Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Objetivos: este trabalho objetivou estudar a expressão gênica da família das interleucinas-1 em células células-tronco embrionárias indiferenciadas de camundongos e avaliar se ela se altera após a diferenciação celular. Métodos: Pesquisou-se a expressão gênica dessas substâncias em células-tronco (CT) indiferenciadas e durante a diferenciação celular em cardiomiócitos de camundongos. Colônias na 5a , 10a , 15a , 20a e 25a passagens em meios de cultivo foram removidas para a pesquisa de RT-PCR utilizando-se o kit SuperScript™ III CellsDirect cDNA Synthesis System. A amplificação do DNAc através do PCR foi realizada com a enzima Platinum® Taq DNA Polymerase. Foram utilizados os primers da interleucina-1β (IL- 1F2), antagonista do receptor de IL-1 (IL-1F3) e receptor tipo 1 de IL-1 (IL-1RI). Para estudo da IL-1 em estado diferenciado, foram utilizados corpos embrionários de três e cinco dias de cultivo e cardiomiócitos derivados de CT. Resultados: todas as 45 colônias indiferenciadas de CT mostraram-se negativas para IL-1F2; uma entre 45 (2,2%) foi positiva para IL-1F3 e também para marcadores de ectoderma (FGF5) e endoderma (Gata6) primitivos; uma entre 45 (2,2%) foi positiva para IL-1RI e também para ectoderma e mesoderma. Nenhum dos quatro corpos embrionários estudados foram positivos para IL-1F2. Um deles foi positivo para IL-1F3 e dois positivos para IL-1RI. Todas as quatro biópsias de cardiomiócitos mostraram-se positivas para IL- 1F2 e também para IL-1F3. Duas delas foram positivas para IL-1RI. Pelo que se pôde observar, este é o primeiro estudo que descreve a expressão genética da família da IL-1 em colônias individuais de células-tronco embrionárias de camundongos. Conclusão: as células-tronco indiferenciadas de camundongos estudadas não produziram genes da família da IL-1. / Purpose: this work objectived to study the IL-1 family gene expression in undifferentiated mouse embryonic stem (ES) cells and during diferentiation into cardiomyocytes. Methods: Colonies at 5, 10, 15, 20 and 25th passages were taken to perform RT-PCR using SuperScript™ III CellsDirect cDNA Synthesis System. PCR amplification of cDNA was done with Platinum® Taq DNA Polymerase. We used Interleukin-1β (IL-1F2), IL-1 receptor antagonist (IL-1F3) and IL-1 receptor type I (IL-1RI) primers. Results: all 45 undifferentiated ES cells were negative for IL-1F2; one out of 45 (2,2%) was positive for IL-1F3 and also for primitive ectoderm (FGF5) and endoderm (Gata6) markers; one out of 45 (2,2%) was positive for IL-1RI and also for ectoderm and mesoderm. To further study IL-1 at a late stage of cell differentiation, we used embroyd bodies (EB) at day 3 and 5 and ES cell derived cardiomyocytes. None of four embroid bodies studied were positive for IL-1F2. One out of four EB was positive for IL-1F3 and two out of four EB were positive for IL- 1RI. Four out of 4 ES cells derived cardiomyocytes were positive for IL-1F2 and also for IL-1F3. Two out of 4 ES cells derived cardiomyocytes were positive for IL-1RI. Two out of 4 ES cells derived cardiomyocytes were positive for IL-1RI. To our knowledge this is the first time to describe an IL-1 family gene expression study in undifferentiated single mouse ES cells. Conclusion: undifferentiated mouse ES cells studied didn’t produce major components of IL-1 family. / CAPES: BEX 1475/03-7 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-04-26Bitstream added on 2014-06-13T20:42:44Z : No. of bitstreams: 1 000741947.pdf: 4654580 bytes, checksum: b05e20e66d52ef92df24a9907af04254 (MD5) / Na literatura, não há descrição de que células trofectodérmicas sejam adequadas para a agregação (sem utilizar a fusão ou a microinjeção) e forma cão de embrião quimérico. O presente trabalho buscou validar um modelo para gerar blastocistos quiméricos, pela agrega ção de tecido trofectodérmico, primeiramente validando-o em camundongos e posteriormente testando a sua eficácia na espécie bovina. Nesta, duas técnicas para a reconstrução de blastocistos foram investigadas, mediante a agregação de um fragmento de trofectoderme (TE) com a massa celular interna (MCI) ou com células tronco induzidas a pluripotência (iPS). Os embriões foram bissectados com lâmina, assistida por micromanipulador, exceto no Experimento 1 e 2 (embriões bovinos) em que a bissecação utilizou microlâmina, por em controlada manualmente. De acordo com o delineamento de cada experimento, os embriões, os fragmentos embrionários e/ou as células iPS, foram depositados em micropoços preenchidos com meio KSOMaa (camundongo) ou SOF (gado bovino). Após 24 horas, a taxa de agregação (TA) das estruturas nos micropoços foi avaliada morfologicamente, mediante a detecção de uma única e coesa massa celular ou pela re-expansão e reorganização do blastocisto. Na validação em camundongos, foram utilizados dois hemiblastocistos ou MCI e TE derivados de embriões produzidos in vivo das linhagens Swiss Webster e C57BL/6/EGFP. Três experimentos foram conduzidos para caracterizar: 1) a eficácia da agregação de embriões em estágios pós-compactação; 2) o efeito do aumento de fragmentos embrionários e a utilização de um agente aglutinante biológico (fitohemaglutinina) na agregação; e 3) a exequibilidade da reconstrução do blastocisto pela aproximação entre MCI e fragmento de TE. Na segunda parte do trabalho, foram utilizados embriões bovinos produzidos in vitro em 5 experimentos: 1) utilização de fitohemaglutinina... / There is no report in the literature that trophectoderm cells can be used for aggregation (except in combination with fusion or microinjection techniques) and develop aggregates into a chimeric embryo. We aimed to validate a model to generate chimeric blatocysts using the trophectodermic tissue for aggregation in mice and replicate the validated technique in bovine embryos. We tested two methods of reconstruction in order to aggregate a trophectoderm fragment with either the inner cell mass (ICM) or the induced pluripotent stem (iPS) cells. Embryos were bisected by a blade assisted by micromanipulator, except in experiment 1 and 2 (bovine embryos) in which embryos were bisected by a manually controlled microblade. According to each experimental design, embryos, embryonic fragments and/or iPS cells were deposited in microwells lled with KSOMaa (mice) or SOF (bovine cattle). After 24 h the aggregation rate (AR) was assessed morphologically by the detection of a single, cohesive cell mass or by a re-expanded and reorganized blastocyst. In mice we used two demi-blastocysts or ICM and TE derived from in vivo produced Swiss Webster and C57BL/6/EGFP embryos. Three approaches aimed to characterize: 1) the e ectiveness of aggregation in post-compaction embryos; 2) the e ect on aggregation of increasing embryonic fragments and the use of the cell agglutination agent, phytohemagglutinin-L; and 3) the feasibility of reconstructing blastocysts by culturing ICM and TE fragments in close contact. In the bovine experiment we used in vitro produced embryos in 5 approaches to assess: 1) the effect of phytohemagglutinin-L in the aggregation of post-compaction demi-embryos; 2) blastocyst reconstruction using manually sectioned structures (ICM and TE); 3) microinjection of TE fragments into morula; 4) blastocyst reconstruction using structures (ICM and TE) sectioned with micromanipulator; and 5) production of chimeric ...

Submitted by Rogério Moraes (rogerio3@oi.com.br) on 2011-12-27T12:36:16Z No. of bitstreams: 1 Dissertação MPPJ_FGV_Rogério Moraes_Versão Aprovada.pdf: 1783703 bytes, checksum: 16685ea0c9ba45a133320a39ecabe2fd (MD5) / Approved for entry into archive by Janete de Oliveira Feitosa (janete.feitosa@fgv.br) on 2011-12-30T11:39:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação MPPJ_FGV_Rogério Moraes_Versão Aprovada.pdf: 1783703 bytes, checksum: 16685ea0c9ba45a133320a39ecabe2fd (MD5) / Made available in DSpace on 2012-04-11T19:13:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação MPPJ_FGV_Rogério Moraes_Versão Aprovada.pdf: 1783703 bytes, checksum: 16685ea0c9ba45a133320a39ecabe2fd (MD5) Previous issue date: 2011-12-20 / The purpose of this dissertation is the examination of some of the many ethical and legal controversies involving the use of human embryonic stem cells for research and therapy. The use of such stem cells was approved by Law nº. 11.105 of 2005, known as the new Biosecurity Law, article 5 of which allowed only for research and therapy, the use of said cells obtained from human embryos from the in vitro fertilization process, not used in their procedure, met certain conditions. Once came into effect, the device has been cited by the Attorney General of the Direct Action of Unconstitutionality (ADI) nº. 3510, which generated extensive discussions within the multidisciplinary team. Despite the declaration of the constitutionality of that article, there are still many controversial legal and ethical. It is questionable, especially, the differences concerning the legal status of the embryo produced in vitro and surplus in the process of fertilization, as well as the adequacy of the constitutional principle of human dignity in this context. Are shown, though, questions relevant to the patenting of genetic material and, consequently, of embryonic stem cells. / A finalidade da presente dissertação será o exame de algumas das muitas polêmicas éticas e jurídicas que envolvem a utilização das células-tronco embrionárias humanas para fins de pesquisa e terapia. A utilização de tais células-tronco foi aprovada pela Lei n.º 11.105 de 2005, conhecida como a nova Lei de Biossegurança, cujo artigo 5º permitiu, apenas para fins de pesquisa e terapia, a utilização das citadas células obtidas de embriões humanos provenientes do processo de fertilização in vitro, não utilizados no respectivo procedimento, atendidas certas condições. Assim que entrou em vigor, o citado dispositivo sofreu por parte do Procurador Geral da República a Ação Direta de Inconstitucionalidade (ADI) nº 3510, que gerou amplos debates de âmbito multidisciplinar. Apesar da declaração de constitucionalidade do referido artigo, ainda são muitas as polêmicas de ordem jurídica e ética. Questiona-se, principalmente, as divergências existentes acerca da natureza jurídica do embrião, produzido in vitro e excedente nos processos de fertilização, bem como a adequação do princípio constitucional da Dignidade Humana neste contexto. São demonstradas, ainda, questões pertinentes ao patenteamento de material genético e, consequentemente, das células-tronco embrionárias.

Células-tronco embrionárias (CTE) são importantes para estudos de desenvolvimento embrionário, diferenciação e manipulação genética. Além disso, essas células podem ser utilizadas na terapia celular e organogênese in vitro. Na pesquisa sobre terapia celular a partir de CTE oriundas de embriões humanos, considerações éticas, morais e religiosas têm sido feitas por pesquisadores e leigos. Portanto, um modelo animal como o suíno (Sus scrofa) será bastante válido por transpor tais barreiras, visto que o suíno possui parâmetros fisiológicos semelhantes aos humanos. Apesar do alto potencial biomédico das CTE, existem dificuldades na manutenção da pluripotência in vitro dessas células em suínos. Portanto, estudos que visam elucidar os mecanismos de manutenção da pluripotência de CTE in vitro são necessários para viabilizar o cultivo dessas células. Os objetivos do presente estudo foram (1) isolar células-tronco embrionárias suínas a partir de blastocistos produzidos in vitro e in vivo; (2) comparar dois sistemas de cultivo in vitro das massas celulares internas (MCI) isoladas, MEF ou Matrigel e (3) identificar e comparar a expressão dos fatores de transcrição Nanog, Sox2 e FoxD3 em CTE e blastocistos suínos produzidos in vitro e in vivo. Assim, blastocistos suínos foram produzidos in vitro a partir da maturação e fecundação in vitro de oócitos de ovários obtidos em matadouro. Os embriões foram cultivados in vitro por 7 dias, até atingirem o estágio de blastocisto. Blastocistos suínos também foram produzidos in vivo, através de superovulação seguida de inseminação artificial de marrãs com 150 dias de idade. Para a colheita dos embriões, foi realizada lavagem dos cornos uterinos post-mortem cinco dias após a ovulação. Tanto blastocistos produzidos in vitro quanto os produzidos in vivo foram submetidos à imunocirurgia para isolamento da MCI. Brevemente, a zona pelúcida foi digerida com solução de pronase e os embriões incubados com soro de coelho anti-suíno para remoção das células do trofoectoderma e soro complemento de cobaia. A MCI resultante foi cultivada em meio para células-tronco (GMEM acrescido de 15% SFB, 0,1 mM ß-mercaptoetanol, 1% aminoácidos não essenciais e 4 ng/mL de bFGF) sobre monocamada de fibroblastos fetais murinos (MEF) inativados por radiação ou sobre Matrigel. Não foi observada diferença entre os dois sistemas de cultivo in vitro (MEF e Matrigel) na adesão das MCI isoladas. Também não foi verificada diferença entre os grupos de blastocistos, produzidos in vitro e in vitro, nas taxas de adesão das MCI cultivadas. Contudo, nenhuma colônia de CTE suínas foi obtida. A análise da expressão gênica em blastocistos produzidos in vitro e in vitro demonstrou que os genes Nanog e Sox2 são menos expressos em blastocistos produzidos in vitro. Contudo, a expressão do gene FoxD3, demonstrada pela primeira vez em suínos no presente trabalho, se mostrou semelhante entre os dois grupos de embriões. Visto que nenhuma linhagem de CTE legítima foi isolada em suínos até o momento, sugere-se que esta espécie possua requerimentos diferentes dos já conhecidos para as espécies murina e humana. Portanto, novos estudos são necessários para o estabelecimento de protocolos mais efetivos para o isolamento de CTE de suínos. / Embryonic stem cells (ESC) represent a useful tool to study embryonic development, cell differentiation and genetic manipulation. Moreover, these cells can be applied in cell-based therapies and in vitro organogenesis. The research conducted with human ESC has generated many ethical, moral and religious considerations by scientists and laymen alike. Therefore, an animal model like the pig (Sus scrofa) is valuable by overcoming such hurdles, since this species holds physiologic parameters similar to humans. In spite of the high biomedical potential of ESC, many difficulties have been faced to maintain these cells in a pluripotent state in vitro. For this reason, studies to elucidate the mechanisms of in vitro maintenance of undifferentiated ESC are needed to improve the culture of these cells. The objectives of this study were (1) to isolate ESC from in vitro and in vitro produced swine blastocysts, (2) to compare two in vitro culture conditions to maintain isolated inner cell masses (ICM), MEF or Matrigel and (3) to identify and to compare the expression of the pluripotency markers Nanog, Sox2 and FoxD3 at ESC and in vitro and in vitro produced swine blastocysts. In this manner, swine blastocysts were obtained by in vitro maturation and fertilization of oocytes from ovaries collected in abattoirs. Embryos were in vitro cultured for 7 days until blastocyst stage. In addition, in vitro produced blastocysts were obtained by superovulation followed by artificial insemination of gilts (150 days of age). Embryos were collected by post-mortem uterus flushing five days after ovulation. in vitro and in vitroproduced blastocysts were submitted to immunosurgery to isolate the ICM. Briefly, zona pellucida was digested with pronase solution and embryos were incubated with anti-swine rabbit serum to remove trophoectoderm cells and with guinea-pig complement serum. The resultant ICM was cultured in stem cells media (GMEM added by 15% SFB, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, 1% non essential amino acids and 4 ng/mL of bFGF) over monolayer of irradiated murine fetal fibroblasts (MEF) or Matrigel. No difference was observed between the in vitro culture conditions (MEF and Matrigel) on isolated ICM adhesion. In addition, no difference was verified between in vitro and in vitro produced blastocysts on adhesion of cultured ICM. However, no swine ESC was obtained. Gene expression analysis of in vitro and in vitro produced blastocysts showed that Nanog and Sox2 are less expressed in in vitro produced blastocysts. However, the expression of FoxD3, demonstrated in this study for the first time, was similar between groups. Since no ESC lineage was obtained in swine until now, we believe this species have different requirements compared to murine and human. Therefore, more studies are necessary to establish protocols to isolate porcine ESC.

O estabelecimento de cultivo de células-tronco embrionárias (ESC) ainda não foi realizado com sucesso. Verificação de marcadores de pluripotência e diferenciação nos três folhetos germinativos são necessárias para validação de uma linhagem celular pluripotente. O objetivo deste estudo foi estabelecer e caracterizar o cultivo de ESC suínas usando Matrigel e comparar a expressão dos marcadores de pluripotência Oct-4, CD9 e α6-integrina em embriões. Blastocistos in vitro ou in vivo foram submetidos à imunocirurgia para cultura da massa celular interna, fixados para imunocitoquímica ou extração de RNA total para RT-PCR. Nenhuma colônia de ESC foi obtida usando co-cultivo em fibroblastos embrionários murinos (MEF) ou em Matrigel. Expressão de Oct-4, CD9 e α6-integrina foi detectada por PCR. Os produtos de PCR de CD9 e α6-integrina tiveram suas sequências nucleotídicas determinadas e comparadas com bases de dados públicas. O produto de CD9 foi idêntico à seqüência do CD9 suíno e o produto de α66integrina foi similar à humana e eqüina. Reação de Imunocitoquímica revelou a presença de Oct-4 no citoplasma de células da massa celular interna e do trofoblasto. CD9 e α6-integrina foram observados preferencialmente em células do trofoblasto. Não foi possível comparar a expressão dos marcadores de pluripotência entre ESC e embriões em suínos. Porém, este estudo descreve pela primeira vez a expressão de CD9 e α6-integrina em blastocistos suínos, os quais podem não estar relacionados com células pluripotentes embrionárias suínas. / Establishment of embryonic stem cell (ESC) culture in pigs has not been achieved. Verification of pluripotency markers and differentiation in the three embryonic layers are necessary for validation of a pluripotent cell line. The objective of this study was to establish and characterize porcine ESC culture using Matrigel and compare the expression of pluripotency markers Oct-4, CD9 and α6-integrin with embryos. In vitro or in vivo porcine blastocysts were submitted to immunosurgery for culture of inner cell mass, fixation for immunocytochemistry or total RNA extraction for RT-PCR. No ESC colonies were obtained using co-culture on mouse embryonic fibroblasts (MEF) or on Matrigel. Expression of Oct-4, CD9 and α6-integrin was detected by PCR. CD9 and α6-integrin PCR products had their nucleotide sequence assessed and compared with public nucleotide database. CD9 product was identical to CD9 porcine sequences and α6-integrin product was similar to human and equine α6-integrin. Immunocytochemistry revealed Oct-4 expression in cytoplasm of the inner cell mass and trophoblast cells. CD9 and α6-integrin were observed preferentially on trophoblast cells. It was not possible to compare expression of pluripotency markers between porcine ESC and embryos. However, this study describes for the first time expression of CD9 and α6-integrin in porcine blastocysts, which may not be related to pluripotent porcine embryonic cells.

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Claudia Barbosa Fernandes / Banca: Flávia Karina Dlella / Resumo: Células tronco embrionárias (CTE) são caracterizadas pelas capacidades de auto-renovação e diferenciação. No entanto, os mecanismos moleculares que regulam estes dois processos são mal compreendidos. CTE de camundongos foram originalmente isoladas a partir da massa celular interna (MCI) de blastocistos produzidos in vitro e in vivo e mantidas em cultura sem perda da pluripotência, originando tecidos das três camadas germinativas. Há profundo interesse em conhecer os processos envolvidos na proliferação e diferenciação das células embrionárias contribuindo, no futuro, para engenharia de tecidos e clonagem terapêutica. Objetivos: Comparar o potencial gerador de CTE de embriões bovinos produzidos in vitro em meio contendo alta e baixa concentração de soro, assim como avaliar a manutenção da pluripotência das células em cultivo através da ação de dois fatores, a LIF e o bFGF, utilizados isoladamente ou em conjunto, no cultivo in vitro de CTEbov. Foram utilizados blastocistos bovinos com 9 dias de desenvolvimento in vitro para remoção da massa celular interna (MCI) e posterior cultivo das mesmas em placas tratadas com monocamada de fibroblastos bloqueados. As colônias celulares semelhantes a células-tronco foram analisadas através da identificação da expressão in sito dos fatores de indiferenciação Oct-4, Nanog, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1- 60, TRA-1-81. Os blastocistos bovinos com 9 dias de idade também foram submetidos à marcação imunocitoquímica. Adicionalmente foi avaliado o potencial de diferenciação in vitro das CTEbov para linhagens celulares de origem endodermal, mesodermal e ectodermal. Em média, 525 embriões de cada um dos dois grupos (2,5% e 10% de soro fetal bovino, respectivamente) foram selecionados para o isolamento da MCI. Foram utilizados 300 blastocistos iniciais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Embryonic stem cells (ESC) are characterized by their capacity for selfrenewal and differentiation. However, the molecular mechanisms which regulate these two processes are poorly understood. ESC of mice were originally isolated from the inner cell mass (ICM) of blastocysts in vitro and in vivo and maintained in culture without loss of pluripotency, yielding three germ layers of tissue. There is keen interest in learning about the processes involved in proliferation and differentiation of embryonic cells contribute in the future, tissue engineering and therapeutic cloning. To compare the potential generator ESC of bovine embryos produced in vitro in medium containing high and low concentrations of serum, as well as evaluating the maintenance of pluripotency of the cells in culture through the action of two factors, the LIF and bFGF, used singly or together, in vitro cultivation of ESCbov. We used bovine blastocysts to nine days of in vitro development to remove the inner cell mass (ICM) and further cultivation of the same plates treated with fibroblast monolayer blocked. The cell colonies similar to stem cells were analyzed by in situ identification of the expression of differentiation factors Oct-4, Nanog, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 . The bovine blastocysts with 9 days of age were also subjected to immunocytochemical labeling. Additionally it was evaluated the potential of differentiation in vitro of cell lines to ESCbov endodermal origin, mesodermal and ectodermal. The average 525 embryos from each of the two groups (2.5% and 10% fetal bovine serum, respectively) were selected for isolation of the ICM. Early blastocysts were used 300, 160 expanded blastocysts and 45 hatched blastocysts per group. However, only expanded blastocysts adhered to the monolayer of fibroblasts and developed into colonies similar to... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-12-04T12:19:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CocultivoEmbrioesBovinos.pdf: 1514173 bytes, checksum: 3a720fb9e7e5105e7d7ca80b17a04e2d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-12-04T12:56:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CocultivoEmbrioesBovinos.pdf: 1514173 bytes, checksum: 3a720fb9e7e5105e7d7ca80b17a04e2d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-04T12:56:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CocultivoEmbrioesBovinos.pdf: 1514173 bytes, checksum: 3a720fb9e7e5105e7d7ca80b17a04e2d (MD5) Previous issue date: 2014 / A produção in vitro de embriões (PIV) é uma biotecnologia utilizada para aumentar o potencial reprodutivo de animais geneticamente superiores, os embriões produzidos in vitro são de qualidade inferior aos produzidos in vivo, por isso técnicas tentam melhorar os índices de embriões produzidos in vitro. Uma técnica é o sistema de co-cultivo com células somáticas que removem metabólitos tóxicos e protegem contra o stress oxidativo. As células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (CTA) são células multipotentes que segregam fatores de crescimento e citocinas. As células-tronco foram utilizadas em co-cultivo in vitro de embriões bovinos em diferentes concentrações com o objetivo de melhorar o protocolo de PIVE. CTAs foram submetidas à diferenciação em três linhagens mesenquimais, e foi realizada a imunofenotipagem de marcadores específicos de membrana das CTMs. A taxa de clivagem foi avaliada no segundo dia após a fertilização e taxa de blastocistos no sétimo dia, quando foram armazenados para contagem do número total de células e expressão gênica. Os resultados foram analisados por ANOVA, Teste-t e pós-teste de Fisher, adotando um nível de significância de 5%. O tratamento do co-cultivo com CTAs influenciou significativamente a formação de blastocisto, o número total de células de embriões e a expressão gênica correlacionada a pluripotência e metabolismo de carboidratos. Estes resultados mostraram aumento da taxa de produção e qualidade dos embriões produzidos in vitro em co-cultivo com CTAs em relação ao co-cultivo com células da granulosa. Os resultados deste trabalho indicam também que a presença constante de CTAs em co-cultivo é superior ao condicionamento com CTAs. Os efeitos verificados das CTAs podem ocorrer através de fatores solúveis ou via exossomos secretados pelas CTAs. Estudos futuros são necessários para esclarecer a possível via causadora dos efeitos positivos verificados neste trabalho pelas CTAs em co-cultivo. / The in vitro embryo production (IVP) is a biotechnology used to increase the reproductive potential of genetically superior animals, embryos produced in vitro are inferior in quality when compared in vivo. Techniques trying improve the rates of in vitro produced embryos. One technique is the co-culture system using somatic cells that remove toxic metabolites and protect against oxidative stress. Mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (CTA) are multipotent cells that secrete growth factors and cytokines. The stem cells were used in in vitro co-culture of bovine embryos at different concentrations in order to improve the protocol PIVE. CTAs underwent differentiation into three mesenchymal lineages, and was performed immunophenotyping of specific membrane markers of MSCs. The cleavage rate was assessed on the second day after fertilization and blastocyst rate on the seventh day when they were stored for counting the total number of cells and gene expression. The results were analyzed by ANOVA, T-test and post-test of Fisher, adopting a significance level of 5%. Treatment of co-cultivation with CTAs significantly influenced the formation of the blastocyst, the total number of cells in embryos and correlated gene expression pluripotency and carbohydrate metabolism. These results showed increased production rate and quality of embryos produced in vitro co-culture with CTAs compared to co-culture with granulosa cells. These results also indicate that the constant presence of CTAs in co-culture is superior to conditioning with CTAs. Checked the effects of CTAs can occur through soluble factors or via exosomes secreted by CTAs. Future studies are needed to clarify the possible cause for positive effects observed in this work by the CTAs in co-cultivation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-13Bitstream added on 2014-06-13T20:29:35Z : No. of bitstreams: 1 guastali_md_me_botib.pdf: 527945 bytes, checksum: 8c4f9ed48c450ce2b601751b6f0633db (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Células tronco embrionárias (CTE) são caracterizadas pelas capacidades de auto-renovação e diferenciação. No entanto, os mecanismos moleculares que regulam estes dois processos são mal compreendidos. CTE de camundongos foram originalmente isoladas a partir da massa celular interna (MCI) de blastocistos produzidos in vitro e in vivo e mantidas em cultura sem perda da pluripotência, originando tecidos das três camadas germinativas. Há profundo interesse em conhecer os processos envolvidos na proliferação e diferenciação das células embrionárias contribuindo, no futuro, para engenharia de tecidos e clonagem terapêutica. Objetivos: Comparar o potencial gerador de CTE de embriões bovinos produzidos in vitro em meio contendo alta e baixa concentração de soro, assim como avaliar a manutenção da pluripotência das células em cultivo através da ação de dois fatores, a LIF e o bFGF, utilizados isoladamente ou em conjunto, no cultivo in vitro de CTEbov. Foram utilizados blastocistos bovinos com 9 dias de desenvolvimento in vitro para remoção da massa celular interna (MCI) e posterior cultivo das mesmas em placas tratadas com monocamada de fibroblastos bloqueados. As colônias celulares semelhantes a células-tronco foram analisadas através da identificação da expressão in sito dos fatores de indiferenciação Oct-4, Nanog, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1- 60, TRA-1-81. Os blastocistos bovinos com 9 dias de idade também foram submetidos à marcação imunocitoquímica. Adicionalmente foi avaliado o potencial de diferenciação in vitro das CTEbov para linhagens celulares de origem endodermal, mesodermal e ectodermal. Em média, 525 embriões de cada um dos dois grupos (2,5% e 10% de soro fetal bovino, respectivamente) foram selecionados para o isolamento da MCI. Foram utilizados 300 blastocistos iniciais... / Embryonic stem cells (ESC) are characterized by their capacity for selfrenewal and differentiation. However, the molecular mechanisms which regulate these two processes are poorly understood. ESC of mice were originally isolated from the inner cell mass (ICM) of blastocysts in vitro and in vivo and maintained in culture without loss of pluripotency, yielding three germ layers of tissue. There is keen interest in learning about the processes involved in proliferation and differentiation of embryonic cells contribute in the future, tissue engineering and therapeutic cloning. To compare the potential generator ESC of bovine embryos produced in vitro in medium containing high and low concentrations of serum, as well as evaluating the maintenance of pluripotency of the cells in culture through the action of two factors, the LIF and bFGF, used singly or together, in vitro cultivation of ESCbov. We used bovine blastocysts to nine days of in vitro development to remove the inner cell mass (ICM) and further cultivation of the same plates treated with fibroblast monolayer blocked. The cell colonies similar to stem cells were analyzed by in situ identification of the expression of differentiation factors Oct-4, Nanog, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 . The bovine blastocysts with 9 days of age were also subjected to immunocytochemical labeling. Additionally it was evaluated the potential of differentiation in vitro of cell lines to ESCbov endodermal origin, mesodermal and ectodermal. The average 525 embryos from each of the two groups (2.5% and 10% fetal bovine serum, respectively) were selected for isolation of the ICM. Early blastocysts were used 300, 160 expanded blastocysts and 45 hatched blastocysts per group. However, only expanded blastocysts adhered to the monolayer of fibroblasts and developed into colonies similar to... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-29Bitstream added on 2014-06-13T20:59:31Z : No. of bitstreams: 1 monteiro_ba_me_botfmvz.pdf: 1690076 bytes, checksum: 2290265393e1a80a119df41bc5967502 (MD5) / Células-tronco embrionárias (CTEs) são células pluripotentes derivadas da massa celular interna, obtidas de blastocistos pré-implantados. Devido à sua pluripotência podem se diferenciar nos derivados das três camadas germinativas, endoderma, ectoderma e mesoderma, tanto in vitro como in vivo. O objetivo deste trabalho foi isolar e cultivar células da MCI de blastocistos equinos frescos e refrigerados, e caracterizar o cultivo destas células por meio da expressão dos marcadores Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81. Para tal foram utilizadas 10 éguas, das quais foram obtidos 40 embriões, divididos em dois grupos, sendo o Grupo 1 de embriões frescos, totalizando 26 embriões, e o Grupo 2 de embriões refrigerados, totalizando 14 embriões. No grupo 1 de embriões frescos, 73,1% das MCIs aderiram à monocamada dois dias após o cultivo, 65,4% mantiveram-se aderidas 4 dias após o cultivo, 19,2% foram submetidas à primeira passagem e nenhuma foi submetida à segunda passagem. Já no Grupo 2 de embriões refrigerados, 85,7% das MCIs aderiram á monocamada 2 dias após o cultivo, 85,7% das células permaneceram aderidas à monocamada 4 dias após o cultivo, 21,4% foram submetidas à primeira passagem, e 7,1% à segunda passagem. As colônias de CTEs equinas obtidas de embriões frescos foram marcadas com os anticorpos Oct-4, SSSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81. Já as colônias de CTEs obtidas de embriões refrigerados foram marcadas com os anticorpos Oct-4, SSEA-1, SSEA-3 e SSEA-4. As células da MCI quando isoladas dos blastocistos equinos frescos e refrigerados, foram capazes de formar colônias semelhantes à colônias de CTEs. Quando cultivadas sobre monocamada de fibroblastos equinos e inativadas com Mitomicina C, apresentaram crescimento celular e foram capazes de formar colônias de CTEs... / Embryonic stem cells are pluripotent cells, derived from inner cell mass, obtained from pre-implanted blastocysts. Because of their pluripotency, they can differentiate into derivatives of three germ layers, endoderm, ectoderm and mesoderm, both in vitro as in vivo. The aim of this study was to isolate and culture inner cell mass (ICM) cells from fresh and cooled equine blastocysts and characterize stem cells culture obtained from fresh and cooled equine embryos, by the expression of pluripotency markers as Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81. For this, 10 mares were used, from which were obtained 40 embryos, divided into two different groups, Group 1 from fresh embryos, with a total of 26 embryos, and Group 2 from cooled embryos, with a total of 14 embryos. In Group 1 of fresh equine embryos, 73,1% of ICM adhered to monolayer two days after culture, 65,4% maintained adhered four days after culture, 19,2% were submitted to first passage and none were submitted to second passage. Whereas in the Group 2 of cooled embryos, 85,7% of ICM adhered to monolayer two days after culture, 85,7% maintained adhred to the monolayer 4 days after culture, 21,4% were submitted to first passage and 7,1% to second passage. The equine embryonic like-stem cells obtained from fresh embryos were stained with the antibodies Oct-4, SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81. While the embryonic like-stem cells obtained from cooled embryos were stained with the antibodies Oct-4, SSEA-1, SSEA-3 and SSEA-4. The ICM cells when isolated from fresh and cooled equine blastocysts were capable to form embryonic stem cells-like colonies. When they were cultured under an equine fibroblasts monolayer and inactivated with Mitomycin C, showed cellular development and were able to form colonies. Equine embryonic... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Cássia Maria Barroso Orlandi / Banca: Ian Martin / Resumo: Células-tronco embrionárias (CTEs) são células pluripotentes derivadas da massa celular interna, obtidas de blastocistos pré-implantados. Devido à sua pluripotência podem se diferenciar nos derivados das três camadas germinativas, endoderma, ectoderma e mesoderma, tanto in vitro como in vivo. O objetivo deste trabalho foi isolar e cultivar células da MCI de blastocistos equinos frescos e refrigerados, e caracterizar o cultivo destas células por meio da expressão dos marcadores Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81. Para tal foram utilizadas 10 éguas, das quais foram obtidos 40 embriões, divididos em dois grupos, sendo o Grupo 1 de embriões frescos, totalizando 26 embriões, e o Grupo 2 de embriões refrigerados, totalizando 14 embriões. No grupo 1 de embriões frescos, 73,1% das MCIs aderiram à monocamada dois dias após o cultivo, 65,4% mantiveram-se aderidas 4 dias após o cultivo, 19,2% foram submetidas à primeira passagem e nenhuma foi submetida à segunda passagem. Já no Grupo 2 de embriões refrigerados, 85,7% das MCIs aderiram á monocamada 2 dias após o cultivo, 85,7% das células permaneceram aderidas à monocamada 4 dias após o cultivo, 21,4% foram submetidas à primeira passagem, e 7,1% à segunda passagem. As colônias de CTEs equinas obtidas de embriões frescos foram marcadas com os anticorpos Oct-4, SSSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81. Já as colônias de CTEs obtidas de embriões refrigerados foram marcadas com os anticorpos Oct-4, SSEA-1, SSEA-3 e SSEA-4. As células da MCI quando isoladas dos blastocistos equinos frescos e refrigerados, foram capazes de formar colônias semelhantes à colônias de CTEs. Quando cultivadas sobre monocamada de fibroblastos equinos e inativadas com Mitomicina C, apresentaram crescimento celular e foram capazes de formar colônias de CTEs... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Embryonic stem cells are pluripotent cells, derived from inner cell mass, obtained from pre-implanted blastocysts. Because of their pluripotency, they can differentiate into derivatives of three germ layers, endoderm, ectoderm and mesoderm, both in vitro as in vivo. The aim of this study was to isolate and culture inner cell mass (ICM) cells from fresh and cooled equine blastocysts and characterize stem cells culture obtained from fresh and cooled equine embryos, by the expression of pluripotency markers as Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81. For this, 10 mares were used, from which were obtained 40 embryos, divided into two different groups, Group 1 from fresh embryos, with a total of 26 embryos, and Group 2 from cooled embryos, with a total of 14 embryos. In Group 1 of fresh equine embryos, 73,1% of ICM adhered to monolayer two days after culture, 65,4% maintained adhered four days after culture, 19,2% were submitted to first passage and none were submitted to second passage. Whereas in the Group 2 of cooled embryos, 85,7% of ICM adhered to monolayer two days after culture, 85,7% maintained adhred to the monolayer 4 days after culture, 21,4% were submitted to first passage and 7,1% to second passage. The equine embryonic like-stem cells obtained from fresh embryos were stained with the antibodies Oct-4, SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81. While the embryonic like-stem cells obtained from cooled embryos were stained with the antibodies Oct-4, SSEA-1, SSEA-3 and SSEA-4. The ICM cells when isolated from fresh and cooled equine blastocysts were capable to form embryonic stem cells-like colonies. When they were cultured under an equine fibroblasts monolayer and inactivated with Mitomycin C, showed cellular development and were able to form colonies. Equine embryonic... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre