Le CD40 est une glycoprotéine transmembranaire de type I appartenant à la superfamille des récepteurs des facteurs de nécrose tumorale (TNFRs). Il est exprimé à la surface des cellules hématopoïétiques, principalement les cellules B, et les cellules nonhématopoïétiques telles que les cellules épithéliales et les fibroblastes. Son principal ligand, le CD154, est exprimé de façon transitoire à la surface de différents types cellulaires tels que les lymphocytes T activés. Le CD40 est capable d'interagir avec les deux formes du CD154: la forme membranaire et la forme soluble. Le CD40 joue un rôle important dans la réponse immunitaire humorale. Son engagement avec le CD154 induit la prolifération et la différenciation des cellules B, la commutation isotypique des anticorps, la formation du centre germinal, l’augmentation de la génération de cellules B mémoire et la survie des cellules B. D'autres études ont démontré son implication dans la mort cellulaire. En effet, nos études ont démontré que la signalisation via CD40 conduit à une mort rapide des cellules B, principalement observée dans les lignées de cellules B transformées par le virus d'Epstein-Barr (EBV) alors qu'il est bien documenté que son engagement sur des cellules B immatures les protège de la mort induite via le récepteur des cellules B (BCR). Il n’est cependant pas connu si l’effet apoptotique du CD40 se produit dans des lignées de lymphocytes B qui ne sont pas transformées par EBV. Le travail illustré dans ce mémoire porte sur l'étude du rôle du CD40 dans la mort cellulaire des Ramos qui est un modèle de cellules B immatures, EBV négatives, et à comprendre son influence sur la signalisation apoptotique induite via le BCR. Nos résultats montrent que le CD40 n’induit pas la mort des cellules Ramos mais leur activation par l’ester de phorbol (PMA) les sensibilise à la mort via le CD40, qui est plus significative suite à son interaction avec le ligand (CD154) résistant au clivage. Par contre, cette interaction est aussi capable d'inhiber la mort cellulaire induite via le BCR aussi bien sur les cellules au repos ou activées par le PMA. Cette inhibition de la mort cellulaire est comparable avec les deux formes du CD154. L’ensemble des études suggèrent que le CD40 peut réguler la réponse immune en induisant des signaux de survie nécessaires à la production d'anticorps et peut participer à la résolution de celle-ci en induisant la mort cellulaire des cellules B activées. Par ailleurs, le CD40 peut aussi constituer une cible thérapeutique pour les traitements des lymphomes B. / CD40 is a type I glycoprotein belonging to the tumor necrosis factor receptor (TNFRs) superfamily. The CD40 is expressed on hematopoietic cells, mainly B cells, and on nonhematopoietic cells such as epithelial cells and fibroblasts. Its classical ligand, CD154, is transiently expressed on different cell types such as activated T cells. CD40 is able to interact with both the membrane-bound and the soluble forms of CD154. CD40 plays an important role in the humoral immune response. Its ligation with CD154 induces B cell proliferation and differentiation, antibody class switching, germinal center formation, memory B cell generation and B cell survival. Other studies have demonstrated its implication in cell death. Indeed, our studies have demonstrated that signalling via CD40 leads to a rapid B cell death mainly observed in Epstein-Barr virus (EBV)- transformed B cell lines, although it is well documented that the engagement of CD40 on immature B cells rescues them from IgM-mediated death. However, it is unknown if CD40-mediated cell death occurs in non-EBV B cell lines. The work presented in this thesis focuses on the study of the role of CD40 in Ramos cell death, which is an immature B-cell model, EBV negative, and on its influence on the apoptotic signaling induced via the B-cell receptor (BCR). Our results show that CD40 is unable to induce Ramos cell death but Ramos activation with the phorbol ester (PMA) sensitises them to death via CD40, which is more significant following its interaction with the ligand (CD154) resistant to cleavage. However, CD40 interaction with CD154 is also able to protect both resting and activated Ramos from BCR-mediated death and this occurs equally well with both forms of CD154. Together these studies suggest that CD40 can regulate the immune response by delivering survival signals necessary for antibody production and can contribute to the resolution of the immune response by inducing death in activated B cells. Furthermore, CD40 can also represent a therapeutic target in B cell lymphomas.

Le but de ce travail a été d’étudier l’implication de la réponse immunitaire innée au cours du lupus érythémateux systémique (LES) et de la polyarthrite rhumatoïde (PR). Dans le LES humain, nous montrons que les plaquettes sont activées par les complexes immuns circulants (CICs) et que le CD154 dérivé des plaquettes activées participe avec les CICs à la sécrétion aberrante par les cellules dendritiques d’interféron alpha, cytokine fondamentale dans la physiopathologie du LES. Dans deux modèles murins nous démontrons qu’inhiber l’activation plaquettaire améliore significativement les paramètres lupiques et la survie suggérant que l’activation plaquettaire pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique. Les cytokines inflammatoires tiennent un rôle central dans la physiopathologie de la PR mais les déterminants de leur production restent mal connus. Des polymorphismes du facteur de transcription interferon regulatory factor 5 (IRF5) sont associés au risque de développer une PR. Dans un modèle murin, nous montrons que l’inactivation du gène codant pour IRF5 améliore la maladie. IRF5 étant impliqué dans la signalisation des TLRs, nous mettons alors en évidence in vivo que l’inactivation des voies de signalisation des Toll-like récepteurs (TLRs) TLR3 et TLR7, récepteurs pour les ARN, améliore la maladie. Nous démontrons in vitro un effet synergique dépendant d’IRF5 de ces TLRs pour la production de cytokines inflammatoires. Enfin les souris invalidées pour la signalisation combinée des TLR3 et TLR7 sont spectaculairement épargnées par la maladie suggérant ainsi un rôle clé pour les ligands ARN endogènes dans la pathogénie de la PR. Ces données démontrent l’importance des mécanismes immunitaires innés dans la physiopathologie des maladies auto-immunes systémiques, apportant ainsi de nouvelles voies de recherche thérapeutiques. / The aim of the present sudy was to investigate the involvement of the innate immune system in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE) and rheumatoid arthritis (RA), two models of systemic autoimmune diseases. We show that in SLE patients, platelets are activated by circulating immune complexes. Activated platelet derived CD154 enhances interferon alpha production by immune complex-stimulated dendritic cells in a CD154/CD40 dependent manner. In lupus prone mice, we show that targeting platelet activation improves all measures of disease and overall survival suggesting that this process may provide a new therapeutic target. Proinflammatory cytokines play a central role in the pathogenesis of RA. Gain-of-function polymorphisms in the transcription factor interferon regulatory factor 5 (IRF5) are associated with an increased of developping RA. We now show that IRF5 deficiency substantially reduces disease in a mouse model of RA. As IRF5 participates in TLR signaling, we evaluated TLR requirements in this model and found a significant réduction in disease severity in mice deficient in signaling through the RNA-sensing TLR3 and TLR7. In vitro studies show that TLR3 and TLR7 synergize for proinflammatory cytokine production and that this synergy is markedly diminished in the absence of IRF5. Notably, mice with combined deficiency of TLR3 and TLR7 signaling developed minimal disease indicating an important role for endogenous RNA ligands in disease pathogenesis. Our results bring new elements in the comprehension of the role of innate immunity in the pathogenesis of systemic autoimmune diseases and provide new therapeutic targets.

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The need for an unlimited source of islets and a safer method of immunosuppression has limited the widespread application of islet transplantation. To remedy the shortage of donor tissue, xenotransplantation of neonatal porcine islets (NPI) has been proposed. In this study we sought to determine if combining co-transplantation of NPI with Sertoli cells (SC) with a short-term monoclonal antibody (mAb) therapy would prevent NPI xenograft rejection. We hypothesize that this combination of treatments will lead to long-term NPI xenograft survival. Our result show a significant increase in the proportion of mice achieving long-term graft survival compared to untreated mice transplanted with NPI alone, as 7/7 mice treated with anti-LFA-1 mAb (p=0.001), 7/8 mice treated with anti-CD154 mAb (p=0.003), and 4/9 mice treated with anti-CD45RB mAb (p=0.020) achieved and maintained normoglycemia long-term. Therefore, we conclude that the combination of mAb therapy with SC is highly efficacious in preventing NPI xenograft rejection. / Experimental Surgery

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Le CD154, est une glycoprotéine transmembranaire de type II appartenant à la famille des TNF (tumor necrosis factor). Il est exprimé de façon inductible et transitoire sur plusieurs types cellulaires. Il existe deux formes du CD154, membranaire (mCD154) et soluble (sCD154) qui forment une structure trimérique biologiquement active. Le CD154 a été initialement identifié pour son rôle important dans la réponse humorale thymodépendante suite à sa liaison avec son récepteur, le CD40. Il a été démontré par la suite, que le CD154 joue un rôle dans différentes réponses inflammatoires dont certaines peuvent conduire à des processus pathogènes de maladies inflammatoires chroniques et auto-immunes. Depuis quelques années, des études ont montré que les intégrines αIIbβ3, αMβ2, αvβ3 et α5β1 sont de nouveaux récepteurs pour le CD154. Elles jouent un rôle important dans le contrôle de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération et l’apoptose cellulaire. Cependant, le rôle biologique de l’interaction du CD154 avec ses récepteurs nouvellement identifiés reste peu étudié. Les cellules T sont des cellules clés de la réponse immunitaire, leur survie et leur persistance constituent unesignature caractéristique de nombreuses maladies inflammatoires et auto-immunes. Lors de ces dernières, les cellules T expriment des niveaux élevés d’intégrines β1. Étant donné le rôle attribué aux intégrines et en particulier aux intégrines β1, dans l'inhibition des événements apoptotiques dans les cellules T, nous étions intéressés d’étudier le rôle de l'interaction CD154 / α5β1 dans la promotion de la survie des cellules T. Dans cette étude, nous avons démontré que le sCD154 est capable de se lier spécifiquement à lʼintégrine α5β1 exprimée par les cellules T, et que cette interaction inhibe l'apoptose cellulaire induite par Fas dans les lignées de cellules T suite à lʼinhibition du clivage de la caspase-8. Nous avons également montré que lʼeffet anti-apoptotique induit par l’axe CD154/α5β1 nʼétait pas restreint au Fas seulement, mais était généralisé aux autres récepteurs de mort de la famille des TNF tel que le TRAIL et le TNF. Plus intéressant encore, nos résultats ont montré que la pré-incubation avec le sCD154 des cellules humaines T CD3+ , protège ces dernières de la mort induite par Fas. Enfin, nous avons montré que comme le sCD154, le mCD154 était capable dʼinhiber la mort induite via les différents récepteurs de mort Fas, TRAIL et TNF, mais seulement par un mécanisme cis-dépendant lorsque le CD154 et lʼintégrine α5β1 sont exprimés à la surface d’une même cellule. Ces résultats soulignent l’importance de l'interaction CD154/α5β1 dans la survie des cellules T et de ce fait, dans leurs rôles biologiques. Cette nouvelle observation inculpe davantage le CD154 et ses récepteurs les intégrines dans l’initiation, mais également dans la progression et la persistance des pathologies inflammatoires et auto-immunes en particulier. L'inhibition spécifique de cet axe peut représenter une cible thérapeutique potentielle dans le traitement des pathologies. / CD154 is a type II glycoprotein belonging to the tumor necrosis factors (TNF). It’s expressed in a transitory way on different cell types. There are two forms of CD154, membrane (mCD154) and soluble (sCD154). Both form are biologically active trimeric structure. CD154 has been identified on its role in the thymus dependent humoral response following its binding with its CD40 receptor. It has subsequently been shown that CD154 plays a role in various inflammatory responses, some of which may lead to pathogenic processes of chronic inflammatory and autoimmune diseases. Recently, studies have shown that other αIIbβ3, αMβ2, αvβ3 and α5β1 receptors belonging to the integrin family could interact with CD154. They play an important role in the control of many cellular processes such as cell proliferation and apoptosis. However, the biological role of the interaction of CD154 with its newly identified receptors remains poorly studied. T lymphocytes are key cells in the immune response. Their survival and persistence is a characteristic signature of numerous inflammatory and autoimmune diseases. In these latter, T cells express high levels of β1 integrins. Given the role attributed to integrins and in particular to β1 integrins in the inhibition of apoptotic events in T cells, we were very interested in studying the role of the CD154 / α5β1 interaction in promoting T cell survival. In this study we have demonstrated that sCD154 is able to specifically bind to T-cell expressed α5β1 integrin. This interaction inhibits Fas-induced apoptosis in Jurkat E6.1 and HUT-78 T cell lines following the inhibition of cleavage of caspase-8. We have also shown that the anti-apoptotic effect induced by the CD154 / α5β1 axis was not restricted to Fas, but was generalized to other TNF-like death receptors such as TRAIL and TNF. More interestingly, our results showed that preincubation with sCD154 of previously activated human T CD3+ cells, protects them from Fas-induced death. Finally, we have shown that, like sCD154, mCD154 was able to inhibit death induced by the different death receptors Fas, TRAIL and TNF, but only by a cis-dependent mechanism when CD154 and α5β1 are expressed at the same time surface of the same cells. These results enhance the importance of the CD154 / α5β1 interaction in the survival of T cells and thus in their biological roles. This new observation further induces CD154 and its integrin receptors in initiation, but also in the progression and persistence of inflammatory and autoimmune pathologies, in particular. The specific inhibition of this axis may represent a potential therapeutic target in the treatment of pathologies.

Le CD154 est une glycoprotéine transmembranaire de type II, appartenant à la famille des facteurs de nécrose tumorale (TNF) et s’exprime d’une façon transitoire à la surface des lymphocytes T activés et des plaquettes. Notre laboratoire a démontré que la forme membranaire devient soluble suite à un clivage enzymatique par les métalloprotéinases (ADAM-10 et ADAM-17). De plus, il a été montré que le CD154 soluble (sCD154) peut aussi être relâché du milieu intracellulaire sans qu’il soit exprimé à la surface cellulaire suite à un clivage enzymatique intracellulaire entre les résidus acide Glutamique 112 (E112) et Méthionine 113 (M113). Les deux formes du CD154, soluble et membranaire, possèdent une structure trimérique nécessaire pour son activité biologique. Son récepteur principal, le CD40, est une glycoprotéine de type I appartenant à la famille des récepteurs des TNFs. Il est exprimé constitutivement à la surface des cellules B, des cellules dendritiques, des macrophages, des basophiles, des plaquettes, ainsi qu’à la surface de certaines cellules non hématopoïétiques telles que les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules du muscle lisse vasculaire. Outre le CD40, quatre autres récepteurs appartenant à la famille des intégrines, ont été identifiés: l’αIIbβ3, l’α5β1, l’αMβ2, l’αvβ3 et l’α4β1. Les études de notre laboratoire ont démontré que l’interaction du CD154 avec ses récepteurs induit une activation bidirectionnelle, cependant, on a observé que le clivage du CD154 de la membrane cellulaire reste une propriété privilège au CD40. Le travail illustré dans cette thèse consiste à étudier l’inhibition du clivage enzymatique du CD154 et son effet dans la régulation de la réponse immune. Les résultats générés ci-dessous montrent que le CD154 résistant au clivage est un stimulant plus important que sa forme clivable. En effet, la double mutation des résidus E112 et M113 du CD154 abolit sa libération spontanée du milieu intracellulaire ainsi que son clivage de la membrane médié par le CD40 sans affecter sa liaison à ce dernier. Ce mutant s'est avéré capable d'induire une réponse apoptotique plus importante des cellules B, des réponses prolifératives plus prononcées et déclenche la différenciation des cellules B humaines d’une manière plus significative que le CD154-WT. De plus, notre étude met en évidence le développement et la caractérisation d'un anticorps monoclonal (mAb), le Clone 8, capable d'inhiber la libération/le clivage du CD154 à partir des cellules et ainsi de le maintenir à la surface cellulaire et d'augmenter sa puissance en tant qu'activateur des réponses induites par le CD40. Le Clone 8 est capable de lier le CD154 murin et d’inhiber son clivage de la surface cellulaire de la même façon que celle étudiée dans les cellules humaines. Ces travaux vont permettre le passage de cet anticorps bloquant le clivage du CD154 au stade des essais cliniques afin de mettre en place un nouveau traitement efficace pour les maladies auto-immunes et le cancer. / CD154 is a type II transmembrane glycoprotein belonging to the tumor necrosis factor superfamily (TNF), that is transiently expressed on the surface of activated T cells and platelets. We have demonstrated that this membrane form becomes soluble following an enzymatic cleavage by metalloproteinases (ADAM-10 and ADAM-17). CD154 also exists in a soluble form originating from a direct release of an intracellular processing without being expressed on the cell surface. This fragment is the result of an intracellular enzymatic cleavage between the residues Glutamic acid at position 112 (E112) and Methionine at position 113 (M113). Both soluble and membrane-bound forms of CD154 occur as non-covalently-linked homotrimers a property conveying to CD154 its biological activity. Its main receptor, CD40, is a type I glycoprotein belonging to the TNF receptor family. It is constitutively expressed on the surface of immune and non-immune cells including B cells, dendritic cells, macrophages, basophils, endothelial cells, fibroblasts, and vascular smooth muscle cells. CD154 was also shown to bind other receptors: αIIbβ3, α5β1, αMβ2, αvβ3 and α4β1 integrin. We have shown that the interaction of CD154 with its receptors induces bidirectional activation, however, only CD40 was capable of inducing the cleavage of CD154 from T cell surface. Our results here consist in studying the inhibition of the enzymatic cleavage of CD154 and its effect in the regulation of the immune response. Our data show that the cleavage resistant CD154 is a more potent stimulant than its cleavable form. Indeed, the double mutation of residues E112 and M113 of CD154 abolishes its spontaneous release from the intracellular milieu as well as its cleavage from the membrane. This mutant was found to be able to induce a stronger apoptotic response from B cells, induce more pronounced proliferative responses and trigger human B cell differentiation in a more significant way than CD154-WT. In addition, our study highlights the development and characterization of a monoclonal antibody (mAb), Clone 8, capable of inhibiting the release/cleavage of CD154 from cells and thus maintain it on the cell surface and increase its potency as an activator of CD40-induced responses. Clone 8 binds murine CD154 and inhibit its cell surface cleavage in the same way that in human cells. This study will allow the passage of this antibody blocking the cleavage of CD154 to the stage of clinical trials to develop a novel tool to treat diseases in which CD154 is implicated.

The tumor necrosis factor (TNF) receptor-associated factors (TRAFs) were initially discovered as proteins that inducibly interact with the intracellular region of TNF receptors (TNFRs). Because the TNFRs lack intrinsic catalytic activity, the TRAFs are hypothesized to orchestrate signaling activation downstream of the TNFR superfamily, however their mechanism of activation remains unclear (Inoue et al., 2000; Bishop, 2004). Originally, the TRAFs were compared to the signal transducers and activators of transcription (STAT) protein family, due to their sequence homology, and the presence of multiple RING- and zinc-finger domains, suggesting that their function may be to regulate transcriptional activity (Rothe et al., 1994; Hu et al., 1994; Sato et al. 1995; Cheng et al., 1995). However, subsequent research focused predominantly on their cytoplasmic functions, and more recently on their function as E3 ubiquitin ligases (Pineda et al., 2007). In my research, I analyzed the subcellular localizations of the TRAFs following CD40 ligand (CD40L)-stimulation, and found that TRAF2 and 3 rapidly translocate into the nucleus of primary neurons and Neuro2a cells. Interestingly, similar analysis conducted in pre-B lymphocytes (Daudi cells) revealed a different response to CD40L-stimulation, with TRAF2 and 3 being rapidly degraded within 5-minutes of stimulation. These findings are significant because they demonstrate for the first time that the TRAFs translocate into the nucleus and suggest that they may function within the nucleus in a cell-specific manner. I next analyzed the ability of TRAF2 and 3 to bind to DNA, and found that they both bind to chromatin and the NF-kappaB consensus element in Neuro2a cells, following CD40L-stimulation. Similar analyses of the chromatin binding of TRAF2 and 3 in Daudi cells revealed that they were rapidly degraded, similar to the results from my analysis of their subcellular localization. These findings show for the first time that the TRAFs interact with DNA, and therefore support the hypothesis that the TRAFs may function within the nucleus as transcriptional regulators. Finally, I analyzed the ability of the TRAFs to regulate transcriptional activity by luciferase assay. Previous studies showed that overexpression of TRAF2 and 6 could induce NF-kappaB transcriptional activity; however researchers have not been able to determine the mechanism by which they do so. In my studies, I found that every TRAF can directly regulate transcriptional activity either as co-activators or co-repressors of transcription, in a cell- and target protein-specific manner. Additionally, I found that TRAF2 can act as a transcriptional activator, and that its ability to regulate transcription is largely dependent upon the presence of its RING-finger domain. In conclusion, these studies have revealed an entirely novel function for the TRAFs as immediate-early transcriptional regulators. Future research into the genes that are regulated by the specific TRAF complexes will further elucidate how the TRAFs regulate TNFR signaling, as well as whether dysfunctions in TRAF signaling may be associated with known disorders. If specific TRAF complexes are found to regulate specific genes, then pharmacological targeting of the individual TRAF complexes may allow for the highly specific inhibition of signaling events downstream of the TNFRs, without compromising overall receptor signaling, transcription factor pathways, or cellular systems.