A lesão medular é considerada uma patologia incapacitante, para a qual até o momento não há tratamento eficaz. A lesão medular resulta em perda de tecido, incluindo tratos de fibras mielinizadas que carregam informações motoras e sensoriais. Além dos déficits sensitivos e motores, existem as alterações viscerais e tróficas relacionadas com o nível da lesão e o tipo de lesão. O treino locomotor em esteira e o transplante de células-tronco têm sido utilizados como estratégias de recuperação no intuito de otimizar a recuperação da lesão medular experimental em ratos, porém, vêm sendo abordadas separadamente. O objetivo deste estudo é avaliar a eficácia do treino locomotor em esteira, do transplante de células-tronco mesenquimais de dente decíduo humano (SHEDs), e da combinação entre os tratamentos avaliando a recuperação da função motora e a regeneração medular após a lesão medular traumática em ratos Wistar machos utilizando o equipamento NYU Impactor. Os objetivos específicos foram comparar os efeitos do transplante de SHEDS com o treino locomotor em esteira e a combinação entre os tratamentos quanto à recuperação da função motora e histológica; demonstrar a possível diferenciação das SHEDs transplantadas, bem como a sua integração no tecido da medula lesada. Os resultados obtidos demonstram que o transplante de SHEDs e a combinação entre os tratamentos favorece a recuperação da função motora após a lesão medular em ratos Wistar, enquanto apenas o tratamento com o treino locomotor não se mostra eficaz. Observamos neuroproteção do tecido medular evidenciada pela redução da cavidade cística nos animais tratados com a combinação de transplante de SHEDs e o treino locomotor. Houve redução da cicatriz glial e aumento na expressão de neurofilamento médio (NF-M) no grupo SHEDs. As células transplantadas sobreviveram e se integraram ao tecido, não havendo indícios de diferenciação em astrócitos e/ou neurônios. Houve um aumento na cicatriz glial no grupo lesão e no grupo lesão tratado com treino locomotor, associado a maiores áreas de cavidade cística e baixa expressão de NF-M. A partir de nossos resultados, podemos concluir que o transplante de SHEDs, assim como a combinação entre transplante de SHEDs e treino locomotor, promovem a recuperação da função motora após lesão medular por contusão. Apesar da sobrevivência e integração das SHEDs ao tecido, não houve diferenciação em astrócitos e/ou neurônios. Apenas o transplante celular foi capaz de reduzir a cicatriz glial e manter a expressão de neurofilamento. / Spinal cord injury is a disabling traumatic condition and available therapeutic approaches are poorly effective. Spinal cord injury results in loss of tissue, including myelinated fiber tracts that carry sensory and motor information. In addition to motor and sensory deficits, there are visceral and trophic changes related to the level of injury and type of injury. In the search for new treatments, stem cells transplants and treadmill training have been studied separately to minimize spinal injury in experimental rats. The objective of this study is to evaluate the effectiveness of treatments between treadmill training, the transplantation of human exfoliated deciduous teeth (SHEDs), and the combination of treatments for functional recovery and regeneration of injured spinal cord in an experimental model of contusion spinal cord injury in rats Wistar reproduced by NYU Impactor device. The main goals were compare the effects of SHEDs transplantation with treadmill training and the combination of treatments for functional recovery and histology; demonstrate the possible differentiation of cells implanted, as well as their integration into the damage tissue. The results demonstrate that transplantation of SHEDs and combination of treatments promotes functional recovery after spinal cord injury in rats, while treatment with only the treadmill training is not efficient. Reduction of cystic cavity in the animals treated with the combination of transplantation and treadmill training was observed as an evidence of neuroprotection. We observed glial scar reduction and increased expression of neurofilament medium (NF-M) in the SHEDs group. The transplanted cells survived and integrated into the tissue, with no evidence of differentiation into astrocytes and/or neurons. Larger areas of cystic cavity, increase in glial scar and low expression of NF-M was seen in the treadmill training group. From our results, we conclude that transplantation of SHEDs, as well as the combination of transplant and treadmill training promotes functional recovery after spinal cord injury. Although the survival and integration of SHEDs on tissue, differentiation in astrocyte and/or neuron of transplanted the cells was not detected. Only cell transplantation was able to reduce the glial scar and to maintain the expression of neurofilament.

Introdução: A célula NK possui uma importante função no sistema imune inato de defesa primária contra vírus e patógenos e também realiza a imunovigilâcia tumoral. Muitos estudos clínicos tem avaliado o uso dessas células na imunoterapia adotiva. A expansão e a ativação da célula NK requer sinais e estímulos para manter a sua sobrevivência. Atualmente existem muitos protocolos para a expansão e ativação da célula NK, porém não existe uma definição do melhor método para uso clínico. Objetivo: O estudo tem como objetivo avaliar a melhor forma para expansão das células NK isoladas de células mononucleares do sangue de cordão umbilical e placentário.Método: Foram avaliadas cinco diferentes condições para expansão de células NK de mononucleares isoladas do sangue do cordão umbilical e placentário. Foram testados protocolos utilizando as interleucinas (IL), IL-2, IL-3, IL-15; com ou sem a presença do co-cultivo com células-tronco mesenquimais do cordão umbilical (CTM-CU) e, também o co-cultivo com células apresentadoras de antígeno artificiais ligadas a IL-21 à membrana (mbIL21 APC). Resultados: Os protocolos utilizando co-cultivo com APC mbIL21 foram superiores aos demais quanto à capacidade de expansão de células NK (CD3-, CD56+, CD16+). O protocolo de co-cultura de APC, CTM-CU e estímulo com IL-2 apresentaram um aumento significativo de NK (CD3-, CD56+, CD16+) quando comparado ao protocolo de APC/IL-2 sem CTM-CU (p<0,05). Conclusão: A expansão ex vivo de células NK na presença das APC e CTM-CU apresentaram uma proporção estatisticamente superior de célula NK CD16+ quando comparada com condições de cultivo com apenas a APC, tendo essas células NK potencial para utilização na imunoterapia adotiva associada com anticorpos monoclonais ou anticorpos bi-específicos. / Background: Natural killer (NK) cells play a major role in innate immunity, especially against viral pathogens, and are also a part of the immune surveillance of tumors. Several clinical trials have evaluated the use of these cells for adoptive cell immunotherapy. Ex vivo expansion of NK cells, however, is a complex process which requires multiple cell signals to ensure cell survival, proliferation, and activation. There are many protocols used for NK cell expansion and activation, however, there is a lack of evidence regarding which method is the most effective for clinical grade NK cells expansion. Objective: The main purpose of this study is to evaluate an optimal protocol for the ex vivo expansion of NK cells isolated from umbilical cord blood mononuclear cells (CB-MNC). Methods: Five different conditions for the expansion of umbilical cord-derived NK cells were evaluated. Each protocol was a different combination of interleukins (IL-2, IL-3, and IL-15) with or without the presence of feeder cells or artificial antigen presenting cells (aAPCs). Feeder cells utilized were umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSC), and aAPCs were membrane-bound IL-21 artificial APCs (mbIL21 aAPCs). Results: Protocols employing mbIL21 aAPCs demonstrated greater expansion of natural killer cells (CD3- CD56+) than the other protocols. The protocol employing aAPCs, IL-2 and UC-MSC feeder cells had a statistically significant higher proportion of CD16+ NK cells when compared to the protocol without the MSC feeder cells, but there was no significant difference in the expansion of total natural killer cells concerning these two protocols. Conclusion: Ex vivo expansion of NK cells in the presence of aAPCs and UC-MSC feeder cells yielded a significant higher proportion of CD16+ NK when compared to the aAPCs only culture condition, and could be a better product for NK adoptive immunotherapy in conjunction with monoclonal or bi-specific antibodies.

Uma potencial alternativa para o transplante de tecidos é a engenharia de tecidos. Células-tronco mesenquimais e scaffolds eletrofiados são comumente utilizados nesta área devido à capacidade multipotente de diferenciação destas células e à rede de poros interconectados destas estruturas fibrosas. Além disso, bioreatores de perfusão podem ser utilizados para melhorar o transporte de nutrientes e reduzir o acúmulo de metabolitos tóxicos. Neste contexto, uma maneira de estudar e otimizar o sistema de cultivo é utilizar técnicas de modelagem para descrever interações ou processos individuais envolvidos no crescimento celular. Deste modo, o objetivo geral deste estudo é realizar o cultivo de células-tronco mesenquimais da polpa de dente decíduo (DPSCs) utilizando scaffolds tridimensionais eletrofiados de policaprolactona (PCL), biorreatores e técnicas de modelagem. Inicialmente foram testadas diferentes misturas de solventes (clorofórmio e metanol), a fim de produzir scaffolds com poros adequados ao cultivo tridimensional. Os diâmetros de fibra e de poro foram determinados por microscopia eletrônica de varredura (MEV). O crescimento e o metabolismo das células foram avaliados através da determinação da atividade metabólica e das concentrações de glicose e lactato do meio de cultivo, e a infiltração celular foi observada com a marcação do núcleo celular. Depois de estabelecidos os parâmetros de eletrofiação, o efeito da perfusão direta no desprendimento de DPSCs de scaffolds eletrofiados de PCL foi estudado. A atividade metabólica das células foi determinada para diferentes tempos de adesão, vazões e densidades de semeadura, e a tensão de cisalhamento na parede do poro foi calculada para cada vazão. A morfologia das células foi avaliada através de imagens de microscopia confocal e MEV. Paralelamente, foram realizadas simulações utilizando o software OpenFOAM para estudar como os parâmetros e variáveis de entrada (concentração inicial de glicose, porosidade e espessura do scaffold) afetam as saídas (fração volumétrica de células e concentração de substrato) de um modelo de proliferação celular que considera a difusão e o consumo de glicose. As contribuições do teor de oxigêno na cinética de crescimento de Contois e da variação da porosidade com o tempo devido à degradação do polímero também foram avaliadas. Inicialmente, foi observado que apenas um tamanho de poro maior que o diâmetro da célula permitiu a infiltração das células no scaffold. Então, observou-se que o aumento do tempo de adesão acarretou em maior espalhamento das células e, assim como a diminuição da densidade de semeadura e da tensão de cisalhamento, resultou em uma redução do desprendimento das células sob perfusão. Quanto ao modelo fenomenológico, observou-se maior sensibilidade à concentração inicial de glicose e à porosidade do scaffold, e aos parâmetros adimensionais relacionados à proliferação e morte celular e ao consumo de nutrientes. Além disso, o número inicial de células apresentou maior impacto no transporte de massa do que no crescimento celular. Neste estudo, foi possível obter scaffolds eletrofiados e conduções de cultivo dinâmico adequadas ao cultivo tridimensional de DPSCs, e elucidar os efeitos da limitação do transporte de massa e do oxigênio no crescimento celular, e da degradação do polímero no transporte de massa. / A potential alternative to tissue transplant is tissue engineering. Mesenchymal stem cells and electrospun scaffolds are commonly used in this field due to the multipotent differentiation capacity of these cells and the interconnected pore network of these fibrous structures. In addition, perfusion bioreactors can be used to enhance nutrient transport and reduce the accumulation of toxic metabolites. In this context, one way to study and optimize the culture system is to use modeling techniques to describe interactions or individual processes involved in cell growth. Thus, the objective of this study is to perform the three-dimensional culture of mesenchymal stem cells of dental pulp (DPSCs) using electrospun polycaprolactone (PCL) scaffolds, bioreactors and modeling techniques. Initially, different solvent mixtures (chloroform and methanol) were tested to produce scaffolds with pores suitable to three-dimensional culture. Fiber and pore diameter was determined using a scanning electron microscope. Cell growth and metabolism were evaluated through the metabolic activity and the culture medium concentration of glucose and lactate, and the cell infiltration was observed with cell nuclei staining. After the establishment of the elesctrospinning parameters, the effect of direct perfusion on DPSCs detachment from PCL electrospun scaffolds was investigated. The metabolic activity of the cells was determined for different adhesion times, flow rates and seeding densities and the pore wall shear stress was calculated for each flow rate. The cell morphology was evaluated through scanning electron and confocal microscopy imaging. In parallel, simulations with the software OpenFOAM were performed to study how parameters and inputs (initial glucose concentration, porosity and thickness of the scaffold) affect the outputs (cell volume fraction and substrate concentration) of a model of cell proliferation and glucose diffusion and consumption. The contribution of the oxygen in the Contois growth kinetics and the porosity variation with time due to polymer degradation was also evaluated. Initially, it was observed that only a pore size higher than the cell diameter allowed the infiltration of the cells through the scaffold. Then, it was observed that a higher adhesion time leaded to higher cell spreading in static conditions and, similar to smaller seeding densities and shear stresses, reduced cell detachment under perfusion. Regarding the phenomenological model, it was observed that the model is more responsive to the initial glucose concentration and scaffold porosity, and to the dimensionless parameters related to cell proliferation, death and nutrient uptake. Furthermore, the initial cell number had a more significant impact on mass transport than on cell growth. In this study, it was possible to obtain an electrospun scaffold and dynamic culture conditions suitable for the three-dimensional culture of DPSCs, and to elucidate the effects of transport limitations and of oxygen on cell growth, and of polymer degradation on mass transport were elucidated.

A síndrome de Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser (MRKH) caracteriza-se pela aplasia congênita dos ductos Mullerianos. Devido a algumas características peculiares, as células-tronco mesenquimais estão sendo vistas como uma nova alternativa de tratamento em pacientes acometidos pela síndrome de MRKH. Considerando que alguns biomateriais servem como suporte estrutural e interferem positivamente na regeneração tecidual, a associação da linhagem celular de mucosa vaginal HMV-II e das MSC derivadas de tecido adiposo humano com biomateriais apresenta uma nova possibilidade na criação de neovagina. Nesta perspectiva, foram cultivadas células HMV-II com diferentes biomateriais (Membracel, Biofilme, Cellprene, PLGA PI quimicamente modificado) a fim de selecionar o melhor material alternativo. Ambas as células, associadas ao biomaterial selecionado, foram submetidas à análise morfológica, coloração ácido periódico-Schiff (PAS), expressão de marcadores epiteliais específicos por imunofluorescência e microcopia eletrônica de varredura (MEV). As células que interagiram com o biomaterial apresentaram marcadores epiteliais específicos e características morfológicas epiteliais. Estes resultados indicam que a interação do biomaterial com ambas as células testadas tem potencial capacidade para uma epitelização eficiente da neovagina. O crescimento das MSC com o biomaterial selecionado para implantação subsequente em pacientes com síndrome de MRKH pode representar uma alternativa válida e promissora para a reconstrução vaginal. / The Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser (MRKH) syndrome is characterized by congenital aplasia of the Mullerian ducts. Because mesenchymal stem cells (MSCs) secrete paracrine factors, they have been seen as a new treatment option for several diseases. Considering that some biomaterials can be used as scaffolds and interfere positively in tissue regeneration, the association of human vaginal mucosa (HMV-II) cell line and MSCs with biomaterials appears as a new option for the creation of neovagina. In this study we cultured HMV-II cells with different biomaterials (Membracel, Biofilm, Cellprene, chemically modified PLGA PI) to select the best alternative material. For that both cells were cultured with the selected biomaterial and evaluated by morphological analysis, periodic acid-Schiff (PAS) staining, expression of epithelial markers by immunofluorescence and scanning electron microscopy (SEM). The analysis of the in vitro cell-biomaterial interactions showed specific epithelial markers and epithelial morphological features for both cells. These results indicate that the interaction of the biomaterial with the two tested cells has the potential capacity for an efficient epithelialization of the neovagina. Therefore, growth of MSCs with the selected biomaterial for subsequent implantation in patients with MRKH syndrome may represent a valid and promising alternative for vaginal reconstruction.

Durante a vida reprodutiva das éguas o endométrio é exposto a eventos como: cópula, parto, puerpério e infecções. Tais circunstâncias podem levar gradativamente a diminuição da capacidade funcional do endométrio com queda da fertilidade. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento com o meio condicionado de células tronco mesenquimais sobre o endométrio de éguas com fibrose uterina através de avaliação histopatológica. No experimento 1, 21 éguas que não pariram pelo menos em duas temporadas foram avaliadas por meio de exames ultrassonográfico, citológico, bacteriológico e histopatológico. No experimento 2, das 21 éguas avaliadas, quatro éguas classificadas como grau II e duas éguas classificadas como grau III na histopatologia endometrial, foram submetidas a infusão uterina com o meio condicionado de células tronco mesenquimais para promover a regeneração endometrial. No experimento 1, a presença de edema uterino foi observada em 81% (17/21) das fêmeas líquido intrauterino em 23,81% (5/21) e cistos uterinos em 57,14% das éguas (12/21). O crescimento bacteriano identificado em 42,90% (9/21) das éguas pelo exame bacteriológico revelou predominância de Escherichia coli (4/21). O exame citológico revelou processo inflamatório em 44,40% das fêmeas (4/9) com crescimento bacteriano, enquanto 16,70% (2/12) das éguas sem crescimento bacteriano tinham presença de processo inflamatório (P = 0,331). A inflamação uterina foi detectada em 28,60% (6/21) das éguas. A biópsia uterina e avaliação histopatológica revelou 14,30% (3/21) das éguas pertencentes à classe Grau I, 47,60% Grau II (10/21) e 38,10% Grau III (8/21). Verificou-se correlação positiva significativa (r = 0,69; P = 0,0005) entre o grau de endometrose pelo Índice de Caslick e o grau atribuído após exame histopatológico. Maior percentual de éguas com índice Caslick superior a 200 foi observado (P= 0,0242) em éguas classificadas como Grau III (87,5%; 7/8) do que Grau I (0,0%; 0/3). Não houve diferença (P= 0,59) entre as éguas Grau III e as Grau II (70%; 7/10); estas últimas tenderam (P= 0,07) a ter maior percentual com índice Caslick acima 5 de 200 do que as fêmeas com Grau I. O índice Caslick médio comparado entre os graus histológicos revelou maior índice nas éguas Grau III do que nas éguas Grau I (252,0 vs 78,3; P= 0,007). As éguas com Grau II apresentaram índice intermediário (174,6). Não houve associação entre a presença de cistos uterinos e o grau histopatológico das biópsias (P= 0,813). Éguas com cistos uterinos tiveram 16,7%, 41,7% e 41,7% das biópsias classificadas no exame histológico como Graus I, II e III, respectivamente. Esses percentuais nas éguas sem cistos foram de 11,1%, 55,6% e 33,3%, para os Graus I, II e III, respectivamente. A idade média das fêmeas foi similar (P= 0,112) entre as fêmeas com e sem cistos uterinos (20,3 vs 16,3 anos). No experimento 2, a aplicação de 20 mL de meio condicionado de células tronco no lúmen uterino das seis éguas com endometrose grau II e III não resultou em melhoria na condição endometrial. / During the mare reproductive life, the endometrium is exposed to events such as copulation, parturition, puerperium, and infections. Such circumstances may gradually lead to a decrease in the functional capacity of the endometrium, resulting in a drop in fertility. The objective of this study was to evaluate, by using ultrasonographic, cytological, bacteriological, and histopathological exams, the effect of a treatment with mesenchymal stem cell-conditioned medium on the endometrium of 21 mares with uterine fibrosis that did not foal in at least two seasons. In experiment 1, 21 mares were evaluated by using ultrasonographic, cytological, bacteriological and histopathological exams. In experiment 2, from the total 21 females, four mares classified by the endometrial histopathology as grade II and two mares classified as grade III were submitted to uterine infusion with mesenchymal stem cell-conditioned medium to promote the endometrial regeneration. In experiment 1, the evaluation revealed the presence of uterine edema in 81% (17/21), intrauterine liquid in 23.81% (5/21), and uterine cysts in 57.14% of the mares (12/21). Bacteriological examination revealed that 42.86% (9/21) of the mares showed bacterial growth, and the microorganism with the highest incidence was Escherichia coli (4/21). The cytological exam showed inflammatory process in 44.40% (4/9) of the females with bacterial growth, while 16.70% (2/12) of the mares without bacterial growth showed inflammatory process (P = 0.331). Uterine inflammatory process was observed in 28.60% (6/21) of the mares. It was possible to identify by using uterine biopsy and histopathological evaluation that 14.30% (3/21), 47.60% (10/21), and 38.10% (8/21) of mares belong to Grade I, II and III, respectively. There was a significant positive correlation (r = 0.69, P = 0.0005) between the degree of endometrosis evaluated by the Caslick Index and the grade attributed after histopathological examination. The percentage of mares with Caslick index over 200 was higher in females classified as grade III (P= 0.0242) than in grade I females (0.0%; 0/3). There was no difference between mares grade III and grade II 7 (70%; 7/10). Grade II females tended to have a higher percentage with Caslick index above 200 (P = 0.07) when compared to the grade I females. The medium Caslick index compared between the histological grades revealed a higher index in grade III than in grade I mares (252.0 vs 78.3, P = 0.007). Mares grade II showed intermediate index (174.6). There was no association between the presence of uterine cysts and the histopathological grade of biopsies (P = 0.813). Mares with uterine cysts had 16.70%, 41.70%, and 41.70% of the biopsies classified in the histological examination as grades I, II, and III, respectively. The percentages in mares without cysts were 11.10%, 55.60%, and 33.30%, respectively, for Grade I, II and III. The mares mean age was similar (P=0.112) among females with or without uterine cysts (20.3 vs 16.3 years). In experiment 2, the application of 20 mL of mesenchymal stem cell-conditioned medium in the uterine lumen of six mares with endometrosis Grade II and III did not improve the endometrial condition.

Muito se tem investido em pesquisa na compreensão dos processos e fenômenos envolvidos nas respostas imunes às infecções e, principalmente, no desenvolvimento de recursos e tecnologias a fim favorecer os avanços no tratamento da sepse. Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar os efeitos anti-inflamatórios das células-tronco mesenquimais (MSCs) quando administradas por duas diferentes vias: intraperitoneal (IP) e intravenosa (IV), determinando qual a melhor via de traramento, em modelo experimental murino de sepse. Foram utilizados 31 camundongos da linhagem C57Bl/6 para padronização do modelo de Ligadura e Perfuração do Ceco (CLP). Após os experimentos de estabelecimento do modelo, outros 60 animais foram distribuídos em nove grupos: grupo CONTROLE, grupo sepse sem tratamento (SEPSE), grupo SHAM, grupo sepse com administração de PBS via IV (SEPSE PBS IV), grupo sham com administração de PBS via IV (SHAM PBS IV), grupo sham com administração de MSCs via IV (SHAM MSC IV), grupo sham com administração de MSCs via IP (SHAM MSC IP), grupo sepse com administração de MSCs via IP (SEPSE MSC IP) e grupo sepse com administração de MSCs via IV (SEPSE MSC IV). Transcorridas 6 horas da indução da sepse pelo modelo CLP, padronizado com oclusão total do ceco seguida de uma única punctura com agulha 18G, os animais receberam o tratamento de acordo com o grupo que compunham. Após 24 horas do procedimento cirúrgico, procedeu-se a eutanásia dos animais para coleta dos órgãos, sangue e fluidos peritoneais. As amostras foram analisadas quanto aos parâmetros histológicos, hematológicos e inflamatórios, respectivamente. Com base nos resultados obtidos, foi possível concluir que: 1) O modelo CLP padronizado com oclusão total do ceco e uma punctura com agulha 18G induziu sepse aguda nos animais; 2) A administração das MSCs via IP foi atenuadamente mais eficaz na redução da concentração de leucócitos hematológicos e no quadro de trombocitopenia instalado nos animais com sepse induzida; 3) A injeção IP das MSCs diminuiu, com maior eficiência, a infiltração de células inflamatórias na região abdominal dos animais doentes. 4) As citocinas IL-6, TNF-α e IL- 10 obtiveram queda de suas concentrações séricas com a terapia nos animais dos grupos submetidos à indução da sepse. 5) O tratamento com MSCs melhorou o grau de peritonite, necrose e ulcerações observadas na histologia do ceco dos animais, com melhores resultados encontrados no grupo SEPSE MSC IP. / Much has been invested on research regarding comprehension of the processes and phenomena that are involved in immune responses to infections and mainly on resources and technologies development in order to support advances in the treatment of sepsis. This study has been performed in order to evaluate the anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cells (MSCs) when administered by two different routes: intraperitoneal (IP) and intravenous (IV), to determine which is the best treatment route, in an experimental murine model of sepsis. Thirty-one C57Bl/6 strain mice have been used to standardize the Cecal Ligation and Perforation (CLP) model. After the establishment of CLP, 60 animals were allocated into nine groups: CONTROL group, sepsis group without treatment (SEPSE), SHAM group, sepsis group with intravenously administration of PBS (SEPSE PBS IV), sham group with intravenously administration of PBS (SHAM PBS IV), sham group with intravenously administration of MSCs (SHAM MSC IV), sham group with intraperitoneal administration of MSCs (SHAM MSC IP), sepsis group with intraperitoneal administration of MSCs (SEPSE MSC IP), and sepsis group with intravenously administration of MSCs (SEPSE MSC IV). 6 hours after the induction of sepsis by CLP model, standardized with total occlusion followed by a single cecal puncture with a 18G needle, the animals received the treatment according to the group they belonged to. 24 hours after the surgical procedure the animals were sacrificed in order to get the organs, blood and peritoneal fluid. The samples were analyzed for histological, haematological and inflammatory parameters, respectively. Basing on the results it was concluded that:1) The CLP model standardized with total occlusion followed by a single cecal puncture with a 18G needle induced acute sepsis in the animals; 2) The intraperitoneal administration of MSCs was slightly better in reducing the hematological concentration of leukocytes and the installed picture of thrombocytopenia in sepsis groups; 3) the intraperitoneal injection of MSCs decreased, with greater efficiency, the inflammatory cells infiltration in the abdominal cavity of sepsis groups. 4) The IL-6, TNF-α and IL-10 cytokines had their serum concentrations decline with therapy, in the groups subjected to induction of sepsis. 5) Treatment with MSCs improved the severity of peritonitis, necrosis and ulceration observed in cecum histology, with better results in the SEPSIS MSC IP group.

Introdução: A engenharia tecidual óssea com utilização de células-tronco mesenquimais é um campo de pesquisas com potencial para aplicação clínica em cirurgia plástica reparadora. Suas vantagens seriam ampliar as opções de reconstrução e diminuir a morbidade cirúrgica nas zonas doadoras. Não está definida na literatura médica a possibilidade de utilizar o osso liofilizado bovino nãodesmineralizado como estrutura tridimensional e carreadora celular para engenharia tecidual óssea. Objetivo: Avaliar o uso de células da medula óssea, com potencial osteogênico, agregadas a estrutura tridimensional de osso liofilizado bovino nãodesmineralizado para engenharia tecidual óssea, em modelo experimental heterotópico. Materiais e Métodos: Os animais doadores de células da medula óssea, assim como os animais receptores dos construtos ósseos, foram camundongos de linhagem isogênica C57Bl/6. Os construtos ósseos consistiram em osso liofilizado bovino não-desmineralizado (OL) associado a diferentes grupos celulares com potencial osteogênico, e foram implantados no plano subcutâneo no dorso dos animais, em procedimento cirúrgico compatível com a primeira etapa da confecção de retalho osteocutâneo pré-fabricado. Grupos de comparação (n=10 em cada grupo): 1) OL isoladamente (controle); 2) OL + células mononucleares da medula; 3) OL + células-tronco mesenquimais; 4) OL + células-tronco mesenquimais diferenciadas em meio osteoindutor. A aferição foi realizada após 5 semanas, com avaliação histológica e determinação da atividade de fosfatase alcalina. Resultados: A avaliação histológica não mostrou diferença entre os grupos de comparação. Em todas as amostras observou-se processo inflamatório crônico, com nítida reabsorção óssea, e com tecido conjuntivo fibroso circunjacente ao implante estendendo-se por entre as trabéculas ósseas. Não foram visualizados osteoblastos ou osteócitos viáveis, nem neoformação óssea, em nenhum dos cortes histológicos examinados. Os resultados da atividade de fosfatase alcalina também não mostraram diferença entre os grupos de comparação, com análise de variância entre grupos mostrando p=0,867. Discussão: No modelo estudado, a adição de células da medula óssea com potencial osteogênico sobre estrutura de osso liofilizado bovino não-desmineralizado não agregou propriedades osteogênicas ao material. Com isso, não se confirmou a perspectiva inicial de utilizá-lo como estrutura tridimensional e carreadora celular na engenharia tecidual óssea em sítio heterotópico. Para melhor definir o papel deste material, sugerem-se estudos subseqüentes que o avaliem em outros modelos experimentais, comparando com outros materiais de uso já estabelecido, e explorando separadamente cada etapa metodológica que possa influir no sucesso da engenharia tecidual óssea. / Introduction: Bone tissue engineering using mesenchymal stem cells is a research area with potential applicability in reconstructive plastic surgery, aiming to broaden surgical choices and decrease morbidity in donor sites. It has not been established in the medical literature whether bovine non-demineralized lyophilized bone can be used as a scaffold and cell carrier for bone tissue engineering. Objective: To assess the use of bone marrow cells with osteogenic potential seeded on a bovine non-demineralized lyophilized bone scaffold for bone tissue engineering in a heterotopic experimental model. Materials and Methods: The donors of bone marrow cells, as well as the receptors of the osseous constructs were isogenic line C57BI/6 mice. The constructs consisted on bovine non-demineralized lyophilized bone (LB) with addition of different cell groups with osteogenic potential, and they were implanted into subcutaneous sites on the backs of the animals in a surgical procedure compatible with an osteocutaneous flap pre-fabrication. Comparison groups (n=10 each group): 1) LB alone (control group); 2) LB + marrow mononuclear cells 3) LB + mesenchymal stem cells; 4) LB + mesenchymal stem cells differentiated in an osteoinductive medium. The constructs were harvested at 5 weeks after implantation for histological analysis and alkaline phosphatase activity test. Results: The histological analysis did not show differences among the comparison groups. In all samples, chronic inflammatory process was observed, with evident osseous resorption, and with adjacent fibrous connective tissue rich in neovessels extending through bone trabeculae. Viable osteoblasts or osteocytes , as well as new bone formation, were not observed. Likewise, results of the alkaline phosphatase activity test have not shown any difference among comparison groups, with analys of variance between groups showing p value=0.867. Discussion: In this experimental model, the addition of bone marrow cells with osteogenic potential to a bovine non-demineralized lyophilized bone scaffold did not add osteogenic properties to the material. Therefore, the initial perspective of using it as a scaffold for bone tissue engineering in heterotopic sites could not be confirmed. In order to better define the role of this material, further studies should be conducted, assessing it in other experimental models, comparing it with other materials currently in use and separately exploring each methodological step that might influence the success of bone tissue engineering.

Durante as duas últimas décadas, têm ocorrido progressos substanciais a respeito do entendimento da fisiopatologia da cicatrização de feridas, e novas terapias tem sido desenvolvidas. Contudo, acelerar o processo de reparo continua sendo um desafio no campo da cirurgia plástica reconstrutiva. Tratamentos inovadores para melhorar a cicatrização e a regeneração cutânea são necessários e é nesse âmbito que as pesquisas com as células-troncos mesenquimais (MSCs) vêm ganhando espaço na última década. As MSCs foram estudadas em diversas áreas no que diz respeito ao seu efeito sobre a cicatrização de lesões e suas aplicações clínicas. Relatos apontam que tanto as MSCs originárias da medula óssea influenciam beneficamente a cicatrização de feridas, quanto originárias do tecido adiposo (ADSCs). A vantagem das ADSCs está na facilidade de serem coletadas, baixas taxas de morbidade e pelo alto rendimento de MSCs por coleta. Estudos demonstram que a eletroacupuntura (passagem de eletricidade através de agulhas de acupuntura inseridas na pele) pode exercer efeito cicatrizante em feridas cutâneas experimentalmente induzidas por meio do aumento da proliferação e da migração de células epiteliais e do tecido conjuntivo envolvidos no reparo de feridas. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo avaliar o efeito da terapia com ADSCs no processo da cicatrização de feridas cutâneas em coelhos induzidas experimentalmente. Além disso, avaliar se a eletroacupuntura (EA) é capaz de causar efeito sobre a terapia com ADSCs no reparo de lesões cutâneas experimentais. Para tanto, foram utilizados 32 coelhos divididos em quatro grupos: GCTAD (ADSCs), GCTADE (ADSCs associado a EA), GE (EA) e GC (controle) o período de avaliação das lesões foi de 15 dias. As feridas induzidas cirurgicamente foram avaliadas por observações clinicas e análises histológicas. Os animais do GCTAD apresentaram uma velocidade cicatricial superior aos demais grupos até a quinta avaliação. Já na sétima avaliação o GE passa a ter a melhor taxa de contração cicatricial superando o GCTAD (p=0,039) e o GC (p=0,05). O GCTAD apresentou as maiores médias nas variáveis histológicas: proliferação vascular (p=0,059), proliferação fibroblástica (p=0,05) e Ki67. Nas variáveis reepitelização e colagenização as médias foram maiores que a dos outros grupos, mas semelhantes ao GE e a presença de queratina, da mesma forma, semelhante ao GCTADE. O GCTADE se destaca pela presença de folículos pilosos (p=0,026) e pelas maiores médias encontradas para as células mononucleares e polimorfonucleares, mas esses valores não configuram diferença estatística significativa. Por meio desse experimento, demostrou-se que o GCTAD melhora a cicatrização de feridas, acelerando a fase proliferativa do processo cicatricial. A associação dos tratamentos EA e ADSCs só foi considerada superior aos outros tratamentos na avaliação da presença de folículos pilosos. Talvez, o beneficio dessa associação seja mais evidente se o estudo for feito por um período superior aos 15 dias, ou seja, durante a fase de remodelamento da cicatrização, onde pode ser que se verifique um aspecto cosmético mais favorável da cicatriz. / The pathophysiology understanding of wound healing has been substantial progress during the last two decades, and new therapies have been developed. However, to accelerate the repair process remains a challenge in the field of reconstructive plastic surgery. Innovative treatments to enhance wound healing and cutaneous regeneration are necessary and in this context the research with mesenchymal stem cells (MSCs) are getting space in the last decade. MSCs have been studied in several areas with regard to its effect on the healing of lesions and their clinical applications. Reports indicate that both MSCs from bone marrow beneficially influence wound healing, as originating from adipose tissue (ADSCs). The advantage of ADSCs is because they can be easily collected, with low rates of morbidity and the high yield of MSCs per collection. Studies show that electro acupuncture (passing electricity through the acupuncture needles inserted into the skin) can have a healing effect on experimentally induced skin wounds by increasing the proliferation and migration of epithelial cells and connective tissue involved in wound repair. Thus, this study aims to evaluate the effect of therapy with ADSCs in the process of skin wound healing in rabbits that were experimentally induced. Moreover, to evaluate whether electro acupuncture (EA) is capable to causing effect on ADSCs therapy in the repair of experimental skin lesions. Therefore, it was used 32 rabbits divided into four groups: GCTAD (ADSCs), GCTADE (ADSCs associated with EA), GE (EA) and CG (control) the evaluation period of the lesions was 15 days. The surgically induced wounds were evaluated by clinical observations and histological analysis. The GCTAD animals showed an accelerated wound healing than the other groups until the fifth assessment. In the seventh evaluation GE replaced by the best healing rate than GCTAD (p = 0.039) and CG (p = 0.05). The GCTAD had the highest averages in the histological variables: vascular proliferation (p = 0.059), fibroblast proliferation (p = 0.05) and Ki67. Reepithelialization and collagen variables the averages were higher than other groups, but similar to GE and the presence of keratin, the same way, similar to GCTADE. The GCTADE stands by the presence of hair follicles (p = 0.026) and by the major averages found for the mononuclear and polymorph nuclear cells, but these values are not statistically significant. Through this experiment, we show that the GCTAD improves wound healing by accelerating the proliferation phase of healing. The combination of EA and ADSCs treatments were not considered superior to other treatments in assessing the presence of hair follicles. Perhaps the benefit of this association is more evident if the study is done for a period exceeding 15 days, during the remodeling phase of healing, it could be ascertained a more favorable cosmetic appearance of the scar.

A regeneração óssea alveolar tem sido um dos principais alvos de estudo na odontologia, tanto humana como veterinária, principalmente na implantodontia e nas cirurgias periodontais e buco-maxilo-faciais. Em função disto, este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a regeneração óssea alveolar, utilizando como enxerto osso liofilizado e células-tronco mesenquimais (MSCs), oriundas da polpa dentária de um doador macho para enxerto alogênico. Foram utilizados 57 coelhas, Nova Zelândia, sendo um coelho doador das MSCs, distribuídos em sete grupos: controle (G1), osso liofilizado (G2), Matrigel (G3), Matrigel e MSC (G4), osso liofilizado e Matrigel (G5), Osso liofilizado, Matrigel e MSC (G6) e somente MSC (G7). Após a exodontia do incisivo inferior esquerdo, o alvéolo recebia o implante de acordo com cada grupo e avaliados em sete dias. As amostras foram coletadas para análise microscópica, desmineralizadas e não desmineralizadas, PCR, além de terem sido submetidas à análise radiográfica, a qual também era realizada no pré e no pós-operatório imediato. Macroscopicamente, foi observado espessamento do ramo mandibular dos animais dos grupos que receberam Matrigel e aceleração do crescimento dos dentes incisivos remanescentes nos animais que receberam terapia celular. Na análise microscópica, constatou-se que, todos os grupos que receberam como enxerto o osso liofilizado, o tempo de regeneração foi menor, embora o grupo controle tenha apresentado melhor organização na regeneração óssea, sendo que o tratamento com Matrigel resultou ainda em uma reação inflamatória exacerbada, dado este confirmado também nas amostras não desmineralizadas. As radiografias periapicais também apontaram que os grupos que foram tratados com osso liofilizado apresentavam maior área de radiopacidade, sugerindo aceleração do processo de regeneração. Porém, o teste de PCR não detectou a presença do cromossomo Y do doador nas fêmeas receptoras das MSCs. Os resultados sugerem que o uso da terapia celular diminui o tempo de regeneração óssea alveolar e, quando aliada ao osso liofilizado, acelera este processo. Entretanto, decorridos sete dias da aplicação do Matrigel, houve aumento da espessura do ramo mandibular no alvéolo onde foi aplicado, necessitando maior tempo de avaliação para melhor elucidar seu uso clínico. / The alveolar bone regeneration has been a major focus of study in dentistry, both human and veterinary medicine, especially in implant and periodontal surgery and in the bucco-maxillo facial. Because of this, this study was to evaluate alveolar bone regeneration, using lyophilized bone and implant as mesenchymal stem cells (MSCs) derived from the dental pulp of a male donor for allogeneic graft. We used 57 female New Zealand rabbits, one rabbit MSCs from donor, divided into seven groups: control (G1), lyophilized bone (G2), Matrigel (G3), Matrigel and MSC (G4), lyophilized bone and Matrigel(G5), lyophilized bone, MSC and Matrigel (G6) and MSC only (G7). After extraction of the left lower incisor, the socket receiving the implant according to each group and evaluated in seven days. The samples were collected for microscopic analysis, demineralized and non-demineralized, PCR, and they have been subjected to X-ray analysis, which was also held in pre-and postoperatively. Grossly, there was thickening of the mandibular branch of animals that received and accelerate growth of the incisor teeth remaining in the Matrigel animals that received cell therapy. Under microscopic analysis, we found that all groups that received the bone graft as lyophilized, regeneration time was lower, although the control group had a better organization in bone regeneration, and treatment with still resulted in a Matrigel exaggerated inflammatory response, since this is also confirmed in samples not demineralized. The periapical radiographs also showed that the groups were treated with lyophilized bone had a greater area of radiopacity, suggesting acceleration of the regeneration process. However, the PCR test failed to detect the presence of Y chromosome in female recipients of the donor of MSCs. The results suggest that the use of cell therapy reduces the duration and alveolar bone regeneration when combined with lyophilized bone, accelerates this process. However, Matrigel, there was increased thickness after seven days of applying of the mandibular alveolus in which it was applied, requiring longer evaluation to elucidate its clinical use.

As células-tronco mesenquimais derivados do tecido adiposo (ASC) apresentam potencial para uso em terapêuticas para reparação cardíaca e o modelo de suínos recapitula aspectos relevantes dos seres humanos. Nesta dissertação quisemos caracterizar ASC de porcos (pASC), após criopreservação e avaliar a responsividade destas células ao shear stress. Após descongelamento as pASC exibiram 90-95% de viabilidade, não apresentaram alterações morfológicas e nem na expressão de marcadores de superfície (CD29+ 99,74%±0,10; CD90+ 97,84%±1,32; CD44+ 99,39%±0,19, CD31- 1,75%±0,21; média±EPM, n=3). O tempo de dobramento médio foi de 63,51±16,46 horas (média±DP) e o dobramento populacional cumulativo aumentou constantemente até a passagem 10, com pequeno e gradual aumento na senescência (P5 3,25%±0,26 e P10 9,6%±0,29 SA-?-Gal). Além disso, as pASC responderam, in vitro, ao tratamento para diferenciação em adipócitos e osteócitos. Já a exposição ao SS (15 dyn/cm² por 48 hs) não induziu a expressão de marcadores endoteliais (CD31, VE-caderina e FLK-1), mas resultou no acúmulo de VEGF induzido por NO (15 dyn/cm² por 96 hs). Interessantemente, o SS induziu a fosforilação de ERK e AKT e a liberação de NO independente da magnitude do SS (1-30 dyn/cm², por 30 min). No entanto, longos períodos de estímulo (24-48 hs) e diferentes intensidades de shear stress induziram desigualmente a liberação de NO e VEGF (5 dyn/cm² maior do que 10 ou 15 dyn/cm²). Tomados em conjunto, nossos dados promovem evidências de que a viabilidade, morfologia, cinética de crescimento e resposta a estímulos químicos ou físicos de pASC não foram influenciados pela criopreservação. Além disso, a magnitude de SS aplicada a essas células afetou a liberação de NO e VEGF somente após longos períodos de exposição a esse estímulo / Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ASC) offer potential regenerative therapeutic application for cardiac repair and the porcine model recapitulates key aspects relevant to humans. In this dissertation we wanted to establish the culture characteristics of pig ASC (pASC), especially after long-term cryopreservation and the effect of shear-stress (SS)-induced phenotypes. Upon thawing, pASC displayed 90-95% viability and no changes in morphological characteristics or in the expression of surface markers (CD29+ 99.74%±0.10; CD90+ 97.84%±1.32; CD44+ 99.39%±0.19, CD31- 1.75%±0.21; mean±SEM, n=3). Mean population doubling time was 63.51±16.46 hours (mean±SD) and cumulative population doubling increased constantly until passage 10 with a small and gradual increase in senescence (P5 3.25%±0.26 and P10 9.6%±0.29 SA--Gal staining). In addition, pASC in vitro responded to adipogenic and osteogenic chemical cues, whereas SS exposure (15 dyn/cm² up to 48 hours) failed to induce endothelial cell (EC) markers (CD31, VE-cadherin and FLK-1), but resulted in nitric oxide (NO)-induced VEGF accumulation (15 dyn/cm² up to 96 hours). Interestingly, SS-induced phosphorylation of ERK and AKT and the release of NO were independent of the magnitude of the stimulus (1-30 dyn/cm², up to 30minutes). In contrast, long term (24-48 hours) SS-induced NO and VEGF release under 5 dyn/cm² were higher than 10 or 15 dyn/cm2. Altogether, we provided evidence that pASC cell viability, morphology, growth characteristics and capacity to respond to chemical or physical cues were not influenced by cryopreservation. Moreover, the magnitude of the SS affected the NO and VEGF release in pASC only during long-term exposure to SS