La tuberculose (TB) est une maladie très répandue qui provoque la mort de plus d'un million de personnes dans le monde chaque année. Cela représente un véritable problème de santé publique qui nécessite le développement de nouveaux médicaments et traitements afin de mieux lutter contre cette maladie destructrice. Dans ce contexte, il est important de comprendre la relation entre l'agent étiologique, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) et le système immunitaire. Les mycobactéries sont recouvertes de structure glycolipidiques qui pourraient être reconnus par des récepteur spécifiques appelés lectine de type C. Ici, nous avons étudié le rôle de deux lectines récemment identifiées qui n'ont pas été étudié dans un contexte de TB, CL-LK et DCIR. Au cours des dernières années, de nouvelles lectines solubles ont été identifiées et parmi elles ; CL-K1 a été définie par un criblage de divers ligands glycosylés, comme étant un potentiel récepteur de motifs présents sur la paroi de Mtb. Dans le sang, CL-K1 est associé avec une autre lectine soluble du nom de CL-L1, formant un complexe du nom de CL-LK. Par des expériences in vitro, notamment via des approches biochimique et d'analyses cytométriques, nous avons pu confirmer que CL-LK peut se lier à Mtb et encore plus particulièrement à la coiffe mannose présent sur le lipoarabinomannane, un constituant majeur de la mycomembrane. Les souris déficientes en CL-K1, une sous unités de CL-LK, ne présentent pas d'altération particulière de susceptibilité à Mtb. Cependant, nous avons pu mettre en évidence que la quantité de CL-LK dans le sérum de patient atteint d'une TB active est réduite comparé aux patients contrôles, et que cela corrèle de manière inverse à la réponse immune induite par le pathogène. Ces résultats indiquent que CL-LK pourrait présenter un intérêt comme élément de futur diagnostics ou suivi de traitement. Dans une seconde partie de la thèse, nous nous sommes concentré sur la lectine DCIR dans la réponse immune envers l'agent étiologique de la TB. DCIR est exprimé dans les lésions pulmonaires de macaques infectés par Mtb à la fois durant les infections asymptomatiques et dans les infections conduisant à une TB active. In vitro, une analyse globale de l'expression génique couplée à des validations par RT-qPCR ont pu révéler que suite à une infection par Mtb, l'expression d'un grand nombre de gènes répondant à l'interféron (IFN) de type I est inhibée dans les cellules dendritiques issues de moelle osseuses de souris déficientes en DCIR comparées à celles issues de souris sauvages. Cette inhibition corrèle avec une phosphorylation excessive de SHP2 dans les cellules dépourvues de DCIR, suivies d'une déphosphorylation de STAT1, laquelle est impliquée dans la régulation de la réponse à l'IFN de type I. L' IFN de type I est connu comme pouvant inhiber la production d' IL-12 dans les cellules dendritiques, et en effet, nous avons pu démontrer que l'inhibition de la signalisation relative à l'IFN de type I dans les cellules dendritiques déficientes en DCIR est associée avec une augmentation de la production d'IL12p70 ainsi qu'à une plus grande capacité de ces cellules à stimuler la prolifération de lymphocytes Th1 producteur d'IFN?. Les souris déficientes en DCIR contrôlent mieux l'infection que les souris sauvages, ce qui corrèle également avec une plus grande production d'IL12p70, une plus forte réponse des lymphocytes Th1, ainsi qu'à une augmentation de l'inflammation et de l'infiltration cellulaire dans les poumons des souris déficientes. Cette inflammation excessive est caractérisée par une augmentation de production du TNF-a et de iNOS dans les poumons. En conclusion, nos résultats révèlent une nouvelle voie moléculaire par laquelle les lectines peuvent moduler l'équilibre entre l'inflammation induite par l'infection et le contrôle du pathogène par l'intermédiaire de la modulation de la signalisation relative à l'IFN de type I dans les cellules dendritiques. / Tuberculosis (TB) is a wide-spread disease which causes the death of more than one million of people around the world each year. This represents a really harmfull healthcare and new drugs and treatments are always in development to better fight this destructive illness. In this context, it is crucial to understand the relation between the etiological agent, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and the immune system. Mycobacteria are recovered by some glycolipid structure which could be recognized by specific receptor called C-Type Lectin. Here we investigated the role of two recently highlights C-type lectins which haven't been studied in a tuberculosis context, CL-LK (Collectin Liver Kidney) and DCIR (Dendritic Cell (DC) ImmunoReceptor). In the recent years, novel soluble lectins were identified and belong these; CL-K1 (Collectin Kidney 1) was identified by a glycan array as a potential receptor in the sugar complex recognition of M.tb. In blood, CL-K1 is linked with another soluble lectin called CL-L1 (Collectin Liver 1) and form a complex CL-LK molecule. With some in vitro experiment, notably with biochemistry approach and cytometer analysis, we were able to confirm that CL-LK can bind Mtb and more particularly the mannose residue presents on the Lipoarabinomannan, a major constituent of the mycomembrane. Mice deficient in CL-K1, one of the CL-LK subunits, do not display altered susceptibility to Mtb. However, we found that the amount of CL-LK in the serum of patients with active TB is reduced, compared to that in controls, and correlates inversely to the magnitude of the immune response to the pathogen. These findings indicate that CL-LK might be of interest for future diagnostic and treatment monitoring purposes. In a second part of this thesis, we have focused our interest on the C-Type lectin DCIR in immunity to the tuberculosis agent, Mtb. DCIR is expressed in pulmonary lesions in Mtb-infected non-human primates during both symptomless infection and active TB disease. In vitro, global gene expression profiling coupled to RT-qPCR validation revealed that upon Mtb infection, the expression of a number of interferon (IFN)-responsive genes was impaired in DCIR-deficient murine bone marrow-derived DCs, compared to in wild-type cells. This inhibition correlated with an excessive phosphorylation of Src homology 2 domain tyrosine phosphatase (SHP)2 in DCIR-KO cells, followed by a subsequent dephosphorylation of Signal transducer and activator of transcription1(STAT1) which is crucially involved in the regulation of the type I IFN.Type I IFNs are known to inhibit interleukin (IL)-12 production in DCs, and indeed, we found that impaired IFN signaling in DCIR-deficient DCs was associated with an increased production of IL-12p70 and an increased ability of Mtb-infected cells to stimulate IFN?-producing Th1 lymphocyte proliferation. DCIR-deficient mice controlled Mtb infection better than wild-type animals, which correlated with an increased production of IL-12p70, an increased proliferation of Th1 lymphocytes, and an increased inflammation and cell infiltration in the lungs of DCIR-KO animals. This excessive inflammation is characterized by an increased production of tumor necrosis factor alpha (TNFa) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the lungs. Taken together, our results reveal a novel pathway by which a C-Type lectin modulates the equilibrium between infection-driven inflammation and pathogen's control through sustaining type I IFN signaling in DCs.

DCL-1 (CD302) is a type I transmembrane C-type lectin receptor, which is expressed on monocytes, macrophages, granulocytes and dendritic cells. However, its extracellular domain lacks the amino acids motives essential for carbohydrate binding in the presence of calcium ions, suggesting that it does not have the classic binding capacity found in other C-type lectin receptors such as the mannose receptor. No exogenous or endogenous ligands have been identified yet, though. Due to internal colocalization with F-actin we can assume, that this unconventional lectin receptor plays a role not only in endocytosis and phagocytosis but also in the cell adhesion and migration. The receptor DCL-1 was first identified as a genetic fusion partner of human DEC-205 multilectin receptor in Hodgkin's lymphoma cell lines. The experimental part of this thesis deals with the characterization of disulfide bonds and data acquisition for validation of DCL-1 crystal structure. First the production and refolding conditions were optimized to obtain the highest amount of DCL-1 protein, precisely its extracellular domain. These optimal conditions were used to prepare the protein for in-gel digestion using specific endopeptidases in the presence of cystamine followed by LC-MS analysis. DCL-1 disulfide bonds were determined by comparing...

Lectinas consistem de um vasto grupo de proteínas de origem não-imunológica e de caráter não enzimático, que reconhecem carboidratos de modo específico e não-covalente. Além disso, essas proteínas participam de vários eventos fisiológicos e patológicos, com embriogenese, resposta imunológica, apoptose, diferenciação celular e câncer. Recentemente, foi purificada da peçonha da serpente Bothrops atrox uma lectina do tipo-C, ligante de lactose, com propriedades bioquímicas e funcionais semelhantes à de outras lectinas de serpentes do gênero, denominada Galatrox. O presente projeto teve como objetivos a investigação do envolvimento da Galatrox no processo inflamatório agudo através de experimentos in vivo e in vitro e a produção de anticorpos policlonais anti-Galatrox. A lectina isolada foi obtida através de dois processos cromatográficos, apresentando um valor final de recuperação protéica de 0,3% (mg) em relação ao conteúdo protéico da peçonha bruta. De modo interessante, a Galatrox conjugada ao fluorocromo FITC (8µg/mL) foi capaz de ligar-se a superfície de neutrófilos (91,47%±0,5650). Além disso, está proteína reconheceu a laminina imobilizada, e não a fibronectina, uma glicoproteína da matriz extracelular que contém sequencias de poli-N-acetillactosamina. Avaliando seu potencial inflamatório, Galatrox mostrou-se capaz de induzir a migração de neutrófilos humanos in vitro de forma dose-dependente, tendo máxima atividade quimiotática na concentração de 32µg/mL (41,57±3,42 neutrófilos por campo). Apesar da Galatrox induzir um discreto nível de burst oxidativo em neutrófilos humanos não primados, ela apresentou um efeito três vezes maior quando essas células foram primadas com fMLP. Esta lectina quando injetada na cavidade peritoneal de camundongos Balb/C provocou migração leucocitária, sendo que na dose (50g/cavidade) e no tempo (4 horas) ótimos ocorreu um influxo celular de 2,05x106±0,101 leucócitos/mL. Ainda, esse infiltrado celular mostrou-se, basicamentre, composto por neutrófilos. Avaliando o perfil de mediadores da resposta inflamatória nesse ensaio in vivo, nos lavados peritoneais foi indicada a liberação máxima de IL-1 e IL-6 após 4 horas de tratamento, mas não foram detectadas a presença de TNF- e óxido nitrico em qualquer tempo de resposta. Células de baços murinos tratados com Galatrox produziram as citocinas pró-inflamatórias TNF- e IFN- e não produziram IL-10 ou NO. A produção de anticorpos policlonais foi realizada por imunização de camundongos e purificação cromatografia de afinidade em colunas com Galatrox imobilizada. A monitoração por ELISA e Western blot comprovaram a produção de anticorpos da classe IgG anti-Galatrox reconhecedores da lectina em sua forma nativa e desnaturada além de suas formas monoméricas e diméricas. Em todos os ensaios biológicos que a Galatrox foi testada na presença da lactose (carboidrato ligante da Galatrox, 20 mM) ocorreram inibições significativas das atividades dessa lectina, indicando que o seu domínio de reconhecimento de carboidrato participa das funções dessa molécula. Com base nos resultados obtidos é possível sugerir que a Galatrox participe da resposta imune inata por mediar eventos biológicos da resposta inflamatória aguda. No entanto, a lectina mostrou-se como um moderado agente pró-inflamatória, quando relacionada à peçonha bruta tendo em vista a fisiopatologia inflamatória do envenenamento. O anticorpo anti-Galatrox poderá ser usado como uma importante ferramenta estudos moleculares e funcionais dessa lectina de serpente. / Lectins are proteins with no enzymatic activity and are able to bind specifically and non-covalently (reversible manner) to carbohydrates. In addition, these proteins are involved in several physiological and pathological events, as embryogenesis, immune response, cancer, and others. Galatrox, a lactose-binding protein, was purified from Bothrops atrox snake venom and partially characterized concerning its biochemical and functional properties. The present work aimed to investigate the involvement of Galatrox in the inflammatory process. In addition, was carry out the production of a polyclonal antibody against Galatrox. This lectin was purified by one chromatographic step with yield around 0.3% (w/w) of total protein from Bothrops atrox crude venom. Interestingly, Galatrox-FITC (8g/mL) binds on human neutrophil surface (91.47% ± 0.5650). Also, this lectin recognized laminin, but not fibronectin, a glycoprotein of the extracellular matrix that contains poly-N-acetyllactosamine sequences. Galatrox was able to induce human neutrophils migration in vitro in a dose-dependent manner, with maximum chemotactic activity at 32g/mL (41.57 ± 3.42 neutrophils per well). Galatrox is more efficient to induce oxidative burst on fMLP primed neutrophils rather than non-primed neutrophils. When injected into mouse peritoneal cavity, Galatrox induced dose and time-dependent leukocyte migration, with optimal effect at 50g/animal after 4 hours of the injection (2.05x106±0.101 leukocytes/mL). Galatrox also induced release of IL-1 and IL-6 up to 12 hours after injection in the peritoneal cavity. However, TNF- and NO were not detected. The treatment of splenocytes with Galatrox in vitro promotes the production of INF- and TNF-. The biological activities of Galatrox were inhibited by lactose (specific sugar, 20 mM), indicating that its recognition carbohydrate domain participates of its functions. The production of polyclonal antibody anti-Galatrox was performed by immunization of mice and purified by affinity chromatography using immobilized Galatrox resin. Gamma-globulins against Galatrox were able to recognize this lectin under native and reduced conditions, using ELISA and Western-blot, respectively. The antibody anti-Galatrox can be use as important tool to further molecular and functional characterization of this snake venom lectin. These results suggest that Galatrox is immunogenic and may participate in the acute inflammatory process, acting as a pro-inflammatory agent through its lectin property.

Les peptides antimicrobiens (PAMs) cationiques sont des molécules amphipatiques conservées chez une grande diversité d'espèces vivantes. Ils participent ainsi à la défense immunitaire de nombreux organismes incluant les bactéries, les insectes, les plantes et les vertébrés. En plus de leur activité microbicide directe dirigée contre un large spectre de pathogènes, la plupart des PAMs cationiques sont désormais connus pour exercer des fonctions immunomodulatrices sur les réponses innée et adaptative. Notre équipe a récemment découvert et isolé un nouveau PAM à partir du venin de la fourmi Tetramorium bicarinatum, nommé P17. Dans ce travail, nous avons étudié les propriétés immunomodulatrices du P17 sur la réponse immunitaire innée médiée par les macrophages. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à sa capacité à moduler la différenciation de macrophages dérivés de monocytes humains (h-MDM) ainsi que leurs fonctions fongicides associées vis-à-vis d'une levure opportuniste majeure Candida albicans (C. albicans). Nous avons ainsi pu mettre en évidence que le P17 oriente la différenciation des h-MDM vers un phénotype alternatif caractérisé par la surexpression des récepteurs lectine de type C (CLRs) tels que Dectine-1 et le récepteur mannose (MR). De manière intéressante, nous avons mis en évidence que la surexpression de ces deux récepteurs à la surface des h-MDM activés par le P17 nécessite la mobilisation de l'acide arachidonique et la production de leucotriène B4 (LTB4). Nous avons également démontré que ce métabolite de l'AA conduit à l'activation du récepteur nucléaire PPARƴ, facteur clé de l'activation alternative des macrophages et de l'expression des CLRs associée à ce phénotype. Au cours de ce travail, nous avons démontré que les h-MDM polarisés par le P17 présentent une meilleure capacité à éliminer C. albicans. En effet, ces h-MDM activés par le P17 ont une capacité de reconnaissance, par les CLRs Dectine-1 et MR, et de phagocytose de C. albicans augmentée. De plus, l'étude des mécanismes microbicides conduisant à l'élimination de C. albicans révèle que les h-MDM activés par le P17 produisent de fortes quantités d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et d'IL-1ß via l'inflammasome. Ainsi, ce travail met en évidence que l'induction de l'activité fongicide des h-MDM par le P17 est dépendante de l'axe LTB4/ PPARƴ/Dectine-1-MR. Nous avons finalement confirmé ces données in vivo sur un modèle de candidose gastro-intestinale induite chez des souris traitées par voie intra-péritonéale par P17 ou non. Les résultats obtenus ont révélé que les souris traitées par P17 étaient plus résistantes à l'infection gastro-intestinale à C. albicans. La diminution de la charge fongique au niveau du cæcum des souris traitées par le P17 est associée à une meilleure efficacité de leurs macrophages à phagocyter C. albicans, à produire des ROS et à tuer C. albicans. Ainsi, ces résultats identifient le P17 comme un activateur original des propriétés antifongiques des macrophages agissant en aval de la voie permettant l'induction de l'expression des CLRs via PPARƴ. Ces données révèlent pour la première fois l'implication d'un PAM dans le contrôle de la différenciation des macrophages et leurs fonctions microbicides. / Cationic antimicrobial peptides (AMPs) are evolutionary small and amphipatic conserved molecules which are involved in the immune defense of a wide range of organisms, including bacteria, insects, plants and vertebrates. Beside their direct microbicidal activity against pathogens, most of them are known to exert immunomodulatory functions on innate and adaptive immune cells. Here we evaluated the immunomodulatory properties of an original cationic AMP, named P17, discovered and isolated by our team from the ant Tetramorium bicarinatum venom. We have focused on its efficiency to modulate human monocyte-derived macrophages (h-MDM) differentiation and its capacity to provide them an antifungal activity against the main opportunistic yeast Candida albicans (C. albicans). We showed that P17 directed h-MDM polarization toward an alternative phenotype characterized by mannose (MR) and dectin-1 C-type lectin receptors (CLRs) upregulation. Interestingly, we demonstrated that this upregulation of MR and Dectin-1 in P17-treated h-MDM requires AA mobilization and leukotriene B4 (LTB4) synthesis, essential for PPAR activation. We also demonstrated that this AA metabolite led to the PPARƴ nuclear receptor activation which is a key factor of macrophages alternative activation and the associated CLRs expression. In this study, we observed that P17-activated h-MDM exhibited an improved capacity to eliminate C. albicans. Indeed, these P17-polarized macrophages displayed an increased ability to recognize and phacocyte yeasts. Furthermore, the study of microbicidal mechanisms leading to C. albicans clearance revealed that P17-activated h-MDM produced reactive oxygen species (ROS) and inflammasome-dependant IL-1ß in high amounts. These mechanisms induction in P17-polarized h-MDM was dependent on the LTB4/ PPARƴ/Dectin-1-MR axis. Finally, these data were supported by in vivo experiments demonstrating that P17-treated mice infected with C. albicans developed less severe gastrointestinal infection related to a higher efficiency of their macrophages to engulf C. albicans, to produce ROS and to kill yeasts. Altogether, these results identify P17 as an original activator of the fungicidal response of macrophages that acts downstream the pathway leading to CLRs expression through PPARƴ activation.

This work is centered on the study of the NKG2 C-type lectin-like receptors on NK and CD4+T cells. We provide evidence supporting that CD4+T cells specific for Human Cytomegalovirus (HCMV) may express different NK cell receptors, and demonstrate that the C-type lectin-like receptor NKG2D is expressed on cytotoxic CD4+T cells with an effector/memory phenotype, enhancing their TCR-dependent proliferation and cytokine production. A second part of the work is centered on the study of the CD94/NKG2 receptors on NK cells. We show that NKG2A can be induced on NKG2C+ NK cells upon activation with rIL-12 or when cocultured with HCMV-infected dendritic cells, and that NKG2A expression inhibits the response of NKG2C+NK clones against HLA-E-expressing targets, providing a potential regulatory feedback mechanism to control cell activation. Altogether, our results support that expression of NKG2 C-type lectin like receptors may be shaped during the course of viral infections, providing mechanisms to finely regulate both NK and CD4+T cell functions. / Aquesta tesi es centra en l'estudi dels receptors lectina de tipus C NKG2 en cèl·lules Natural Killer i T CD4+. Demostrem que les cèl·lules T CD4+ específiques pel Cytomegalovirus Humà poden expressar diferents receptors NK, i que el receptor lectina tipus C NKG2D s'expressa en cèl·lules citotòxiques i de memòria, potenciant la proliferació i secreció de citocines depenent del TCR. La segona part d'aquesta tesi es centra en l'estudi de l'expressió dels receptors CD94/NKG2 en cèl·lules NK. Mostrem com l'expressió de CD94/NKG2A s'indueix en cèl·lules CD94/NKG2C+ estimulades amb IL-12 o cultivades amb cèl·lules dendrítiques infectades pel Cytomegalovirus Humà, i que l'expressió de CD94/NKG2A inhibeix la resposta de clons NK CD94/NKG2C+ envers dianes HLA-E+, constituint un possible mecanisme de feedback negatiu per controlar l'activació cel·lular. En resum, els nostres resultats demostren que l'expressió dels receptors lectina tipus C NKG2 pot ser modificada durant les infeccions víriques consitutint un possible mecanisme per regular la resposta tant de cèl·lules NK com T CD4+.

Les composantes innée et acquise de l'immunité travaillent ensemble pour assurer une protection efficace de l'organisme. Les cellules dendritiques, cellules sentinelles de l’immunité capturent via des récepteurs de surface les agents pathogènes et les présentent aux lymphocytes T pour stimuler les réponses immunitaires adaptatives spécifiques. Une famille de ces récepteurs, nommée Récepteurs Lectines de type C (CLRs) ont un rôle important dans la reconnaissance de motifs oligosaccharides des pathogènes. Leurs fonctions sont parfois détournées par certains pathogènes à leur avantage et notamment le VIH. La reconnaissance du virus par DC-SIGN, une des CLRs, favorise la dissémination du virus. A l’inverse, la langerine, autre CLR, est considérée comme une barrière naturelle au VIH. Ainsi, DC-SIGN est devenue une cible thérapeutique prometteuse mais sa reconnaissance des ligands osidiques est largement partagée par la langerine.Ce travail vise à développer des antagonistes de DC-SIGN spécifiques et de hautes affinités permettant de rivaliser avec la présentation multivalente des glycosylations de gp120 du VIH avec DC-SIGN. Une approche rationnelle a été employée dans le développement de ligands glycomimétiques hautement sélectifs pour DC-SIGN à partir de l’étude du site de liaison des deux CLRs. Puis, des plates-formes de présentations de ces glycomimétiques, de valences et de géométries différentes, sont comparées par SPR. Les améliorations spectaculaires d'affinités parfois observées sont liées à différents mécanismes d’interactions multivalentes responsables d’un phénomène d’avidité.Sur une des architecture de présentation sélectionnée (RODs), un travail de caractérisation fine des mécanismes responsables de ce gain d’affinité et/ou d’avidité a été conduit par la combinaison de plusieurs techniques biophysiques (SPR, ITC, polarisation de fluorescence et AUC). L’influence de la topologie de cette structure sur les mécanismes d’interactions est ainsi mise en évidence. Par les travaux menés, plusieurs ligands multivalents ont montré des affinités sans précédent pour DC SIGN atteignant des affinités du nanomolaire et représentant les meilleurs inhibiteurs connus à ce jour.Associé au développement d’antagonistes multivalents, une CLR (DCIR) a été identifiée récemment comme impliquée dans la dissémination du VIH, comme DC¬SIGN. Dans une perspective future de développement de glycomimétique, des travaux ont été menés sur la caractérisation structurale et fonctionnelle de ce nouvel acteur dans la problématique VIH. / The innate and acquired immunity components work together to provide efficient protection of organisms. Dendritic cells, sentinel cells of the immunity, are able to capture pathogens through their receptors on the surface and they can present the antigens to lymphocytes T in order to stimulate specific adaptive immune responses. Among these receptors, there is a family named C-type lectin receptors (CLRs), which has an important role in the recognition of pathogenic oligosaccharide motifs. CLRs can be hijacked by many pathogens including HIV. DC-SIGN, one of the CLRs, interacts with the virus and promotes its dissemination. Unlike DC-SIGN, langerin, another CLR, has a protective role against the HIV infection. In this context, DC-SIGN became a promising therapeutic target but it shares ligand specificities with langerin.This work aims to develop highly specific antagonists against DC-SIGN in order to compete with the multivalent glycosylated gp120 protein of HIV. Using the study of the two lectins binding sites as starting point, a rational approach has been exploited to develop highly selective glycomimetics against DC SIGN. The SPR technique was used to investigate multivalent platforms with different valencies as well as ligand presentation in space. The amazing improvement of the affinity observed in some cases can be linked to different mechanisms of multivalent interactions, leading to an avidity phenomenon. On a selected scaffold (RODs), we characterized the different mechanisms responsible for the affinity and/or avidity gains, using a combination of different biophysical techniques (SPR, ITC, fluorescence polarization, AUC). In this work, we highlighted that the topology of this structure can influence the mechanisms of interactions. Overall, different multivalent ligands showed unique affinities for DC-SIGN, reaching the nanomolar affinity range, and they represent the best inhibitors to date.Finally, another CLR has been recently identified as one of the protein involved in the HIV infection as well as DC-SIGN. In a future perspective of glycomimetic development, structural and functional characterization has been done on this new actor involved in the HIV issue.

Lectinas consistem de um vasto grupo de proteínas de origem não-imunológica e de caráter não enzimático, que reconhecem carboidratos de modo específico e não-covalente. Além disso, essas proteínas participam de vários eventos fisiológicos e patológicos, com embriogenese, resposta imunológica, apoptose, diferenciação celular e câncer. Recentemente, foi purificada da peçonha da serpente Bothrops atrox uma lectina do tipo-C, ligante de lactose, com propriedades bioquímicas e funcionais semelhantes à de outras lectinas de serpentes do gênero, denominada Galatrox. O presente projeto teve como objetivos a investigação do envolvimento da Galatrox no processo inflamatório agudo através de experimentos in vivo e in vitro e a produção de anticorpos policlonais anti-Galatrox. A lectina isolada foi obtida através de dois processos cromatográficos, apresentando um valor final de recuperação protéica de 0,3% (mg) em relação ao conteúdo protéico da peçonha bruta. De modo interessante, a Galatrox conjugada ao fluorocromo FITC (8µg/mL) foi capaz de ligar-se a superfície de neutrófilos (91,47%±0,5650). Além disso, está proteína reconheceu a laminina imobilizada, e não a fibronectina, uma glicoproteína da matriz extracelular que contém sequencias de poli-N-acetillactosamina. Avaliando seu potencial inflamatório, Galatrox mostrou-se capaz de induzir a migração de neutrófilos humanos in vitro de forma dose-dependente, tendo máxima atividade quimiotática na concentração de 32µg/mL (41,57±3,42 neutrófilos por campo). Apesar da Galatrox induzir um discreto nível de burst oxidativo em neutrófilos humanos não primados, ela apresentou um efeito três vezes maior quando essas células foram primadas com fMLP. Esta lectina quando injetada na cavidade peritoneal de camundongos Balb/C provocou migração leucocitária, sendo que na dose (50g/cavidade) e no tempo (4 horas) ótimos ocorreu um influxo celular de 2,05x106±0,101 leucócitos/mL. Ainda, esse infiltrado celular mostrou-se, basicamentre, composto por neutrófilos. Avaliando o perfil de mediadores da resposta inflamatória nesse ensaio in vivo, nos lavados peritoneais foi indicada a liberação máxima de IL-1 e IL-6 após 4 horas de tratamento, mas não foram detectadas a presença de TNF- e óxido nitrico em qualquer tempo de resposta. Células de baços murinos tratados com Galatrox produziram as citocinas pró-inflamatórias TNF- e IFN- e não produziram IL-10 ou NO. A produção de anticorpos policlonais foi realizada por imunização de camundongos e purificação cromatografia de afinidade em colunas com Galatrox imobilizada. A monitoração por ELISA e Western blot comprovaram a produção de anticorpos da classe IgG anti-Galatrox reconhecedores da lectina em sua forma nativa e desnaturada além de suas formas monoméricas e diméricas. Em todos os ensaios biológicos que a Galatrox foi testada na presença da lactose (carboidrato ligante da Galatrox, 20 mM) ocorreram inibições significativas das atividades dessa lectina, indicando que o seu domínio de reconhecimento de carboidrato participa das funções dessa molécula. Com base nos resultados obtidos é possível sugerir que a Galatrox participe da resposta imune inata por mediar eventos biológicos da resposta inflamatória aguda. No entanto, a lectina mostrou-se como um moderado agente pró-inflamatória, quando relacionada à peçonha bruta tendo em vista a fisiopatologia inflamatória do envenenamento. O anticorpo anti-Galatrox poderá ser usado como uma importante ferramenta estudos moleculares e funcionais dessa lectina de serpente. / Lectins are proteins with no enzymatic activity and are able to bind specifically and non-covalently (reversible manner) to carbohydrates. In addition, these proteins are involved in several physiological and pathological events, as embryogenesis, immune response, cancer, and others. Galatrox, a lactose-binding protein, was purified from Bothrops atrox snake venom and partially characterized concerning its biochemical and functional properties. The present work aimed to investigate the involvement of Galatrox in the inflammatory process. In addition, was carry out the production of a polyclonal antibody against Galatrox. This lectin was purified by one chromatographic step with yield around 0.3% (w/w) of total protein from Bothrops atrox crude venom. Interestingly, Galatrox-FITC (8g/mL) binds on human neutrophil surface (91.47% ± 0.5650). Also, this lectin recognized laminin, but not fibronectin, a glycoprotein of the extracellular matrix that contains poly-N-acetyllactosamine sequences. Galatrox was able to induce human neutrophils migration in vitro in a dose-dependent manner, with maximum chemotactic activity at 32g/mL (41.57 ± 3.42 neutrophils per well). Galatrox is more efficient to induce oxidative burst on fMLP primed neutrophils rather than non-primed neutrophils. When injected into mouse peritoneal cavity, Galatrox induced dose and time-dependent leukocyte migration, with optimal effect at 50g/animal after 4 hours of the injection (2.05x106±0.101 leukocytes/mL). Galatrox also induced release of IL-1 and IL-6 up to 12 hours after injection in the peritoneal cavity. However, TNF- and NO were not detected. The treatment of splenocytes with Galatrox in vitro promotes the production of INF- and TNF-. The biological activities of Galatrox were inhibited by lactose (specific sugar, 20 mM), indicating that its recognition carbohydrate domain participates of its functions. The production of polyclonal antibody anti-Galatrox was performed by immunization of mice and purified by affinity chromatography using immobilized Galatrox resin. Gamma-globulins against Galatrox were able to recognize this lectin under native and reduced conditions, using ELISA and Western-blot, respectively. The antibody anti-Galatrox can be use as important tool to further molecular and functional characterization of this snake venom lectin. These results suggest that Galatrox is immunogenic and may participate in the acute inflammatory process, acting as a pro-inflammatory agent through its lectin property.

Les lymphocytes T CD8+ jouent un rôle prépondérant dans le contrôle de l’infection par le VIH suggérant ainsi qu’un vaccin efficace doit induire une réponse cellulaire T CD8+ robuste et durable.En fournissant une source antigénique importante qui fait défaut chez les patients répondeurs aux poly-chimiothérapies antirétrovirales, la vaccination thérapeutique pourrait favoriser ce type de réponse cellulaire, non restaurée par les seuls traitements antirétroviraux. Les cellules dendritiques (DC) autologues, qu’elles soient chargées en virus inactivé, en peptides viraux ou en ARN messagers (ARNm) sont capables d’induire des réponses robustes des cellules T CD8+ contre les antigènes du VIH, faisant de bons candidats vaccins thérapeutiques.Dans ce projet, nous avons étudié l’efficacité d’une vaccination thérapeutique basée sur l’injection de DC autologues transfectées ex vivo avec des ARNm codant les protéines du VIH (projet initié en collaboration avec Guido Vanham, Institute of Tropical Medicine, Anvers). La composante antigénique du vaccin est fournie par les séquences virales endogènes du patient; ainsi nous espérons adapter la spécificité de la réponse immunitaire aux virus autologues. Nous travaillons avec le Macaque cynomolgus comme modèle animal d’infection par les virus d’immunodéficience (SIV), modèle pertinent dans l’approfondissement des connaissances en pathogénèse et en développement vaccinal, notamment pour tester l’innocuité et l’efficacité des vaccins basés sur l’utilisation des DC. La mise au point un système de culture de DC basé sur la prolifération puis la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques CD34+, qui nous a permis de générer in vitro des DC matures en nombre suffisant pour la vaccination (au moins 10.106).Nous avons caractérisé ces DC phénotypiquement, avec une attention particulière vis-à-vis de l’expression de lectines de type C et d’autres récepteurs DC-spécifiques. Nous avons mis en évidence que l’état d’activation des DC définit le niveau d’expression de ces molécules. Ces récepteurs membranaires sont impliqués dans la capture et la présentation des antigènes aux effecteurs, ainsi que dans l’orientation de la réponse immune. Le phénotype des DC générées in vitro a été comparé au phénotype de plusieurs population de cellules présentatrices d’antigène présentes in vivo chez le macaque.La transfection avec des ARNm par électroporation est un moyen sûr et efficace de charger les DC en antigènes. Nous avons étudié dans un premier temps l’immunogénicité du vaccin chez des macaques sains. Les résultats montrent qu’une réponse cellulaire de type Th1 (IFN-gamma et interleukine-2) spécifique à Gag est induite dès la première injection et peut être renforcée après les injections suivantes. Nous avons également mis en évidence l’induction de lymphocytes T CD8+ capables de sécréter en réponse à Gag plusieurs de ces cytokines, IFNg, IL2, TNFa, la chimiokine MIP1b, ou encore le marqueur de dégranulation cytotoxique CD107a. En revanche, aucune sécrétion de cytokine de type 2 ni de réponse anticorps spécifique de Gag n'a pu être mise en évidence.La seconde partie de notre projet a consisté en l’étude d’une stratégie de vaccination par ciblage des DC in vivo avec des protéines de fusion DC-spécifiques associées à des antigènes. Ce travail a été mené en collaboration avec le Baylor Insitute for Immunology Research (BIIR) à Dallas. Nous avons tout d’abord sélectionné les meilleurs clones d’Ac spécifiques de molécules humaines pour leur réactivité croisée avec les molécules du macaque cynomolgus. L’immunogénicité de protéines de fusion (dirigées contre LOX-1 et DC-ASGPR couplées à Gag du VIH ou HA1 de Influenza), a ensuite été évaluée in vivo chez le macaque. Ces travaux ont confirmé in vivo que l’induction de différents profils de réponses immunitaires Ag-spécifiques (Th1 et IL10) est possible par ciblage in vivo des DC avec des protéines de fusion dirigées contre différentes molécules (LOX-1 et DC-ASGPR). / Current treatments against HIV infection would benefit from the development of complementary immunotherapeutic strategies. Dendritic cells (DC) play a major role in the induction of immune responses. In this thesis, we examine the use of the DC in therapeutic vaccination. Ex vivo loading of DC with messenger RNA encoding viral proteins and in vivo loading of DC by targeting antigen to DC-specific endocytic receptors are two strategies evaluated in healthy macaque.

Aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) können sich neben allen anderen Zellen des Immunsystems auch dendritische Zellen (DCs) entwickeln. DCs spielen eine zentrale Rolle sowohl bei der Induktion von Immunantworten als auch bei der Aufrechterhaltung peripherer Toleranz. Eine Beeinflussung von DCs zur therapeutischen Nutzung wäre wünschenswert, erfordert aber ein noch tieferes Verständnis über deren Entwicklung im humanen Organismus. Das erste Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung potentieller DC-Vorläuferzellen in humanen lymphatischen Geweben. In Immunfluoreszenzaufnahmen von Thymus, Milz und Tonsillen mit Stammzell-charakterisierenden Markern konnten sowohl die in der Literatur als „Hämatopoetisches Stammzellkompartiment“ beschriebene Zellpopulation als auch weitere Zwischenstufen der Entwicklungsreihe der HSCs detektiert werden. Als Nächstes wurde untersucht, ob die im Gewebe identifizierten CD34+ Zellen in der in vitro Kultur zu DCs differenziert werden konnten. Hierzu wurden zunächst Protokolle etabliert und weiterentwickelt, in denen CD34+ Stammzellen des Nabelschnurbluts zu DCs gereift wurden. In einem anschließenden Schritt wurde das Protokoll mit den besten Ausbeuten an DCs auf Thymuszellen angewendet. Somit gelang es, aus Thymusstammzellen eine DCSubpopulation zu generieren, die aufgrund ihrer Markerexpression den Langerhanszellen ähnelt. Auf ihnen konnten außer Langerin auch andere C-Typ Lektinrezeptoren (Clec9a, DCIR und CD205) detektiert werden. Diese Zellen sind daher interessante Ziele für Untersuchungen zur Antigenbeladung von DCs und deren Präsentation an das adaptive Immunsystem. Zur effektiven Antigenbeladung von DCs werden Antikörper gegen endozytotisch wirksame Oberflächenmoleküle benötigt. Für deren Produktion wurden im weiteren Verlauf der Arbeit His-tragende und Ig-Fusionsproteine von Clec9a, Langerin, Dectin-1 und Dectin-2 produziert, um diese zur Immunisierung und Antikörperproduktion einzusetzen. In Zukunft können diese Antikörper zur Charakterisierung verschiedenster DC-Subpopulationen und außerdem zur Antigenbeladung von DCs herangezogen werden.

Dendritische Zellen (DCs) sind befähigt, als potenteste Antigen-präsentierende Zelle anti¬genspezifische Immunantworten zu initiieren und zu regulieren. Mittels in vivo Antigen¬beladung von spezifischen DC-Subpopulationen mit rekombinanten Antigen-gekoppelten Antikörpern gegen C-Typ-Lektinrezeptoren konnte im Mausmodell erfolgreich adaptive zelluläre und humorale Immunantworten hervorgerufen werden. Im Menschen kann dieser Ansatz therapeutisch noch nicht zum Einsatz kommen, da DC-Subpopulationen im humanen Gewebe momentan nicht ausreichend charakterisiert sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden humane Gewebe auf das Vorhandensein der im peripheren Blut beschriebenen DC-Subpopulationen (mDC-1 DCs: CD11c+BDCA1+, mDC-2 DCs: CD11clowBDCA3+ und pDCs: CD11c-CD123+BDCA2+) und die Expression von C-Typ-Lektinrezeptoren (DC-SIGN, MMR, Langerin, DCIR und DEC205) mittels Immun¬fluoreszenz untersucht. Anhand der vorge¬gebenen Marker im peripheren Blut konnten alle drei DC-Subpopulationen in der Milz, Thymus und Tonsillen detektiert werden. Zusätzlich konnte hier erstmalig eine vierte CD11c-CD123-BDCA2+ pDC-2 DC-Subpopulation in der Milz beschrieben werden, deren Funktion derzeit noch näher untersucht wird. Im Thymus konnte CD26 nach FACS-Analysen von Gordon Heidkamp als spezifischer Marker für mDC-2 DCs identifiziert und dies in der vorliegenden Arbeit auch durch Immun¬fluores¬zenzaufnahmen von Gewebeschnitten verifi¬ziert werden. CD26 stellt damit erstmalig einen Marker dar, der erfolgreich als alternativer Marker für BDCA3, welcher unspezifisch an Thrombomodulin bindet, zur Identifikation von mDC-2 DCs in der Immunfluoreszenz von Thymusproben eingesetzt werden könnte. Die getesteten Anti¬körper XCR-1 (monoklonal) und Clec9a (polyklonal) hingegen erschienen in der Immun¬fluoreszenz sowie in FACS-Analysen (Gordon Heidkamp) nicht geeignet. Weiterhin wurde die Expression ausgewählter C-Typ-Lektinrezeptoren (MMR, Langerin, DCIR, DC-SIGN und DEC205) im vorhandenen Gewebe näher betrachtet. Nach Auswertung der Immun¬fluoreszenzen konnte eine weit verbreitete Expression der untersuchten C-Typ-Lektin¬rezeptoren in humaner Milz und Thymus gefunden werden. Einzig hDCIR war auf vereinzelten Zellen exprimiert, und Langerin im Thymus nicht detektierbar. Um nicht verfügbare monoklonale Antikörper gegen C-Typ-Lektinrezeptoren zu produzieren und später Antigene an diese koppeln zu können, sollten lösliche Proteine einiger C-Typ-Lektinrezeptoren (humanes und murines Clec9a, Dectin-1 und -2, Langerin) produziert werden. Dabei gelang es bereits, lösliche Proteine der C-Typ-Lektinrezeptoren von humanem und murinem Dectin-1 zu generieren und diese zur weiteren Antikör¬per¬produktion einzusetzen.