京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第12920号 / 論医博第2095号 / 新制||医||1010(附属図書館) / 32130 / (主査)教授 髙橋 良輔, 教授 松田 文彦, 教授 瀬原 淳子 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Obwohl der Ca2+ permeable Ionenkanal TRPV2 in zahlreichen Immunzellen exprimiert wird, ist wenig über seine physiologische Funktion bekannt. Bisherige Studien verließen sich größtenteils auf die Anwendung von unspezifischen Modulatoren, TRPV2-defizienten Mäusen oder siRNA-vermittelten TRPV2-knockdown. Weder zelluläre Kompensationsmechanismen noch unspezifische Effekte können dabei ausgeschlossen werden. Daher haben wir eine etwa 5.500 Substanzen umfassende Substanzbibliothek auf niedermolekulare Modulatoren mit einer TRPV2-Aktivität untersucht. Mittels Fluoreszenz-basiertem Mediumdurchsatz-Screening und HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV2-Ionenkanäle exprimieren (HEKrTRPV2), konnten 3 strukturchemisch verwandte neuartige Inhibitoren ermittelt werden (IV2-1, IV2-2, IV2-3). Selektivitätsuntersuchen mit HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV1, Ratten-TRPV2, Maus TRPV3, Maus-TRPV4 oder Maus-TRPM3 exprimieren, zeigten, dass alle drei Substanzen eine TRPV2-Selektivität aufwiesen. Aufgrund des besseren IC50-Wertes wurde IV2-1 (IC50 = 6,3 ± 0.7 µM) als Leitstruktur ausgewählt und für weitere Untersuchungen verwendet. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Assays von HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen, welche TRPV2 endogen exprimieren, blockierte IV2-1 durch 2 APB oder 2 APB/Probenecid induzierte TRPV2-vermittelte Ca2+-Einströme. In elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen konnten 2-APB-verursachte Ein- und Auswärtsströme des TRPV2-Kanals in HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen durch IV2-1 reversibel blockiert werden. MTT Assays zur Ermittlung zytotoxischer Effekte von IV2-1 auf HEK293-, HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen ergaben keine Minderung der Zellviabilität bis zu einer Konzentration von 50 µM. Somit konnte IV2 1 als neuer, nicht toxischer TRPV2-Inhibitor validiert werden. In Zellen des angeborenen Immunsystems wie z.B. Makrophagen könnten TRPV2-vermittelte Ca2+-Signale wichtige Mechanismen wie Phagozytose und Migration beeinflussen. Um den physiologischen Einfluss von TRPV2 in primären Makrophagen zu untersuchen, wurden aus Stammzellen des Knochenmarks von Mäusen primäre Makrophagen (BMDM) differenziert. Als Bestätigung der funktionellen Expression von TRPV2-Kanälen in BMDM konnten in Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen mittels 2-APB Ca2+-Einströme ermittelt werden, welche durch Zugabe von IV2 1 blockiert wurden. Weiterhin wurde ein siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 in BMDM etabliert. Mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) konnte sowohl die Expression von TRPV2-mRNA als auch der knockdown um etwa 70 Prozent in BMDM beobachtet werden. Die Kombination 2 APB/Probenecid induzierte auch in moderaten Konzentrationen einen TRPV2-vermittelten Ca2+Einstrom in BMDM, ohne zytotoxische Effekte zu verursachen. Als nächstes sollte in BMDM der Einfluss der TRPV2-Aktivität auf die Phagozytose von Zymosan- und Staphylococcus aureus-Biopartikeln untersucht werden, welche mit einem pH-sensitiven Fluoreszenzindikator gekoppelt waren. Sowohl siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 als auch TRPV2-Inhibition durch IV2-1 oder Valdecoxib reduzierten die Phagozytoseaktivität der BMDM auf etwa 70 Prozent im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Diese Ergebnisse bestätigen eine Beteiligung von TRPV2 bei der Phagozytose. Anschließend wurden Transwell-Migrationsassays von BMDM in einem Gradienten aus Lipopolysacchariden (LPS) durchgeführt. Während die TRPV2-Inhibiton mit IV2 1, Valdecoxib oder ein TRPV2-knockdown die LPS-induzierte Migration von BMDM signifikant verringerte, steigerte die TRPV2-Aktivierung durch 2-APB/Probenecid die Anzahl migrierter BMDM im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen signifikant. Somit konnte ebenso eine TRPV2-Beteiligung bei der Migration von Makrophagen gezeigt werden. Da Phagozytose und Migration zielgerichtete Prozesse darstellen, sollten auch die Ca2+-Signale räumlich und zeitlich koordiniert auftreten. Solche lokal begrenzten, kurzen Ca2+-Fluktuationen können durch Ca2+-Mikrodomänen verursacht werden, welche der Aktivität einzelner oder weniger Kanäle entsprechen. Mittels TIRF-Mikroskopie und eines niederaffinen Ca2+-Indikators können hohe Ca2+-Fluktuationen in unmittelbarer Nähe zur Zellmembran selektiv detektiert und somit potenzielle durch TRPV2 generierte Ca2+ Mikrodomänen in Makrophagen untersucht werden. Nach der TRPV2-Aktivierung mit 2 APB/Probenecid konnten punktuelle, hohe Ca2+ Fluktuationen in BMDM ermittelt werden, welche nach Zugabe von IV2-1 inhibiert wurden. Unter physiologischeren Bedingungen wurden zudem basal aktive Ca2+ Mikrodomänen beobachtet, welche durch IV2 1 inhibiert wurden. Dementsprechend scheint TRPV2 in BMDM basal aktive Ca2+-Mikrodomänen ausbilden zu können. Bisher konnte nur die Kombination aus 2-APB und Probenecid in moderaten Konzentrationen genutzt werden, um TRPV2-Ionenkanäle ohne zytotoxische Effekte durch hohe Konzentrationen der Einzelsubstanzen zu aktivieren. Allerdings zeigt 2-APB keine Wirkung auf humane TRPV2 Kanäle, weshalb neue Möglichkeiten der TRPV2-Aktivierung essentiell sind. Um weitere potenzierende Effekte zu untersuchen, wurde Cannabidiol (CBD) als potentester TRPV2-Aktivator aus der Gruppe der Cannabinoide in Kombination mit Probenecid untersucht. In einer zweidimensionalen Analyse von CBD- und Probenecid-Verdünnungsreihen konnte eine potenzierende Wirkung der Kombination festgestellt werden, die sowohl humane als auch Ratten TRPV2-Kanäle superadditiv aktivierte. Mittels Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen sowie elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen von HEKrTRPV2- und HEKhuTRPV2-Zellen konnte dieser superadditive Effekt von CBD/Probenecid bestätigt werden. Die CBD/Probenecid-induzierte Aktivität humaner oder Ratten TRPV2-Kanäle konnte durch IV2-1 inhibiert werden, wohingegen Valdecoxib zwar Ratten-TRPV2 blockierte, jedoch humanen TRPV2 nicht vollständig inhibieren konnte. Mastzellen sind maßgeblich an der Freisetzung von allergischen und inflammatorischen Mediatoren beteiligt und stellen somit einen wichtigen Bestandteil des angeboren Immunsystems dar. Während die Ausschüttung von Leukotrienen, β-Hexosaminidase oder Histamin größtenteils IgE-vermittelt stattfindet, können davon unabhängig auch andere Signalkaskaden, wie z.B. durch MRGPRX2-vermittelt, die Degranulation von Mastzellen induzieren. Da Mastzellen ebenfalls TRPV2-Ionenkanäle exprimieren, könnte ein TRPV2-vermittelter Ca2+ Einstrom die Freisetzung von Mediatoren beeinflussen. Mit Hilfe der neuen TRPV2-Modulatoren und Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen wurde zunächst die endogene TRPV2-Expression in basophilen RBL-2H3-Zellen als alternatives Zellmodell zu Mastzellen bestätigt. Zudem konnten keine zytotoxischen Effekte bis zu Konzentrationen von 50 µM IV2-1 oder Valdecoxib sowie einer Kombination aus 12.5 µM CBD und 500 µM Probenecid festgestellt werden. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen konnte nach physiologischer Stimulation der Fcε-Rezeptoren ein Anstieg der intrazellulären Ca2+ Konzentration gemessen werden, der durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib nicht blockiert wurde. In Untersuchungen zur Freisetzung von β-Hexosaminidase steigerte die Kombination CBD/Probenecid die Mediatorausschüttung hingegen deutlich. Dieser Effekt konnte durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib inhibiert werden. Eine Kombination des TRPV2-vermittelten sowie des IgE-induzierten Stimulus führte zu einer additiv gesteigerten Freisetzung. Somit könnte TRPV2 unabhängig von der IgE-Signalkaskade eine wichtige physiologische Funktion bei der Degranulation von Mastzellen spielen. Daher wurden im nächsten Schritt primäre Mastzellen aus dem Knochenmark von Mäusen differenziert (BMMC) und die mRNA- sowie funktionelle Expression von TRPV2 durch qPCR und Fluoreszenz-basierte Ca2+-Assays bestätigt. Die verwendeten Modulatoren induzierten auch in BMMC in gleichen Konzentrationen wie in RBL 2H3-Zellen keine zytotoxischen Effekte. Die vorherigen Ergebnisse des Einflusses der TRPV2-Aktivität auf die Ausschüttung von β-Hexosaminidase konnten mit BMMC ebenso bestätigt werden. Mittels ELISA wurde zuletzt ein TRPV2-vermittelter Effekt auf die Histaminfreisetzung aus BMMC untersucht. Demnach steigerte die Kombination CBD/Probenecid die Histaminausschüttung deutlich, was durch TRPV2-Inhibition mit IV2 1 blockiert werden konnte. Auch hier hatte IV2-1 keinen Effekt auf die IgE-induzierte Histaminfreisetzung. Die simultane Stimulation der Fcε-Rezeptoren und der TRPV2-Kanäle resultierte in einer additiv gesteigerten Histaminausschüttung. Folglich scheint TRPV2-Aktivität die Freisetzung von Mediatoren wie Histamin oder β-Hexosaminidase unabhängig von der klassischen IgE-vermittelten Signalkaskade zu beeinflussen, was TRPV2 zu einer vielversprechenden Zielstruktur zur weiteren Erforschung im pathophysiologischen Kontext von entzündlichen und allergischen Reaktionen macht.

Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor (HGF/SF) stimulates migration of various cells and has been linked via Met tyrosine kinase signaling to transformation and the metastatic phenotype. HGF/SF-Met signaling also plays a role in malignancy. Migration of transformed MDCK-F cells depends on activation of a charybdotoxin (ChTX)-sensitive, volume-activated membrane K+ current. Patch-clamp electrophysiology and transwell migration assays were used to study the effects of HGF/SF on membrane K+ currents and cell migration in MDCK II cells. HGF/SF activated membrane K+ currents that increased over 24 hr, and these could be modulated by altering intracellular free calcium concentration [Ca2+]i. HGF/SF also significantly increased MDCK II cell migration. Specific Ca2+-activated K+ channel blockers, ChTX, iberiotoxin (IbTX), stichodactyla toxin (Stk) and clotrimazole (CLT) inhibited HGF/SF stimulation of membrane K+ currents and cell migration. This suggests that the activation of Ca2+-activated K+ channels is necessary for HGF/SF stimulation of MDCK II cell migration. Furthermore, HGF/SF induced ERK phosphorylation, and addition of the MEK inhibitor PD98059 inhibited ERK phosphorylation, as well as HGF/SF stimulation of Ca2+-activated K+ currents and cell migration in MDCK II cells. Taken together, HGF/SF induces phosphorylation of ERK, which plays a role in HGF/SF activation of Ca2+-activated K+ channels and enhancing cell migration in MDCK II cells.

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La potentialisation synaptique dans les neurones d'hippocampes repose sur l'activation du récepteur NMDA (NMDAR) et l'influx de Ca²⁺. Des changements dans le Ca²⁺ cytosolique sont détectés par des effecteurs tels que la calpaïne et la protéine kinase II Ca²⁺/calmoduline-dépendante (CaMKII), transformant ces informations en signaux qui induisent une potentialisation synaptique. Une fois activée par l'influx de Ca²⁺, la calpaïne clive de nombreuses protéines cytosoliques, récepteurs et protéines d'échafaudage, remodelant ainsi la structure synaptique, ainsi que l'activité et/ou la dynamique de nombreuses protéines. Le rôle de la calpaïne au cours du processus de plasticité synaptique a été documenté, mais le mécanisme moléculaire est loin d'être clair. Dans cette étude, nous avons examiné le lien possible entre la calpaïne et CaMKII dans la médiation de la potentialisation à long terme (LTP). Nous avons utilisé des inhibiteurs pharmacologiques de la calpaïne pour interférer avec son activation lors de la potentialisation synaptique induite chimiquement dans des cultures dissociées d'hippocampe de rat. Nous avons d'abord confirmé que l'activité de la calpaïne est essentielle pour l'induction de la LTP dans les cultures neuronales dissociées. Nous montrons que l'activité de la calpaïne est essentielle pour de nombreux processus moléculaires importants pour la LTP. L'inhibition de l'activité de la calpaïne a bloqué la phosphorylation de ERK et l'insertion des récepteurs synaptiques AMPA; deux processus régulés par CaMKII impliqués dans la potentialisation synaptique. De plus, nous montrons que la calpaïne est essentielle pour l'autophosphorylation de CaMKII en utilisant un anticorps contre pCaMKII (Thr286). En mesurant le temps de vie par fluorescence (FLIM) avec un capteur basé sur le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) (Camui) de l'activation de CaMKII, nous montrons que l'inhibition de la calpaïne empêche le changement dépendant de l'activité de la conformation de l'holoenzyme CaMKII et donc l'activation de la kinase. Nous avons aussi utilisé l'imagerie time-lapse et avons découvert que la translocation CaMKII post-synaptique dépendante de l'activité est diminuée par les inhibiteurs de la calpaïne. De plus, nous avons mesuré les taux de diffusion de CaMKII par SPT-PALM en utilisant CaMKII-meos2 et les résultats indiquent que l'inhibition de la calpaïne empêche la diminution dépendante de l'activité de la mobilité de l'holoenzyme. Nos résultats montrent clairement que les inhibiteurs de la calpaïne affectent la dynamique de CaMKII. Cela suggère que la calpaïne affecte directement CaMKII ou agit en amont de CaMKII. En effectuant des expériences dans des cellules HEK qui n'ont pas de CaMKII endogène, nous avons démontré que la calpaïne n'affecte pas directement CaMKII. Nous avons émis l'hypothèse que la calpaïne joue un rôle dans le processus de plasticité en amont de CaMKII. Nous avons étudié l'influx Ca²⁺ dépendant de l'activité en utilisant l'imagerie GCaMP6 et nos résultats indiquent que l'activité de la calpaïne est essentielle pour cette l'augmentation de Ca²⁺. En disséquant davantage la voie de signalisation, utilisant différents protocoles de stimulation (dépolarisation synaptique ou globale), nous montrons que la calpaïne affecte l'afflux de Ca²⁺ dépendant de NMDA et non l'influx de Ca²⁺ dépendant de la dépolarisation. Ainsi, notre étude montre que la calpaïne joue un rôle essentiel dans la LTP d'une manière dépendante du NMDAR et que l'inhibition de la calpaïne interfère dans les premières étapes de la signalisation médiée par le Ca²⁺ conduisant à l'induction du LTP. En discutant de ces résultats, nous fournissons des résultats préliminaires qui peuvent nous éclairer au niveau de l'impact de l'inhibition pharmacologique de la calpaïne sur la fonction des récepteurs NMDA. / Synaptic potentiation in hippocampal neurons relies on NMDA receptor (NMDAR) activation and Ca²⁺ influx. Changes in cytosolic Ca²⁺ are detected by effectors such as calpain and Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), transforming this information into signals inducing synaptic potentiation. Once activated by Ca²⁺ influx, calpain cleaves many cytosolic proteins, receptors, and scaffolding proteins, thereby remodeling the synaptic structure, as well as the activity and/or dynamics of many proteins. The role of calpain during the synaptic plasticity process has been documented, but the molecular mechanism is far from clear. In this study, we examined the possible link between calpain and CaMKII in the mediation of Long Term Potentiation (LTP). We used pharmacological inhibitors of calpain to interfere with its activation during chemically induced synaptic potentiation in rat hippocampal dissociated cultures. We first confirmed that calpain activity is essential for LTP induction in dissociated neuronal cultures. We show that calpain activity is essential for many molecular processes important for LTP. Inhibition of calpain activity blocked ERK phosphorylation and insertion of synaptic AMPA receptors - two CaMKII-regulated processes involved in synaptic potentiation. Further, we show that calpain is essential for CaMKII autophosphorylation by using an antibody against pCaMKII (Thr286). By performing Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based sensor (Camui) of CaMKII activation, we show that calpain inhibition prevents activity-dependent change in the conformation of the CaMKII holoenzyme and thus the activation of the kinase. We further used time-lapse imaging and found that activity-dependent post-synaptic CaMKII translocation is decreased by calpain inhibitors. Furthermore, we measured diffusion rates of CaMKII by SPT-PALM using CaMKII-meos2 and the results indicate that calpain inhibition prevents the activity-dependent decrease in the mobility of the holoenzyme. Our results clearly show that calpain inhibitors affect CaMKII dynamics. This suggests that either calpain affects CaMKII directly or is upstream to CaMKII. By performing experiments in HEK cells that do not have endogenous CaMKII, we demonstrated that calpain does not affect CaMKII directly. We hypothesized that calpain plays a role in the plasticity process at an upstream level to CaMKII. We investigated activity-dependent Ca²⁺ influx using GCaMP6 imaging and our results indicate that calpain activity is essential for this increase in Ca²⁺. Further dissecting the pathway, using different stimulation protocols (synaptic or global depolarisation), we show that calpain affects NMDA-dependent Ca²⁺ influx and not the depolarisation dependent Ca²⁺ influx. Thus, our study shows that calpain plays an essential role in LTP in an NMDAR dependent manner and that inhibiting calpain interferes in the early steps of Ca²⁺- mediated signaling leading to LTP induction. In discussing these results, we provide preliminary results that may shed light on the impact of pharmacological inhibition of calpain on NMDA receptor function.

La plasticité synaptique, qui permet l'apprentissage et la mémoire, s'exprime par des changements dans la force de transmission de signal passant par les neurotransmetteurs. La modulation de la quantité de récepteurs au glutamate de type « AMPA » disponibles dans le compartiment post-synaptique est un des moyens que possède le neurone pyramidal de modifier sa réponse à un stimulus. Les mécanismes régissant ce mécanisme de plasticité ne sont pas très bien compris, mais nous savons toutefois que l'enzyme CaMKII joue un rôle important à plusieurs niveaux dans le processus. Par exemple, la CaMKII joue un rôle dans l'immobilisation des récepteurs AMPA dans les synapses de neurones de l'hippocampe en culture, suite à un protocole (appelé « cLTP) qui mène à la Potentialisation à Long Terme de ces synapses et à l'augmentation de leur contenu en récepteurs AMPA. J'ai testé l'hypothèse que la CaMKII contribue également à augmenter le niveau d'expression membranaire des récepteurs AMPA dans les neurones. Pour ce faire, j'ai procédé à des mesures d'imagerie optique de la livraison des récepteurs AMPA à la membrane plasmique par un processus d'exocytose des réserves intracellulaires du récepteur. Cette mesure exploite la microscopie vidéo à fluorescence ainsi que le transfert de gène d'une protéine fluorescente couplée au récepteur, dont la fluorescence n'apparait que lorsque les récepteurs arrivent à la surface. En bloquant l'activité de la CaMKII avec des outils pharmacologiques ou génétiques, j'ai observé une diminution importante dans la fréquence d'exocytose des récepteurs AMPA, ce qui confirme l'hypothèse qu'elle joue un rôle important dans ce processus. Toutefois, lors d'une stimulation de type cLTP, je n'ai pas observé d'augmentation dans la fréquence d'apparition des événements d'exocytose des récepteurs. Ces résultats indiquent que malgré le rôle de la CaMKII dans l'augmentation de l'exocytose des récepteurs AMPA, ces derniers ne sont pas davantage livrés à la membrane durant un protocole de cLTP, suggérant que seule l'immobilisation des récepteurs joue un rôle prépondérant dans l'augmentation des récepteurs AMPA à la synapse durant la LTP. Il sera cependant important d'étudier davantage pourquoi la CaMKII promeut l'exocytose des récepteurs AMPA, sans que ce processus soit augmenté durant la LTP.

Le récepteur AMPA (rAMPA) est un sous-type de récepteur au glutamate responsable de la majorité de la transmission synaptique excitatrice rapide dans le système nerveux central. L'apport de nouveaux récepteurs à la membrane par exocytose et la redistribution des rAMPA aux sites postsynaptiques ont été proposés comme des mécanismes de potentialisation à long terme (LTP) de la transmission synaptique, un modèle cellulaire impliqué dans l'apprentissage et la mémoire. Les preuves directes qui soutiennent ces hypothèses sont manquantes et les mécanismes moléculaires qui régulent l'apport des rAMPA à la membrane et le traffic aux synapses sont peu connus. Afin d'étudier les mécanismes de la redistribution des rAMPA aux synapses, nous avons mis en place une technique d'imagerie de molécules uniques à haute résolution. Nous fournissons une preuve directe que l'activation locale de la sous-unité α de la protéine kinase II (αCaMKII) déclenche l'immobilisation rapide des rAMPA aux sites synaptiques. De plus, nous avons trouvé que la phosphorylation de la sous-unité auxiliaire des rAMPA, la stargazine, est requise pour l'immobilisation aux synapses par la liaison à la protéine d'échafaudage synaptique, la PSD-95. Aussi, dans une seconde étude, nous avons montré les rôles distincts des isoformes a et βCaMKII sur la mobilité des rAMPA dans des conditions de transmission basale et de stimulation menant à la plasticité synaptique. Nos études apportent une vision supplémentaire sur le mécanisme à la base de la LTP. Pour étudier l'apport de nouveaux rAMPA à la membrane, à l'aide des récepteurs fusionnés à des protéines fluorescentes sensibles au pH, nous avons mesuré les événements unitaires d'insertion de GluA1 à la membrane postsynaptique. Nous montrons des résultats qui suggèrent que la CaMKII régule l'exocytose des rAMPA. Nos travaux apportent une meilleure compréhension des mécanismes permettant à une enzyme importante pour la mémoire, la CaMKII, de réguler la potentialisation synaptique, via l'apport accrue de rAMPA par exocytose et pas leur piégeage accru aux synapses. / The AMPA receptor (AMPAR) is a subtype of glutamate receptor responsible for the majority of fast excitatory synaptic transmission in the central nervous system. The addition of new receptors to the membrane by exocytosis and redistribution of AMPARs at the postsynaptic site have been proposed as mechanisms of long-term potentiation (LTP) of synaptic transmission, a cellular model of learning and memory. Direct evidence supporting these predictions is missing and the molecular mechanisms that regulate the contribution of AMPARs in the membrane traffic at synapses are poorly understood. To study the mechanisms of redistribution of AMPARs at synapses, we developed a high resolution single molecule imaging technique. We provide direct evidence that local activation of α subunit of the Ca2+/calmodulin protein kinase II (αCaMKII) triggers the rapid immobilization of AMPARs to synaptic sites. In addition, we found that phosphorylation of the auxiliary subunit of AMPARs, stargazine, is required for immobilization at synapses by binding to the synaptic scaffolding protein, PSD-95. Also, in a second study, we have highlighted the distinct contributions of two different isoforms α and β of CaMKII under conditions of basal transmission and following stimuli that induce synaptic plasticity. Our studies provide new insights on the mechanism underlying LTP. To study the contribution of new receptors to the membrane, we use receptors fused to pH-sensitive fluorescent proteins, we measured the discrete exocytic fusion events of GluA1 to the postsynaptic membrane. We provide evidence that CaMKII regulates the process of AMPAR exocytosis. Our experiments contribute to the understanding of how CaMKII, an important enzyme in memory, can regulate the increased delivery of AMPARs at synapses during synaptic potentiation, via their increased exocytosis and post-synaptic trapping.

No / Lysophosphatidic acid (LPA) enhances cell migration and promotes wound healing in vivo, but the intracellular signaling pathways regulating these processes remain incompletely understood. Here we investigated the involvement of agonist-induced Ca2+ entry and STIM1 and Orai1 proteins in regulating nuclear factor of activated T cell (NFAT) signaling and LPA-induced keratinocyte cell motility. As monitored by Fluo-4 imaging, stimulation with 10 μM LPA in 60 μM Ca2+o evoked Ca2+i transients owing to store release, whereas addition of LPA in physiological 1.2 mM Ca2+o triggered store release coupled to extracellular Ca2+ entry. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) was blocked by the SOCE inhibitor diethylstilbestrol (DES), STIM1 silencing using RNA interference (RNAi), and expression of dominant/negative Orai1R91W. LPA induced significant NFAT activation as monitored by nuclear translocation of green fluorescent protein-tagged NFAT2 and a luciferase reporter assay, which was impaired by DES, expression of Orai1R91W, and inhibition of calcineurin using cyclosporin A (CsA). By using chemotactic migration assays, LPA-induced cell motility was significantly impaired by STIM1, CsA, and NFAT2 knockdown using RNAi. These data indicate that in conditions relevant to epidermal wound healing, LPA induces SOCE and NFAT activation through Orai1 channels and promotes cell migration through a calcineurin/NFAT2-dependent pathway.