as temporary regulation of viral process. So, the modulation of lipid droplets might represent an attractive therapeutic target for dengue.

Made available in DSpace on 2016-05-16T12:55:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 natalia_roque_ioc_mest_2011.pdf: 2207785 bytes, checksum: 5965085ee04bb1de36ccb11445b61038 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A formação de corpúsculos lipídicos é um evento que tem sido recentemente descrito durante a tuberculose tanto em condições clinicas quanto experimentais. O aumento no número dessas organelas é um fenômeno bem regulado que parece ter uma importante implicação na patogênese microbiana. Contudo, os mecanismos pelos quais as micobactérias desencadeiam a formação dos corpúsculos lipídicos bem como o seu papel na infecção ainda não estão totalmente compreendidos. Investigamos nesse trabalho os primeiros eventos da defesa do hospedeiro em resposta a infecção por BCG, bem como a formação de corpúsculos lipídicos, os receptores envolvidos na sua biogênese e o seu papel na modulação via endocítica. Durante a infecção experimental por BCG ocorreu uma intensa migração de neutrófilos nas 6 h iniciais. Em 24 h, um grande número de neutrófilos infectados (92%) apresentavam características de morte celular por apoptose. Nos experimentos in vitro, tanto os neutrófilos apoptóticos quanto a infecção com BCG sozinho foram capazes de induzir a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos. Contudo, a resposta foi amplificada no grupo contendo tanto os neutrófilos apoptóticos quanto o BCG. Ainda, o pré-tratamento in vivo com um inibidor de pan-caspase, o zVAD, inibiu a apoptose de neutrófilos, sem modificar o recrutamento destas células nos camundongos C57Bl/6 infectados com BCG. Sob esta condição, a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos foi significativamente inibida nos animais infectados, indicando o papel da célula apoptótica na formação dos corpúsculos lipídicos durante a infecção Além disso, foi observado o envolvimento dos receptores CD14 e CD36 na biogênese dos corpúsculos lipídicos induzidos por BCG in vitro e in vivo respectivamente. A parede celular das micobactérias tem sido apresentada como importante componente na interação patógeno-hospedeiro. Dessa forma, analisamos o papel de componentes da parede micobacteriana na indução de corpúsculos lipídicos. Foi observado que o LAM, TDM e TMM além do BCG, foram capazes de induzir a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos após 24 h de estimulação in vitro. Porém, a micobactéria não patogênica M. smegmatis e partículas de látex não revestidas não foram capazes de induzir um aumento no número de corpúsculos lipídicos. A análise por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou a associação dos corpúsculos lipídicos com os fagossomas além da imagem sugestiva de um corpúsculo lipídico internalizado por um fagossoma infectado durante a infecção experimental por BCG in vivo Por imunofluorescência, foi observado que a interação dos corpúsculos lipídicos com os fagossomas não é dependente da viabilidade bacteriana. Partículas de látex revestidas com os componentes da parede micobacteriana LAM ou PIM apresentaram-se próximas dos corpúsculos lipídicos em diferentes tempos em experimentos in vitro. Após 24 h de infecção por BCG in vivo foi observada a presença da proteína da via endocítica Rab7 e do seu efetor a RILP, mas não da Rab5, co-localizada com os corpúsculos lipídicos, sugerindo que os corpúsculos lipídicos possam estar seqüestrando a Rab7, necessária para a maturação fagossomal. Nossos resultados mostraram diferentes mecanismos envolvidos na biogênese dos corpúsculos lipídicos induzidos por BCG sugerindo que a modulação dessas organelas pelo patógeno pode representar um importante mecanismo de escape da resposta imune do hospedeiro e um futuro alvo terapêutico / Lipid body formation is an event that has been recently described during tuberculosis in both clinical and experimental conditions. The increase of these organelles is a well regulated phenomenon that seems to have an implication in microbial pathogenesis. However, the mechanisms by which the microbial trigger the lipid bodies formation as well as its role in the infection are still not fully understood. We investigated in this work the first events of the host defense in the BCG infection response, as well as the lipid bodies formation, the receptors involved in their biogenesis, and their role in endocytic pathway modulation. During the experimental infection by BCG a great neutrophils influx happened in the initial 6 h. In 24h, a great number of infected neutrophils (92%) showed apoptotic cell death features. In in vitro experiments, both apoptotic neutrophils and BCG infection alone were able to induce lipid bodies formation in macrophages. However, the response was amplified in the group containing both apoptotic neutrophils and BCG. Still, the pre treatment in vivo with pan-caspase inhibitor, zVAD, inhibited the neutrophils apoptosis, without modifying the influx of these cells in the BCG infected C57Bl/6 mice. Under this condition, the lipid body formation in macrophages was drastically inhibited in infected animals, indicating the role apoptotic cells in the lipid body biogenesis during the infection. Beyond that, was observed the involvement of CD14 and CD36 receptors in the lipid bodies biogenesis induced by BCG in vitro and in vivo, respectively. The mycobacteria cell wall has been presented as an important component of host-pathogen interaction. In this way, we analyzed the role of mycobacteria cell wall component in the lipid bodies induction. It was observed that LAM, TDM, and TMM, beside BCG, were able to induce the lipid bodies formation in macrophages after 24h of in vitro stimuli. However, the non-pathogenic mycobacteria M. smegmatis and non coated latex beads were not able to induce an increase in the numbers of lipid bodies. Transmission electronic microscopic analyze showed an interaction between the lipid bodies and phagosomes, beside a suggestive image of an infected phagosome with an internalized lipid body during the experimental BCG infection in vivo. By imunofluorescence, it was observed that the interaction between the lipid bodies and phagosomes is not dependent of bacterial viability. Latex beads coated with mycobacterial cell wall components LAM or PIM presented themselves close of the lipid bodies in different times in in vitro experiments. After 24h of in vivo BCG infection, was observed the presence of Rab7 endocytic pathway protein and its effector RILP, but not the Rab5, co-localized with the lipid bodies, suggesting that the lipid bodies could be highjacking the Rab7, needed for the phagosome maturation. Our results showed different mechanisms involved in the lipid bodies biogenesis induced by BCG, suggesting that modulation of these organelles by the pathogen could represent an important escape mechanism of the host immune response and a future therapeutic target.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-11-30T11:59:08Z No. of bitstreams: 1 fabio_p_m_santos_ioc_bcm_0037_2011.pdf: 10305796 bytes, checksum: 74de5b830c8354cd532f74bd40993c6a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-30T11:59:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fabio_p_m_santos_ioc_bcm_0037_2011.pdf: 10305796 bytes, checksum: 74de5b830c8354cd532f74bd40993c6a (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Durante a resposta alérgica, dentre os vários mediadores inflamatórios de natureza lipídica, a prostaglandina D2 (PGD2) é considerada um mediador-chave. Em adição aos seus conhecidos efeitos quimiotáticos para eosinófilos, recentemente, foi descrito que a PGD2 é também capaz de promover a ativação dos eosinófilos, induzindo a biogênese de corpúsculos lipídicos e a síntese de leucotrieno C4 (LTC4) nessas organelas recém-formadas. Esses efeitos são atribuídos a ação da PGD2 sobre seus 2 receptores – DP1 e DP2 – os quais encontram-se expressos de maneira constitutiva na membrana dos eosinófilos. Então, o objetivo principal do estudo foi identificar o receptor específico da PGD2 envolvido no mecanismo de síntese de LTC4 por eosinófilos estimulados com PGD2. In vivo, num modelo murino de pleurisia alérgica e induzida por PGD2, a utilização dos antagonistas seletivos do receptor DP1 (BW A868c) ou do receptor DP2 (CAY10471) inibiu a síntese de LTC4 nessas respostas inflamatórias. No entanto, somente BWA868C foi capaz de inibir a biogênese de corpúsculos lipídicos nos eosinófilos recrutados para o sítio inflamatório; enquanto que o tratamento com o CAY10471, diminuiu o número de eosinófilos infiltrantes na cavidade pleural, mas não inibiu a biogênese de corpúsculos lipídicos nessas poucas células recrutadas. In vitro, eosinófilos humanos purificados estimulados com PGD2 tiveram a síntese de LTC4 inibida tanto pelo pré-tratamento com BWA868c, quanto pelo prétratamento com CAY10471. Além disso, a ativação do receptor DP1, com seu agonista seletivo (BW245c) e a ativação do receptor DP2 com o agonista seletivo do receptor DP2 (DK-PGD2) corroborou a observação de que no processo de síntese de LTC4 nos eosinófilos, ambos os receptores são necessáior, pois somente quando ambos os receptores foram ativados simultaneamente foi observada síntese de LTC4 nos corpúsculos lipídicos recém-formados (Eicosacell). Além disso, caracterizamos que uma das vias de sinalização intracelular envolvida na formação de corpúsculos lipídicos é depende da ativação de proteína quinase A (PKA). Em um outro grupo de ensaios, investigamos a PGD2 como potencial alvo terapêutico em doenças alérgicas. Recentemente, foi descrito que o extrato aquoso de C. sympodialis e a warafteína (alcalóide isolado) têm propriedades antialérgicas, visto que não somente reduzem a eosinofilia, mas também, a biogênese de corpúsculos lipídicos, assim como a produção de leucotrienos cisteinados. Dessa forma, aqui demonstramos que os pré-tratamentos tanto com o extrato quanto com o alcalóide isolado, foram capazes de inibir a produção de PGD2 ocorrida durante a resposta alérgica. In vitro, embora a warafteína não tenha inibido a biogênese de corpúsculos lipídicos em eosinófilos induzida por PGD2, observamos que é capaz de bloquear a liberação de PGD2 por mastócitos ativados – mas, não a produção de PGE2 por macrófagos ativados com A23187 – demonstrando que o mecanismo de ação dos seus efeitos antiinflamatórios não parecem envolver antagonismo de receptores em eosinófilos, e sim inibição da síntese da PGD2 em sítios alérgicos. / During allergic response, among several lipid mediators produced, prostaglandin D2 (PGD2) has emerged as key mediator. In addition to its known eosinophilotatics effects, recently PGD2 was described to be able to promote eosinophil activation, inducing lipid bodies biogenesis and LTC4 synthesis within these newly formed organelles. These effects are attributed to the action of PGD2 on its 2 receptors – DP1 e DP2 – which are expressed constituvely on eosinophil cell membranes. So, the main objective of this study was to identify the PGD2 specific receptor involved in LTC4 synthesis mechanism by stimulated eosinophils with PGD2. In vivo, in a murine allergic model of pleurisy and in a pleurisy induced by PGD2, the use of selective DP1 receptor (BWA868c) and DP2 receptor (CAY10471) antagonists showed us that both treatments inhibited LTC4 synthesis during these inflammatory responses. However, only BWA868C treatment was able to inhibit lipid bodies biogenesis within recruited eosinophils to the inflammatory sites, while CAY10471, decreased the number of infiltrated eosinophils in the pleural cavity, but did not inhibit lipid bodies biogenesis within these low number of recruited cells. In vitro, pre-treatment with BWA868c or CAY10471 inhibited LTC4 synthesis by human eosinophils stimulated with PGD2. Moreover, the activation of DP1 receptor with its selective agonist (BW245c) and DP2 activation with DP2 selective agonist (DK-PGD2) reinforced the observation that during LTC4 synthesis within eosinophils, activation of both receptors are necessary, because only simultaneous activation of DP1 and DP2, induced LTC4 synthesis within eosinophilic lipid bodies (Eicosacell). Moreover, we observed that the pathway of cellular signaling involved on lipid bodies biogenesis induced by DP1 activation is dependent on protein kinase A (PKA). In another set of experiments, we investigated PGD2 as a therapeutical target of allergic diseases. Recently, it was described that aqueous extract of C.sympodialis and warafteine (isolated alkaloid) have antiallergic properties, because of its effects on the reduction of eosinophils recruitment, lipid bodies biogenesis and cysteinyl leukotrienes synthesis. Here, we demonstrated that pre-treatments with extract and its alkaloid were able to inhibit PGD2 production during allergic response. In vitro, warafteine did not inhibit eosinophil lipid bodies biogenesis induced by PGD2, but it was capable to inhibit PGD2 release by activated mast cells – otherwise fail to blockade PGE2 production by A23187- activated macrophages – suggesting that the action mechanism of its antiinflammatory effects could occur through PGD2 synthesis inhibition in allergic sites.

As células-tronco mesenquimais humanas derivadas de tecido adiposo, do inglês human adipose-derived stem cells (hADSC), são células progenitoras que residem entre adipócitos e armazenam lipídios neutros, principalmente triglicerídeos e ésteres de colesterol (TG e EC), em gotas lipídicas citoplasmáticas (GLC), contribuindo para o turnover do tecido adiposo. As GLC são organelas que desempenham um papel crucial na homeostasia energética e no metabolismo dessas células. Caveolas são invaginações de 50-100 nm que foram inicialmente caracterizadas por microscopia eletrônica. A forma e a organização estrutural das caveolas deve-se a proteínas especificas da família das caveolinas (caveolina-1, -2 e -3) que se associam em oligômeros para formar cavidades/invaginações na membrana plasmática. A função das caveolinas na formação das GLC está relacionada com a captação de ácidos graxos e seu metabolismo, e a relação existente entre estes dois componentes celulares parece ser crucial para manutenção da homeostasia celular. Muitas organelas que são funcionalmente conectadas ao metabolismo de lipídeos são encontradas justapostas as GLC. Distinções morfológicas observadas reforçam diferenças que podem existir na maneira pelas quais as GLC interagem com outras organelas em adipócitos. Sítios de contatos entre membranas, do inglês membrane contact sites (MCS), são descritos para muitas organelas e parecem funcionalmente importantes nos processos de interações entre as GLC e outras organelas celulares. O presente trabalho avaliou as diferenças ultraestruturais entre hADSC diferenciadas ou não para pré-adipócitos, comparando com células 3T3-L1. Também foram avaliadas, através de microscopia eletrônica de transmissão, as interações das GLC com outras organelas celulares durante a diferenciação adipogênica, pois apesar de sua importância no metabolismo energético e em várias doenças, as GLC são pouco compreendidas como organelas celulares. De fato, o tamanho, a composição e a regulação das GLC variam consideravelmente entre organismos e tipos celulares. A complexidade das interações das GLC com outras organelas também varia consideravelmente em adipócitos e não adipócitos. Este trabalho mostrou a importância de estudos que visam esclarecer como as GLC são formadas, modificadas e reguladas. Através destes estudos poderemos ter uma melhor compreensão acerca da relação existente entre o acúmulo excessivo de lipídios no organismo e a chamada síndrome metabólica (obesidade, diabetes e aterosclerose). / Human adipose-derived stem cells (hADSC) are progenitor cells that reside between adipocytes, store neutral lipids, especially triglycerides and cholesterol esters (TG and CE) into cytoplasmic lipid droplets (CLD), contributing to the turnover of the adipose tissue. The CLD are organelles that play a crucial role in energy homeostasis and cell metabolism. Caveolae are invaginations of 50-100 nm that were initially characterized by transmission electron microscopy. The shape and structural organization of caveolae are held by specific proteins of the family of caveolinas (caveolin-1, -2 and -3) that associate to form oligomers in cavities/invaginations on the plasma membrane. The caveolin functions on the CLD development are related to the fatty acid uptake and its metabolism. The relationship between these cell components seems to be pivotal for the cellular homeostasis maintenance. Many organelles that are functionally connected to lipid metabolism are found juxtaposed to the CLD. Morphologic distinctions reveal the differences that may exist in the way through which the CLD interact with other organelles within adipocytes. The membrane contact sites (MCS) have been described for many organelles and seems to be functionally important in the interaction processes with CLD. This work evaluated the ultrastructural differences between hASDC differentiated or not to pre-adipocyte compared to the 3T3-L1 cells. It was also evaluated through transmission electron microscopy, the CLD interactions to the others cellular organelles in hASDC during adipogenesis induction because, despite its importance in energy metabolism and in various diseases, the CLD are poorly understood as cell organelles. Indeed, the size, composition and regulation of GLC vary considerably between organisms and cell types. The complexity of CLD interactions with other organelles also ranged considerably between adipocytes and undifferentiated. This work showed the importance of studies that aim the clarify how the CLD are formed, modified and regulated. Through these studies it is possible to get a better understanding of the relationship between the excessive accumulation of body lipids and the metabolic syndrome (obesity, diabetes and atherosclerosis).

As células-tronco mesenquimais humanas derivadas de tecido adiposo, do inglês human adipose-derived stem cells (hADSC), são células progenitoras que residem entre adipócitos e armazenam lipídios neutros, principalmente triglicerídeos e ésteres de colesterol (TG e EC), em gotas lipídicas citoplasmáticas (GLC), contribuindo para o turnover do tecido adiposo. As GLC são organelas que desempenham um papel crucial na homeostasia energética e no metabolismo dessas células. Caveolas são invaginações de 50-100 nm que foram inicialmente caracterizadas por microscopia eletrônica. A forma e a organização estrutural das caveolas deve-se a proteínas especificas da família das caveolinas (caveolina-1, -2 e -3) que se associam em oligômeros para formar cavidades/invaginações na membrana plasmática. A função das caveolinas na formação das GLC está relacionada com a captação de ácidos graxos e seu metabolismo, e a relação existente entre estes dois componentes celulares parece ser crucial para manutenção da homeostasia celular. Muitas organelas que são funcionalmente conectadas ao metabolismo de lipídeos são encontradas justapostas as GLC. Distinções morfológicas observadas reforçam diferenças que podem existir na maneira pelas quais as GLC interagem com outras organelas em adipócitos. Sítios de contatos entre membranas, do inglês membrane contact sites (MCS), são descritos para muitas organelas e parecem funcionalmente importantes nos processos de interações entre as GLC e outras organelas celulares. O presente trabalho avaliou as diferenças ultraestruturais entre hADSC diferenciadas ou não para pré-adipócitos, comparando com células 3T3-L1. Também foram avaliadas, através de microscopia eletrônica de transmissão, as interações das GLC com outras organelas celulares durante a diferenciação adipogênica, pois apesar de sua importância no metabolismo energético e em várias doenças, as GLC são pouco compreendidas como organelas celulares. De fato, o tamanho, a composição e a regulação das GLC variam consideravelmente entre organismos e tipos celulares. A complexidade das interações das GLC com outras organelas também varia consideravelmente em adipócitos e não adipócitos. Este trabalho mostrou a importância de estudos que visam esclarecer como as GLC são formadas, modificadas e reguladas. Através destes estudos poderemos ter uma melhor compreensão acerca da relação existente entre o acúmulo excessivo de lipídios no organismo e a chamada síndrome metabólica (obesidade, diabetes e aterosclerose). / Human adipose-derived stem cells (hADSC) are progenitor cells that reside between adipocytes, store neutral lipids, especially triglycerides and cholesterol esters (TG and CE) into cytoplasmic lipid droplets (CLD), contributing to the turnover of the adipose tissue. The CLD are organelles that play a crucial role in energy homeostasis and cell metabolism. Caveolae are invaginations of 50-100 nm that were initially characterized by transmission electron microscopy. The shape and structural organization of caveolae are held by specific proteins of the family of caveolinas (caveolin-1, -2 and -3) that associate to form oligomers in cavities/invaginations on the plasma membrane. The caveolin functions on the CLD development are related to the fatty acid uptake and its metabolism. The relationship between these cell components seems to be pivotal for the cellular homeostasis maintenance. Many organelles that are functionally connected to lipid metabolism are found juxtaposed to the CLD. Morphologic distinctions reveal the differences that may exist in the way through which the CLD interact with other organelles within adipocytes. The membrane contact sites (MCS) have been described for many organelles and seems to be functionally important in the interaction processes with CLD. This work evaluated the ultrastructural differences between hASDC differentiated or not to pre-adipocyte compared to the 3T3-L1 cells. It was also evaluated through transmission electron microscopy, the CLD interactions to the others cellular organelles in hASDC during adipogenesis induction because, despite its importance in energy metabolism and in various diseases, the CLD are poorly understood as cell organelles. Indeed, the size, composition and regulation of GLC vary considerably between organisms and cell types. The complexity of CLD interactions with other organelles also ranged considerably between adipocytes and undifferentiated. This work showed the importance of studies that aim the clarify how the CLD are formed, modified and regulated. Through these studies it is possible to get a better understanding of the relationship between the excessive accumulation of body lipids and the metabolic syndrome (obesity, diabetes and atherosclerosis).

As células-tronco mesenquimais humanas derivadas de tecido adiposo, do inglês human adipose-derived stem cells (hADSC), são células progenitoras que residem entre adipócitos e armazenam lipídios neutros, principalmente triglicerídeos e ésteres de colesterol (TG e EC), em gotas lipídicas citoplasmáticas (GLC), contribuindo para o turnover do tecido adiposo. As GLC são organelas que desempenham um papel crucial na homeostasia energética e no metabolismo dessas células. Caveolas são invaginações de 50-100 nm que foram inicialmente caracterizadas por microscopia eletrônica. A forma e a organização estrutural das caveolas deve-se a proteínas especificas da família das caveolinas (caveolina-1, -2 e -3) que se associam em oligômeros para formar cavidades/invaginações na membrana plasmática. A função das caveolinas na formação das GLC está relacionada com a captação de ácidos graxos e seu metabolismo, e a relação existente entre estes dois componentes celulares parece ser crucial para manutenção da homeostasia celular. Muitas organelas que são funcionalmente conectadas ao metabolismo de lipídeos são encontradas justapostas as GLC. Distinções morfológicas observadas reforçam diferenças que podem existir na maneira pelas quais as GLC interagem com outras organelas em adipócitos. Sítios de contatos entre membranas, do inglês membrane contact sites (MCS), são descritos para muitas organelas e parecem funcionalmente importantes nos processos de interações entre as GLC e outras organelas celulares. O presente trabalho avaliou as diferenças ultraestruturais entre hADSC diferenciadas ou não para pré-adipócitos, comparando com células 3T3-L1. Também foram avaliadas, através de microscopia eletrônica de transmissão, as interações das GLC com outras organelas celulares durante a diferenciação adipogênica, pois apesar de sua importância no metabolismo energético e em várias doenças, as GLC são pouco compreendidas como organelas celulares. De fato, o tamanho, a composição e a regulação das GLC variam consideravelmente entre organismos e tipos celulares. A complexidade das interações das GLC com outras organelas também varia consideravelmente em adipócitos e não adipócitos. Este trabalho mostrou a importância de estudos que visam esclarecer como as GLC são formadas, modificadas e reguladas. Através destes estudos poderemos ter uma melhor compreensão acerca da relação existente entre o acúmulo excessivo de lipídios no organismo e a chamada síndrome metabólica (obesidade, diabetes e aterosclerose). / Human adipose-derived stem cells (hADSC) are progenitor cells that reside between adipocytes, store neutral lipids, especially triglycerides and cholesterol esters (TG and CE) into cytoplasmic lipid droplets (CLD), contributing to the turnover of the adipose tissue. The CLD are organelles that play a crucial role in energy homeostasis and cell metabolism. Caveolae are invaginations of 50-100 nm that were initially characterized by transmission electron microscopy. The shape and structural organization of caveolae are held by specific proteins of the family of caveolinas (caveolin-1, -2 and -3) that associate to form oligomers in cavities/invaginations on the plasma membrane. The caveolin functions on the CLD development are related to the fatty acid uptake and its metabolism. The relationship between these cell components seems to be pivotal for the cellular homeostasis maintenance. Many organelles that are functionally connected to lipid metabolism are found juxtaposed to the CLD. Morphologic distinctions reveal the differences that may exist in the way through which the CLD interact with other organelles within adipocytes. The membrane contact sites (MCS) have been described for many organelles and seems to be functionally important in the interaction processes with CLD. This work evaluated the ultrastructural differences between hASDC differentiated or not to pre-adipocyte compared to the 3T3-L1 cells. It was also evaluated through transmission electron microscopy, the CLD interactions to the others cellular organelles in hASDC during adipogenesis induction because, despite its importance in energy metabolism and in various diseases, the CLD are poorly understood as cell organelles. Indeed, the size, composition and regulation of GLC vary considerably between organisms and cell types. The complexity of CLD interactions with other organelles also ranged considerably between adipocytes and undifferentiated. This work showed the importance of studies that aim the clarify how the CLD are formed, modified and regulated. Through these studies it is possible to get a better understanding of the relationship between the excessive accumulation of body lipids and the metabolic syndrome (obesity, diabetes and atherosclerosis).

Introdução: A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é uma das formas mais comuns de doença hepática, que acomete cerca de 20% a 30% da população adulta, sendo encontrada mais frequentemente em indivíduos obesos (~90%). Dentre os principais fatores etiológicos estão: resistência à insulina, disfunção mitocondrial e estresse oxidativo. Até o presente momento não há tratamento farmacológico específico para a DHGNA, por isso modificações no estilo de vida como redução do peso corporal (PC), dieta e prática regular de exercício físico são eficazes no combate a DHGNA. Entretanto ainda não está elucidado quais os principais impactos do exercício físico na DHGNA. Objetivos: Com isso, propusemos um estudo experimental que avaliou o efeito do treinamento físico sobre metabolismo oxidativo, funcionalidade mitocondrial hepática e muscular (soléo) e lipogênese hepática em modelo de DHGNA em camundongos obesos (ob/ob). Métodos: Utilizou-se 14 (ob/ob) com déficit em leptina e forma divididos em dois grupos: Sedentário (SED)=7 e treinados (TF=7) de acordo com o equilíbrio na média do PC. Estes animais foram submetidos a um protocolo de 8 semanas de treinamento físico aeróbio (TFA) a 60% da velocidade máxima obtida no teste de corrida realizado no último dia da semana de adaptação ao TFA. Na quarta semana foi realizado o reajuste da intensidade apenas nos TF e o teste de capacidade de corrida foi aplicado na oitava semana em ambos os grupos para se avaliar o desempenho dos animais nas variáveis ligadas ao TFA. Avaliou-se durante todo o protocolo: peso corporal (PC) em média, percentual, evolução do PC e consumo de água e ração. Na expressão gênica intra-hepática e muscular foram analisados: PGC-1Alfa, CPT-1Alfa e PPAR-Alfa relacionados a funcionalidade mitocondrial, em adição analisou-se no fígado: SREBP1. No metabolismo oxidativo analisou-se: biomarcadores (MDA e carbonilas), atividade enzimática de SOD, CAT e GST, sistema antioxidante não enzimático: sulfidrilas, GSH e GSH/GSSG, enzimas metabólicas (Citrato sintase e Beta-HAD). Foi realizada análise histopatológica hepática por HE, além do peso absoluto e relativo dos tecidos hepático e adiposo branco retroperitoneal, periepididimal e inguinal. Resultados: Na análise intergrupo em relação ao PC, observou-se redução significativa no grupo TF, assim como nos consumos de água e ração que foram significativamente menores após 8 semanas: Na análise de expressão gênica hepática encontramos aumento de PGC-1Alfa (p=0,002) e menor de CPT-1Alfa p=0,03) no grupo LTF após 8 semanas de TFA. No músculo Soléo encontramos maior expressão dos genes: PGC-1Alfa (p=0,002) e CPT-1Alfa (p=0,01). Em relação a MDA e carbonilas não houve diferença intergrupo, assim como em SOD, CAT e GST. Entretanto, quando analisamos o sistema antioxidante não enzimático, encontramos que os TF obtiveram maior nível de: sulfídrilas (p=0,02), GSH (p=0,001) e GSH/GSSG (p=0,02), além maior ativação das enzimas metabólicas: citrato sintase (p=0,004) e Beta-HAD (p=0,01). No peso dos órgãos, o TF demonstrou menor peso absoluto e relativo hepático e retroperitoneal. Na análise histológica, não houve diferença significante. Conclusões: Nossos dados demonstram que TFA melhorou o controle do PC, hiperfagia e peso do fígado e retroperitoneal, funcionalidade mitocondrial e metabolismo oxidativo em (ob/ob) com DHGNA. Há necessidade uma intervenção a longo prazo com TFA, para que se posso visualizar possíveis melhorias histológicas / Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is one of the most common forms of liver disease, affecting about 20% to 30% of the adult population, being found more often in obese individuals (~ 90%). Among the main etiological factors are insulin resistance, mitochondrial dysfunction and oxidative stress. To date, no specific pharmacological treatment for NAFLD, so lifestyle modifications such as: reduction in BW, diet and regular practice of physical exercise are effective, however it is not yet elucidated what the main impacts of physical exercise on NAFLD. Therefore, we proposed an experimental study that evaluated the effect of physical training on oxidative metabolism, hepatic and muscular mitochondrial function (soles) and hepatic lipogenesis in an ob / ob model of NAFLD. We used 14 (ob / ob) with leptin deficiency and divided into two groups: Sedentary (SED) = 7 and Trained (TF = 7) according to the mean BW balance. These animals were submitted to an 8-week protocol of aerobic physical training (AET) at 60% of the maximum velocity obtained in the running test performed on the last day of the week of adaptation to AET. In the fourth week the intensity adjustment was only done in the TF and the running capacity test was amplified in the eighth week in both groups to evaluate the performance of the animals in the variables linked to the AET. It was evaluated throughout the protocol: body weight (BW) on average, percentage, BW evolution and water and feed consumption. In the intrahepatic and muscular gene expression were analyzed: PGC-1Alpha, CPT-1Alpha and PPAR-Alpha related to mitochondrial functionality, in addition liver was analyzed: SREBP1. In the oxidative metabolism, we analyzed: biomarkers (MDA and carbonyls), enzymatic activity of SOD, CAT and GST, non-enzymatic anti-oxidant system: sulfhydryl, GSH and GSH / GSSG, metabolic enzymes (Citrate synthase and Beta-HAD). Hepatic histopathological analysis was performed by HE, in addition to the absolute and relative weight of the hepatic and white retroperitoneal, periepididimal and inguinal adipose tissues. In the intergroup analysis in relation to BW, a significant reduction was observed in the TF group, as well as in the water and feed intakes that were significantly lower after 8 weeks: In the analysis of hepatic gene expression we found an increase of PGC-1Alpha (p = 0.002) and CPT-1 = 0.0Alpha 3) in the TF group after 8 weeks of AET. In the soleus we found higher expression of the genes: PGC-1Alpha (p= 0.002) and CPT-1Alpha (p = 0.01). In relation to MDA and carbonyls there was no intergroup difference, as in SOD, CAT and GST. When we analyzed the non-enzymatic anti-oxidant system, we found that the TF had a higher activity of: sulfhydryls (p = 0.02), GSH (p = 0.001) and GSH / GSSG (p = 0.02) metabolic enzymes: citrate synthase (p = 0.004) and Beta-HAD (p = 0.01). In the weight of the organs the TF showed lower absolute and relative hepatic and retroperitoneal weight. In the histological analysis, there was no significant difference. Our data demonstrate that AET improved BW control, hyperphagia and liver and retroperitoneal weight, mitochondrial functionality and oxidative metabolism in (ob / ob) with NAFLD. Long-term AET intervention is needed so that we can visualize possible histological improvements. We considered the effective AET to improve aspects related to NAFLD