Proefschrift Universiteit Maastricht. / Auteursnaam op omslag: Joep Brinkmann. Met bibliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Gamma-interferon stimulates human macrophages to produce of 7,8-dihydroneopterin (7,8-NP). 7,8-NP and its oxidation product neopterin are excellent inflammatory markers for a variety of chronic conditions, including atherosclerosis. The biological significance of 7,8-NP in atherosclerosis is not fully understood, but 7,8-NP has been shown to protect macrophage cells from oxidised low density lipoprotein (oxLDL). Cellular accumulation of oxLDL-derived lipids and oxLDL-induced cytotoxicity are major drivers of atherosclerotic plaque progression. This thesis investigated the mechanisms of 7,8-NP-mediated protection against oxLDL-induced damage to macrophage cells. The research assessed the relative contribution of the previously identifyed antioxidant capacity of 7,8-NP and its ability to down-regulate oxLDL uptake. OxLDL cytotoxicity was characterised by high intracellular oxidative stress within the first 12 hours of exposure, which was critical to oxLDL toxicity. Exogenously added 7,8-NP effectively scavenged the intracellular oxidants generated in response to oxLDL, shown by the oxidation of 7,8-NP to neopterin. The ability of 7,8-NP to alleviate oxidative stress during the critical time-frame of acute toxicity was the primary mechanism of protection. 7,8-NP was also found to down-regulate the levels of intracellular oxysterol esters in oxLDL-treated macrophages. This decrease was associated with the reduction of CD36 scavenger receptor protein and mRNA expression. The late onset of these processes in the second half of the 24 hour incubation highlighted their potential role in foam cell formation. Research indicated that 7,8-NP may play a role in the reverse cholesterol transport in these cholesterol ester-loaded cells. The CD36 down-regulation by 7,8-NP did not protect macrophages from acute oxLDL cytotoxicity. This research reveals novel detail about the mechanism of 7,8-NP protection of macrophages from cytotoxic effects of oxLDL. It is suggested that 7,8-NP may protect macrophage cells in the atherosclerotic plaques by scavenging ROS produced during acute cytotoxicity and alleviate oxysterol ester accumulation, thus stabilising macrophage cells during chronic oxLDL exposure.

Assembly of intestinal chylomicron particles (lipid-protein complexes) is the fundamental mechanism by which we absorb dietary fat. Two intestinal lipid transporters, Cluster of Differentiation 36 (CD36) and fatty acid-binding protein 1 (FABP1), have been shown to play a role in lipid absorption, however, it remains unclear how knockdown of these proteins bleads to aberrant intestinal chylomicron secretion. In an enterocyte-like cell culture model, Caco-2 cells, we hypothesized that knockdown of CD36 or FABP1 using short-hairpin RNA interference techniques would impair triacylglycerol (TG) and apolipoprotein B (apoB) secretion. Surprisingly, knockdown of these lipid transporters lead to an increase in TG and apoB secretion that was associated with an increase in fatty acid synthase and fatty acid transport protein 4 (FATP4) protein levels. De novo fatty acid synthesis was slightly increased in CD36-, but not FABP1-knockdown Caco-2 cells. This study highlights the importance of fatty acid targeting in regulating chylomicron production.

Assembly of intestinal chylomicron particles (lipid-protein complexes) is the fundamental mechanism by which we absorb dietary fat. Two intestinal lipid transporters, Cluster of Differentiation 36 (CD36) and fatty acid-binding protein 1 (FABP1), have been shown to play a role in lipid absorption, however, it remains unclear how knockdown of these proteins bleads to aberrant intestinal chylomicron secretion. In an enterocyte-like cell culture model, Caco-2 cells, we hypothesized that knockdown of CD36 or FABP1 using short-hairpin RNA interference techniques would impair triacylglycerol (TG) and apolipoprotein B (apoB) secretion. Surprisingly, knockdown of these lipid transporters lead to an increase in TG and apoB secretion that was associated with an increase in fatty acid synthase and fatty acid transport protein 4 (FATP4) protein levels. De novo fatty acid synthesis was slightly increased in CD36-, but not FABP1-knockdown Caco-2 cells. This study highlights the importance of fatty acid targeting in regulating chylomicron production.

Thesis (Ph. D.)--Cornell University, May, 1998. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 146-154).

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met bibliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

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La thrombospondine-1 (TSP-1) est une glycoprotéine multi-modulaire exprimée de façon ubiquitaire qui régule de nombreux processus pathophysiologiques tels que l'adhérence cellulaire, la prolifération, l'apoptose, l'inflammation et les réponses cardiovasculaires. La TSP-1 est reconnue comme un acteur moléculaire majeur au sein du microenvironnement tumoral et constitue une cible de choix pour le développement d'agents thérapeutiques anti- cancéreux. L'interaction de la TSP-1 avec le récepteur membranaire CD47 est largement rapportée comme étant impliquée dans la progression tumorale et la mise en place d'une résistance aux traitements chiomiothérapeutiques. De ce fait, nous avons cherché à identifier et à caractériser un agent moléculaire novateur se comportant comme antagoniste sélectif de l'interaction TSP-1:CD47. Des expériences de docking protéine-protéine et de simulation moléculaire ont été réalisées afin de concevoir un nouveau peptide dérivé du CD47, nommé TAX2. Le peptide TAX2 empêche l'interaction de la TSP-1 avec le CD47, comme cela a été confirmé par co-immunoprécipitation et test ELISA. De manière intéressante, le peptide TAX2 inhibe la migration des cellules endothéliales, la formation de structures multi- cellulaires de type capillaire ainsi que le développement de micro-vaisseaux à partir d'explants aortiques. De façon cohérente avec ces observations, nos résultats mettent en évidence que le peptide TAX2 promeut la liaison de la TSP-1 au sein de complexes moléculaires comprenant le récepteur CD36, et inhibe en conséquence la voie de signalisation associée au VEGF et au VEGFR2. Enfin, une approche d'imagerie multi-modale et multi-échelles combinant des marquages histologiques, l'analyse de la densité micro-vasculaire, des analyses d'imagerie de résonance magnétique et d'imagerie infra-rouge à transformée de Fourier, ainsi qu'un suivi longitudinal par micro-tomographie à rayons X a été conduite afin de quantifier l'angiographie tumorale in vivo. Les résultats obtenus chez la souris C57Bl/6 révèlent que des administrations intra-péritonéales du peptide TAX2 perturbent fortement le réseau vasculaire associé à la tumeur de mélanome et induisent une importante nécrose tumorale entrainant l'effondrement de la tumeur. De plus, nous avons démontré que le peptide TAX2 inhibe considérablement la dissémination métastatique sans affecter les organes sains. Nous avons donc identifié le premier antagoniste sélectif de l'interaction TSP-1:CD47 qui, en contournant le problème des molécules existantes ciblant aveuglément le CD47, présente des activités anti-angiogéniques, anti-tumorales et anti-métastatiques in vivo qui pourraient à terme fournir de nouvelles approches thérapeutiques en pathologie tumorale. / Thrombospondin-1 (TSP-1) is a ubiquitously expressed multi-modular glycoprotein involved in many pathophysiological processes including regulation of cell adhesion, proliferation, apoptosis, inflammation and cardiovascular response. TSP-1 is recognized as a major molecular actor within tumor microenvironment and constitutes an exciting target for the development of useful therapeutic agents against tumorigenesis. TSP-1 binding to CD47 membrane receptors is widely reported to support tumor progression and may drive chemotherapeutic drug resistance. Thus, we sought to identify and characterize an innovative molecular agent acting as selective antagonist for TSP-1:CD47 interaction. Protein-protein docking and molecular dynamics simulations were conducted to design a novel CD47-derived peptide, called TAX2. TAX2 prevents TSP-1 binding to CD47, as revealed by ELISA binding assays and co-immunoprecipitation experiments. Interestingly, TAX2 inhibits endothelial cell migration, formation of multi-cellular capillary-like structures and sprouting of microvessels from aortic explants. Consistently, our data highlighted that TAX2 peptide promotes TSP-1 binding to CD36-containing complexes, leading to disruption of VEGF/VEGFR2 signaling. Furthermore, a multi-modal and multi-scale imaging approach was conducted combining histopathological staining, tumor-associated microvessel density, magnetic resonance imaging analysis, Fourier transform infrared imaging and micro-computed tomography monitoring for 3D quantification and longitudinal follow-up of tumor angiography in vivo. The results obtained from C57Bl/6 mice revealed that intraperitoneal administration of TAX2 highly disturbs melanoma tumor vascularization network, inducing an extensive tumor necrosis and subsequent tumor collapse. Furthermore, we demonstrated that TAX2 drastically inhibits the melanoma lung metastases dissemination without affecting healthy organs. Overall, we designed the first selective antagonist for TSP-1:CD47 interaction. By bypassing the problem of existing molecules blindly targeting CD47, we revealed that TAX2 exhibits anti- angiogenic, anti-tumor and anti-metastatic activities in vivo that could supply new innovative therapeutic approaches against malignant diseases.

L'obésité est devenue l'un des problèmes de santé publique les plus importants de ce siècle. Un certain nombre de facteurs génétiques et environnementaux contribuent au développement de cette pathologie. L'apport alimentaire quotidien est également l'un des facteurs cruciaux. Une consommation excessive de graisse alimentaire a été jugée essentielle dans le développement de l'obésité. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs études ont montré que la détection de graisse orale joue un rôle important dans le développement de l'obésité. Pour prouver une relation entre l'obésité, la détection de graisse orale et les polymorphismes génétiques, nous avons recruté des enfants, des adolescents et des sujets adultes de trois populations différentes. À ce jour, le gène CD36 code le récepteur du goût gras le plus prometteur. De plus, nous avons étudié une relation possible entre le goût gras et le goût amer. Les résultats globaux montrent que les goûts amers et gras sont modifiés chez les personnes obèses. De plus, les polymorphismes CD36 ont une influence significative à la fois, la détection orale et l'obésité. Nos résultats pourraient aider à mieux comprendre une relation entre l'obésité, le goût et les polymorphismes génétiques. / Obesity has become one of most important public health issue in this century. A number of genetic and environmental factors contribute to development of this pathology. Daily dietary intake is also one of the crucial factors. Excessive dietary fat intake has been shown to be critical in the development of obesity. In the last two decades, several studies have shown that oral fat sensing plays an important role in the development of obesity. To prove a relationship between obesity, oral fat sensing and genetic polymorphisms, we recruited children, adolescents and adult subjects from three different populations. To date, CD36 gene encodes the most promising fat taste receptor. Furthermore, we studied a possible relationship between fat taste and bitter taste. Overall results show that bitter and fat tastes are altered in obese individuals. Moreover, CD36 polymorphisms have a significant influence in both, oral sensing and obesity. Our results might help better understand a relationship between obesity, taste and genetic polymorphisms.

L’hypertriglycéridémie postprandiale représente un facteur de risque émergent des maladies cardiovasculaires et est retrouvé en cas de syndrome métabolique, d’obésité et d’insulino-résistance. L’intestin grêle conditionne la triglycéridémie postprandiale puisque la taille et de la quantité des chylomicrons sécrétés modulent l’activité de la Lipoprotéine Lipase (LPL). La synthèse des chylomicrons est un mécanisme complexe dont l’étape de lipidation de l’Apolipoprotéine B48 (ApoB48) par la Microsomal Triglyceride Transfert Protein (MTP) et celle de leur transfert du réticulum vers le Golgi dans laquelle intervient la Liver Fatty Acid binding Protein (L-FABP) sont limitantes. Des expériences menées in vivo chez des animaux sauvages et transgéniques et ex vivo sur des segments intestinaux, nous ont permis de démontrer qu’il existe une adaptation postprandiale du métabolisme intestinal des lipides. Cette adaptation postprandiale est déclenchée par la glycoprotéine CD36 qui en présence d’acides gras à longue chaîne (AGLC) régule la voie ERK1/2 et conduit à l’induction de l’ApoB48, de la MTP et de la L-FABP. La dégradation rapide du CD36 par la voie ubiquitine-protéasome en présence d’AGLC, qui conduit à la désactivation de la voie ERK1/2, est typique d’un récepteur. Puisque d’une part les souris invalidées pour le Peroxisome Proliferator Activated receptor (PPAR) présentent une altération de l’adaptation et une hypertriglycéridémie postprandiale et que d’autre part les lipides alimentaires induisent le PPAR via CD36, CD36 et PPAR pourraient faire partie d’un mécanisme commun de régulation. En conclusion, CD36 et PPAR contribuent au sensing entérocytaire des AGLC d’origine alimentaire, responsable de l'adaptation postprandiale du métabolisme des lipides qui favorise la formation de gros chylomicrons efficacement épurés de la circulation sanguine. / Postprandial hypertriglyceridemia is an emerging risk factor for cardiovascular diseases and is associated with metabolic syndrome, obesity and insulin resistance. The small intestine participates in the postprandial triglyceridemia since both the size and number of secreted chylomicrons modulate lipoprotein lipase activity (LPL). Chylomicron synthesis is a complex mechanism in which the lipidation of Apolipoprotein B48 (ApoB48) by the Microsomal Triglyceride Transfer Protein (MTP) and the transfer between reticulum and Golgi in which the Liver Fatty Acid Binding Protein (L -FABP) is involved are limiting steps. An intestinal fat-mediated adaptation in postprandial period has been demonstrated by in vivo (transgenic and wild type mice) and ex vivo (intestinal segments) approches. This postprandial adaptation is triggered by the glycoprotein CD36 in the presence of Long chain Fatty Acids (LCFA) that regulates the ERK1/2 pathway and leads to the induction of ApoB48, MTP and L-FABP. The rapid degradation of CD36 by the ubiquitin-proteasome pathway in the presence of LCFA, which leads to ERK1/2 deactivation, has a feature of a receptor. Since firstly, Peroxisome Proliferator Activated Receptor (PPAR) knockout mice display an alteration of postprandial adaptation associated with a hypertriglyceridemia and secondly, dietary fat-mediated PPAR up-regulation is CD36 dependent, CD36 and PPAR might participate to a common regulation mechanism. In conclusion, CD36 and PPAR contribute to the enterocyte LCFA sensing responsible for postprandial adaptation that promotes the formation of large chylomicrons efficiently cleared into the blood.