<p>Although it has been known for many years that B-cyclin/CDK complexes regulate the assembly of the mitotic spindle and entry into mitosis, the full complement of relevant CDK targets has not been identified. It has previously been shown in a variety of model systems that B-type cyclin/CDK complexes, kinesin-5 motors, and the SCF<super>Cdc4</super> ubiquitin ligase are required for the separation of spindle poles and assembly of a bipolar spindle. It has been suggested that in the budding yeast,<italic> Saccharomyces cerevisiae</italic>, B-type cyclin/CDK (Clb/Cdc28) complexes promote spindle pole separation by inhibiting the degradation of the kinesins-5 Kip1 and Cin8 by the anaphase-promoting complex (APC<super>Cdh1</super>). I have determined, however, that the Kip1 and Cin8 proteins are actually present at wild-type levels in yeast in the absence of Clb/Cdc28 kinase activity. Here, I show that Kip1 and Cin8 are in vitro targets of Clb2/Cdc28, and that the mutation of conserved CDK phosphorylation sites on Kip1 inhibits spindle pole separation without affecting the protein's <italic>in vivo</italic> localization or abundance. Mass spectrometry analysis confirms that two CDK sites in the tail domain of Kip1 are phosphorylated in vivo. In addition, I have determined that Sic1, a Clb/Cdc28-specific inhibitor, is the SCF<super>Cdc4</super> target that inhibits spindle pole separation in cells lacking functional Cdc4. Based on these findings, I propose that Clb/Cdc28 drives spindle pole separation by direct phosphorylation of kinesin-5 motors. </p><p>In addition to the positive regulation of kinesin-5 function in spindle assembly, I have also found evidence that suggests CDK phosphorylation of kinesin-5 motors at different sites negatively regulates kinesin-5 activity to prevent premature spindle pole separation. I have also begun to characterize a novel putative role for the kinesins-5 in mitochondrial genome inheritance in <italic>S. cerevisiae</italic> that may also be regulated by CDK phosphorylation. </p><p>In the course of my dissertation research, I encountered problems with several established molecular biology tools used by yeast researchers that I have tried to address. I have constructed a set of 42 plasmid shuttle vectors based on the widely used pRS series for use in <italic>S. cerevisiae</italic> that can be propagated in the bacterium Escherichia coli. This set of pRSII plasmids includes new shuttle vectors that can be used with histidine and adenine auxotrophic laboratory yeast strains carrying mutations in the genes <italic>HIS2</italic> and <italic>ADE1</italic>, respectively. My new pRSII plasmids also include updated versions of commonly used pRS plasmids from which common restriction sites that occur within their yeast-selectable biosynthetic marker genes have been removed in order to increase the availability of unique restriction sites within their polylinker regions. Hence, my pRSII plasmids are a complete set of integrating, centromere and 2&#61549; episomal plasmids with the biosynthetic marker genes <italic>ADE2</italic>, <italic>HIS3</italic>, <italic>TRP1</italic>, <italic>LEU2</italic>, <italic>URA3</italic>, <italic>HIS2</italic> and <italic>ADE1</italic> and a standardized selection of at least 16 unique restriction sites in their polylinkers. Additionally, I have expanded the range of drug selection options that can be used for PCR-mediated homologous replacement using pRS plasmid templates by replacing the G418-resistance kanMX4 cassette of pRS400 with MX4 cassettes encoding resistance to phleomycin, hygromycin B, nourseothricin and bialaphos. Finally, in the process of generating the new plasmids, I have determined several errors in existing publicly available sequences for several commonly used yeast plasmids. Using updated plasmid sequences, I constructed pRS plasmid backbones with a unique restriction site for inserting new markers in order to facilitate future expansion of the pRS/pRSII series.</p> / Dissertation

The current thesis investigated a potential relationship between Alzheimer disease and type-2 diabetes mellitus by analysing early gene expression related to insulin receptor signalling in the hippocampus as well as glucose metabolism in APP/PS1 mice, a model of familial Alzheimer disease. Compared to wild-type animals, a reduction in hippocampal insulin receptor and insulin-receptor substrate 2 transcripts in APP/PS1 mice three-month old as well as an increase in insulin-like growth factor 2 transcripts after six months was detected using real-time polymerase chain reaction. The alterations in hippocampal insulin signalling were accompanied by perturbation of glucose metabolism analysed by intraperitoneal glucose tolerance test. At the age of six months APP/PS1 mice developed glucose intolerance. Learning and recognition memory in APP/PS1 mice were tested using the Novel Object Recognition Test. Cognitive decline became evident in APP/PS1 mice at six months of age. Degradation of both insulin and amyloid β is mediated through insulin-degrading enzyme. However, expression of insulin-degrading enzyme in APP/PS1 mice was notdifferent from wild-type littermates. Changes in hippocampal phosphorylation of the tau phosphoepitopes serine 199, threonine 205, serine 396 and serine 404 were investigated using Western blot. Levels of three phosphoepitopes were increased significantly at either age.IV Protein expression of the phosphorylated form of glycogen synthase kinase 3β remained unchanged indicating an alternative pathway of tau phosphorylation in the APP/PS1 mouse model of familial Alzheimer disease. The current results demonstrate an increase in cyclin-dependant kinase 5 phosphoralyted at tyrosine 15 in APP/PS1 mice at three and six months of age. The correlation between elevated levels of phosphorylated tau and cyclin-dependant kinase 5 suggests that cyclin-dependant kinase 5 might contribute to tau phosphorylation in APP/PS1 mice. In general, this work corroborates common pathologic features in Alzheimer disease and diabetes mellitus. A significant cognitive decline in APP/PS1 mice was associated with changes in early gene expression of insulin-related molecules and perturbations in glucose metabolism. Cyclin-dependant kinase 5 is considered to coregulate tau phosphorylation in APP/PS1 mice, and to be part of a pathway contributing to pathology in Alzheimer disease

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires qui composent une grande partie du phytoplancton et qui jouent un rôle important au niveau de la photosynthèse, de la production primaire et de la conservation des écosystèmes marins. Les dinoflagellés se distinguent des autres eucaryotes par leur biologie et leur organisation nucléaire unique. Lors de la mitose, leur membrane nucléaire demeure intacte et la ségrégation des chromosomes se fait à partir de fuseaux mitotiques formés dans le cytoplasme et qui traversent le noyau au travers de canaux spécialisés Aussi, leurs chromosomes sont condensés en permanence et le processus utilisé pour y arriver est encore très mal compris puisque les dinoflagellés ne possèdent aucunes histones détectables. Lingulodinium polyedrum est un dinoflagellé photosynthétique marin utilisé comme organisme modèle en ce qui concerne l’étude des rythmes circadiens (bioluminescence, migration verticale, mitose et photosynthèse). La découverte et l’étude des éléments régulateurs du cycle cellulaire peuvent nous amener à comprendre le mécanisme, l’influence et la portée du contrôle circadien sur le cycle cellulaire. De plus, l’étude du cycle cellulaire pourrait permettre de révéler des indices quant aux caractéristiques singulières des dinoflagellés qui sont pour le moment énigmatiques. Par le passé, une étude chez Lingulodinium polyedrum a permis d’identifier la cycline impliquée dans la mitose, LpCyc1, le premier régulateur du cycle cellulaire a être découvert chez les dinoflagellés. La présente étude s’attarde sur la caractérisation de la LpCyc1, soit son expression, sa localisation, sa phosphorylation. Ces trois éléments concordent de façon à synchroniser l’activité de la LpCyc1 (et ainsi la mitose) de façon circadienne. Cette étude présente aussi la création et le développement d’un outil majeur pour l’étude future de Lingulodinium polyedrum, le transcriptome des ARNm à partir d’un iv séquençage Illumina. C’est d’ailleurs avec cet outil que nous avons découvert la CDK responsable du contrôle de la phase M, LpCdk1. Cette CDK possède tous les domaines d’une CDK classique, un site de liaison des substrats, un site de liaison à l’ATP, une boucle activatrice, et une interface de liaison avec la cycline. Le transcriptome de Lingulodinium polyedrum a aussi permis de recenser toutes les protéines conservées normalement retrouvées dans le contrôle du cycle cellulaire, qui nous a permis de faire une ébauche préliminaire du cycle cellulaire de L. polyedrum. Cette analyse est une première chez Lingulodinium polyedrum et peut s’étendre pour l’étude d’une multitude d’autres processus métaboliques. / Dinoflagellates are unicellular eukaryotes that constitute a large part of the phytoplankton. They are major contributors to the global photosynthesis and primary production and they possess an important role in conservation of marine ecosystems. Dinoflagellates are distincted from other eukaryotes by their unique biology and nuclear organization. During mitosis, their nuclear envelope stays intact and chromosome segregation is done by a mitotic spindle that passed through the nucleus inside several specialized cytoplasmic channels. In addition, the chromosomes are permanently condensed and are not thought to have histones. Lingulodinium polyedrum is a marine photosynthetic dinoflagellate widely used to study the control mechanisms of circadian rhythms, because many aspects of its physiology (bioluminescence, mitosis, photosynthesis and vertical migration) are circadian. The discovery of cell cycle regulators is essential for understanding the mechanism and the circadian control over the cell cycle. A previously study identified the M-phase cyclin, LpCyc1, the first dinoflagellate cell cycle regulator to be discovered. The present study presents the characterization of the LpCyc1, with respect to expression levels and phosphorylation patterns. These elements act together to ensure the synchronization of the LpCyc1 activity (and the mitosis) within the day. This study also presents the creation and the development of the transcriptome, a major tool for the upcoming studies of Lingulodinium polyedrum. With this tool, we identified the Lingulodinium polyedrum M-CDK, LpCdk1. The LpCdk1 has all the domains of a classic M-CDK, a substrate binding site, an ATP binding site, an activation loop and a cyclin binding interface. vi With the Lingulodinium polyedrum transcriptome, we also made a census of all the conserved proteins normally found in the cell cycle control of yeast. The identification of these proteins had provided a rough shape of L. polyedrum cell cycle. This kind of analysis is the first to be made with Lingulodinium polyedrum and could be expanded to other metabolic processes.

Les agents permettant de créer des dommages sur l'ADN sont principalement utilisés dans les traitements contre le cancer. L'activation de points de contrôle du cycle cellulaire après lésion de l'ADN entraîne un arrêt du cycle des cellules. De la connaissance des mécanismes moléculaires de l'arrêt du cycle cellulaire par ces points de contrôle dépend l'efficacité du traitement. Dans les cellules humaines, ces points de contrôle sont primordiaux puisque leur inactivation entraîne la carcinogenèse (génération de cancers). Après traitement par des agents chimiothérapiques et des rayons X, les cellules s'arrêtent en phase G-1 et G-2/Mitose (M) du cycle cellulaire. Si de nombreuses études ont permis de clarifier les mécanismes de l'arrêt en phase G-1 pour des cellules dont l'ADN est endommagé, peu de données sont disponibles concernant l'arrêt en phase G-2/M. Parmi ces points de contrôle, le point de contrôle G-2/M est particulièrement important car il prévient l'entrée en mitose (phase M) des cellules dont l'ADN est endommagé. <br /> Nous avons analysé le rôle du complex appelé APC (Anaphase-Promoting Complex) dans les points de contrôle G-2/M après lésion de l'ADN. Les lésions de l'ADN sont induites dans les cellules synchronisées en phase S. Suite à ces dommages, les cellules montrent un retard et s'arrêtent en phase G-2 avec 4N chromosomes. Afin d'identifier les bases biochimiques de l'arrêt en G-2/M après traitement avec des agents endommageant l'ADN, nous allons concentrer notre recherche sur un complexe composé de multiples protéines possédant une activité de ligation de l'ubiquitine de type E3 (ubiquitin-ligase E3). Ce complexe APC est necessaire pour la dégradation des inhibiteurs d'entrée en anaphase, cyclins mitotiques, et plusieurs kinases mitotiques pour la complétion de la sortie de la mitose. Nous avons analysé et déterminé que l'absence d'activité du complexe APC inhibe l'activation du point de contrôle G-2/M lors de dommages de l'ADN.

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires qui composent une grande partie du phytoplancton et qui jouent un rôle important au niveau de la photosynthèse, de la production primaire et de la conservation des écosystèmes marins. Les dinoflagellés se distinguent des autres eucaryotes par leur biologie et leur organisation nucléaire unique. Lors de la mitose, leur membrane nucléaire demeure intacte et la ségrégation des chromosomes se fait à partir de fuseaux mitotiques formés dans le cytoplasme et qui traversent le noyau au travers de canaux spécialisés Aussi, leurs chromosomes sont condensés en permanence et le processus utilisé pour y arriver est encore très mal compris puisque les dinoflagellés ne possèdent aucunes histones détectables. Lingulodinium polyedrum est un dinoflagellé photosynthétique marin utilisé comme organisme modèle en ce qui concerne l’étude des rythmes circadiens (bioluminescence, migration verticale, mitose et photosynthèse). La découverte et l’étude des éléments régulateurs du cycle cellulaire peuvent nous amener à comprendre le mécanisme, l’influence et la portée du contrôle circadien sur le cycle cellulaire. De plus, l’étude du cycle cellulaire pourrait permettre de révéler des indices quant aux caractéristiques singulières des dinoflagellés qui sont pour le moment énigmatiques. Par le passé, une étude chez Lingulodinium polyedrum a permis d’identifier la cycline impliquée dans la mitose, LpCyc1, le premier régulateur du cycle cellulaire a être découvert chez les dinoflagellés. La présente étude s’attarde sur la caractérisation de la LpCyc1, soit son expression, sa localisation, sa phosphorylation. Ces trois éléments concordent de façon à synchroniser l’activité de la LpCyc1 (et ainsi la mitose) de façon circadienne. Cette étude présente aussi la création et le développement d’un outil majeur pour l’étude future de Lingulodinium polyedrum, le transcriptome des ARNm à partir d’un iv séquençage Illumina. C’est d’ailleurs avec cet outil que nous avons découvert la CDK responsable du contrôle de la phase M, LpCdk1. Cette CDK possède tous les domaines d’une CDK classique, un site de liaison des substrats, un site de liaison à l’ATP, une boucle activatrice, et une interface de liaison avec la cycline. Le transcriptome de Lingulodinium polyedrum a aussi permis de recenser toutes les protéines conservées normalement retrouvées dans le contrôle du cycle cellulaire, qui nous a permis de faire une ébauche préliminaire du cycle cellulaire de L. polyedrum. Cette analyse est une première chez Lingulodinium polyedrum et peut s’étendre pour l’étude d’une multitude d’autres processus métaboliques. / Dinoflagellates are unicellular eukaryotes that constitute a large part of the phytoplankton. They are major contributors to the global photosynthesis and primary production and they possess an important role in conservation of marine ecosystems. Dinoflagellates are distincted from other eukaryotes by their unique biology and nuclear organization. During mitosis, their nuclear envelope stays intact and chromosome segregation is done by a mitotic spindle that passed through the nucleus inside several specialized cytoplasmic channels. In addition, the chromosomes are permanently condensed and are not thought to have histones. Lingulodinium polyedrum is a marine photosynthetic dinoflagellate widely used to study the control mechanisms of circadian rhythms, because many aspects of its physiology (bioluminescence, mitosis, photosynthesis and vertical migration) are circadian. The discovery of cell cycle regulators is essential for understanding the mechanism and the circadian control over the cell cycle. A previously study identified the M-phase cyclin, LpCyc1, the first dinoflagellate cell cycle regulator to be discovered. The present study presents the characterization of the LpCyc1, with respect to expression levels and phosphorylation patterns. These elements act together to ensure the synchronization of the LpCyc1 activity (and the mitosis) within the day. This study also presents the creation and the development of the transcriptome, a major tool for the upcoming studies of Lingulodinium polyedrum. With this tool, we identified the Lingulodinium polyedrum M-CDK, LpCdk1. The LpCdk1 has all the domains of a classic M-CDK, a substrate binding site, an ATP binding site, an activation loop and a cyclin binding interface. vi With the Lingulodinium polyedrum transcriptome, we also made a census of all the conserved proteins normally found in the cell cycle control of yeast. The identification of these proteins had provided a rough shape of L. polyedrum cell cycle. This kind of analysis is the first to be made with Lingulodinium polyedrum and could be expanded to other metabolic processes.

Les bicycles imidazo-imidazoles constituent une classe de composés hétérocycliques intéressants tant sur le plan chimique que pharmaceutique. Ils jouent un rôle très important dans la synthèse et la fonctionnalisation des composés à visé thérapeutique. Dans le cadre de la recherche de nouveaux candidats inhibiteurs de kinases, nous avons développé une voie de synthèse des imidazo[1,2-a]imidazoles mono- et bifonctionnalisés. Par la suite, nous avons mis au point une stratégie de synthèse rapide et efficace de bicycles imidazo[1,5-a]imidazolin-2-one et imidazo[1,5-a]imidazole. En outre, nous avons développé deux stratégies de fonctionnalisation via des réactions de couplage pallado-catalysées. Finalement nous avons synthétisé le motif imidazo[1,5-a]imidazole via la réaction de Groebke-Blackburn-Bienaymé (GBB). La potentialité de cette réaction a été exploitée dans des réactions decyclisation intramoléculaire! afin de préparer une nouvelle chimiothèque de composés polyhétérocycliques azotés. / The imidazo-imidazoles bicycles have received special attention among other nitrogen cycles due to their biologically interesting properties exploited in the medicine manufacturing. The imidazo-imidazole scaffold is one of the most representative nitrogen containing heterocycle, as it plays a significant role and possesses a major interest in drug synthesis and functionalization. In this work we report firstly a synthetic pathway to novel imidazo[1,2-a]imidazoles candidates for CKD inhibitors. Secondly we develop two strategies to prepareimidazo[1,5-a]imidazoles and their reactivity via pallado-catalyzed reactions. Finally, we disclose a fast and an efficient access to imidazo[1,5-a]imidazoles by using the Groebke-Blackburn-Bienaymé reaction (GBB), followed by a palladium catalysed intramolecular cyclization, affording thus new tetracyclic products with an elevated degree of molecular diversity.

La progression à travers le cycle cellulaire est assurée par l’activation séquentielle d’une série de complexes cycline-CDK. Les complexes cycline D-CDK4 assurent la progression au cours de la phase G1 du cycle cellulaire en phosphorylant les protéines « antioncogéniques » de la famille Rb. L’activation de la CDK4 nécessite son association à une cycline D et sa phosphorylation sur Thr172 par la CAK nucléaire (CDK activating kinase). Le rôle essentiel des protéines de la famille Cip/Kip dans la régulation de l’activité de ces complexes reste controversé. Les protéines de cette famille (comprenant p27 et p21) ont initialement été identifiées comme des inhibiteurs puissants des complexes cycline-CDK et comme les intermédiaires de l’action antimitogénique de différents signaux intra ou extra-cellulaires. Il a été proposé que la liaison de la p27 ou de la p21 aux complexes cycline D-CDK4 empêche leur phosphorylation activatrice par la CAK et leur activité pRb kinase. Cependant, l’observation que des complexes cycline D-CDK4 associés à p21/p27 possèdent une activité pRb kinase a donné naissance à une seconde hypothèse sur la régulation de ces complexes par la p27 ou la p21. Ces « inhibiteurs » ont été paradoxalement proposés comme facteurs nécessaires et suffisants d’assemblage et de localisation nucléaire des complexes cycline D-CDK4. Dans le modèle physiologiquement relevant des thyrocytes de chien en culture primaire, la mitogénèse dépendante de l’AMPc activée par la TSH diffère des cascades des facteurs de croissance puisqu’elle n’induit pas les cyclines D mais au contraire augmente l’accumulation de l’«inhibiteur» de CDK p27. L’AMPc stimule l’assemblage des complexes cycline D3-CDK4, leur translocation nucléaire et leur association à p27. Dans ce modèle, le TGF&61538; inhibe la mitogénèse dépendante de l’AMPc en inhibant la translocation nucléaire des complexes cycline D3-CDK4 et leur association à la p27.<p><p>Nous avons étudié l’activité catalytique et l’activation des complexes cycline D3-CDK4-p27 issus des thyrocytes de chien en culture primaire ou produits en cellules d’eucaryotes supérieurs (CHO et Sf9). Nous avons pu montrer que les complexes cycline D3-CDK4-p27 issus des thyrocytes de chien stimulés par la TSH présentent une activité pRb-kinase qui est inhibée par le TGF&61538; En outre, la production des complexes cycline D3-CDK4-p27 en cellules CHO ou Sf9 nous a permis de montrer que l’impact de la p27 sur l’activité catalytique des complexes cycline D3-CDK4 dépend de sa stoechiométrie de liaison à ces complexes. L’analyse du profil de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de la CDK4 issue de ces trois systèmes montre que la p27 n’empêche pas la phosphorylation activatrice de la CDK4, même aux concentrations de p27 qui empêchent l’activité pRb kinase du complexe cycline D3-CDK4. Nous avons également montré dans les cellules CHO que la p27 détermine la localisation nucléaire des complexes cycline D3-CDK4, ceux-ci étant relocalisés dans le cytoplasme par la transfection d’un mutant de la p27 dépourvu de son signal de localisation nucléaire. Ces résultats valident les observations réalisées par immunofluorescence dans les thyrocytes de chien dans lesquels nous avons mis en évidence une étroite corrélation au niveau des cellules individuelles stimulées par la TSH entre la translocation nucléaire de la CDK4 et l’apparition de la p27 nucléaire. Cette colocalisation est partiellement inhibée par le TGF&61538; Ces observations renforcent l’hypothèse d’un rôle de la p27 dans l’ancrage nucléaire des complexes cycline D3-CDK4. <p><p>Alors que la localisation de la CAK est considérée comme exclusivement nucléaire et son activité catalytique constitutive, nous avons pu montrer que la phosphorylation activatrice de la CDK4 associée à la cycline D3 n’est pas affectée par sa localisation sub-cellulaire et qu’elle est régulée par le TGF&61538; dans les thyrocytes de chien et par le sérum dans les cellules T98G indépendamment de l’association de la CDK4 à la p27. De plus, la phosphorylation de la CDK4 sur Thr172 dans les cellules T98G est stimulée par le sérum, alors que la phosphorylation activatrice de la CDK6, son homologue fonctionnel, ne l’est pas. La comparaison de la séquence de ces deux CDKs à proximité des Thr phosphorylées (Thr177 pour la CDK6) révèle, outre une forte similarité de séquence, une différence au niveau de l’acide aminé situé en aval de la thréonine :il s’agit d’une proline dans la CDK4 et d’une sérine dans la CDK6. La mutation P173S de la CDK4 abolit la phosphorylation sur Thr172 et l’activité de la CDK4 associée à la cycline D3 dans les cellules CHO, mais n’affecte pas la phosphorylation et l’activation de la CDK4 par la CAK recombinante in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que la/les CAKs régulée(s) responsables de l’activation de la CDK4 n’ont pas encore été identifiées et que la proline située en aval de la Thr172 de la CDK4 est essentielle pour sa phosphorylation activatrice et son activité pRb kinase.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Au sein de l’unité mixte de recherche 619 de l’Institut National de Recherche Agronomique, le groupe « Organogénèse du Fruit et Endoréduplication » étudie les acteurs moléculaires prenant part au contrôle du cycle cellulaire dans le fruit de tomate. L’objet de la présente thèse est l’étude de l’inhibiteur du cycle cellulaire Kip-Related Protein, et son rôle durant le développement du fruit. Identification de motifs protéiques fonctionnels chez l’Inhibiteur de Kinase Cycline-Dependent SlKRP1 chez Solanum lycopersicum : Leur rôle dans les interactions avec des partenaires du cycle cellulaire Les Kip-related proteins (KRPs) jouent un rôle majeur dans la régulation du cycle cellulaire. Il a été montré qu’ils inhibent les complexes CDK/Cyclin et ainsi bloquent la progression du cycle cellulaire. Malgré leur manque d’homologie avec leurs homologues animaux au delà de leur motif de liaison CDK/Cyclin, localisé à l’extrémité C-terminal de la protéine dans les séquences de plante, des études antérieurs ont montré la présence de motifs conservés spécifiques aux plantes chez certaines KRPs. Nous n’avons cependant que peu d’information concernant leur fonction. Nous montrons ici que les KRPs sont distribués en deux sous groupes phylogénétiques, et que chaque sous-groupe dispose de courts motifs spécifiques conservés. Les KRPs du sous-groupe 1 disposent ainsi de six motifs conservés entre eux. Utilisant SlKRP1, qui appartient au sous-groupe 1, nous avons identifié des motifs responsables de la localisation de la protéine et de ses interactions protéine-protéine. Nous montrons que le motif 2 est responsable de l’interaction avec CSN5, une sous-unité du complexe signalosome, et que le motif 5 a un effet redondant avec le motif 3 pour ce qui est de la localisation sub-cellulaire de la protéine. Nous montrons de plus que SlKRP1 est capable de guider SlCDKA1 et SlCycD3;1 vers le noyau, et ce même en l’absence du motif de liaison CDK/Cycline précédemment référencé. Ce nouveau site d’interaction est probablement localisé dans la partie centrale de la séquence de SlKRP1. Ces résultats apportent de nouveaux indices quant au rôle de la partie encore méconnue de cette protéine. La surexpression de SlKRP1 dans le mésocarpe de tomate détruit la proportionnalité entre endoréduplication et taille cellulaire Le fruit est un organe spécialisé résultant du développement de l’ovaire après pollinisation et fertilisation, et qui offre un environnement adéquat pour la maturation des graines et leur dispersion. De part leur importance en nutrition humaine et leur importance économique, les espèces à fruit charnu ont été le sujet d’étude développementales principalement orientée vers la formation de l’ovaire, la mise à fruit et la maturation du fruit. La phase de croissance du fruit a été beaucoup moins étudiée, bien que la division cellulaire et la croissance cellulaire prenant place durant cette période soient cruciales à la détermination de la taille finale du fruit, ainsi que de sa masse et sa forme. Le développement du mésocarpe du fruit de tomate se déroule par la succession d’une phase de division cellulaire suivie d’une phase d’expansion cellulaire associée à l’endoréduplication, menant à la formation de cellules géantes (jusqu’à 0,5mm) avec des niveaux de ploïdie pouvant atteindre 256C. Bien qu’une relation évidente entre endoréduplication et croissance cellulaire ait été montrée par de nombreux exemples chez les plantes, le rôle exact de l’endoréduplication n’a toujours pas été élucidé, étant donné que la plupart des expériences induisant une modification du niveau d’endoréduplication dans la plante affectaient aussi la division cellulaire. Nous avons étudié la cinétique du dévelopement du mésocarpe de tomate au niveau morphologique et cytologique et avons étudié l’effet de la diminution du niveau d’endoréduplication sur le dévelopement du fruit en sur-exprimant l’inhibiteur du cycle cellulaire Kip-Related Protein 1 (SlKRP1) spécifiquement dans les cellules en croissance du mésocarpe de tomate. Nous montrons une proportionnalité directe entre endoréduplication et taille cellulaire durant le développement normal du fruit, ce qui nous a permis de construire un modèle de développement du mésocarpe définissant l’épaisseur du péricarpe en ne prenant en compte que le nombre de divisions cellulaires et le nombre de tours d’endoréduplication. De façon surprenante, les mésocarpes de tomate affectés dans leur niveau d’endoréduplication par la sur-expression de SlKRP1 ne sont pas affectés au niveau de la taille des cellules ou du fruit, ni dans leur contenu métabolique. Nos résultats démontrent pour la première fois qu’alors que le niveau de ploïdie est étroitement lié avec la taille des cellules et du fruit, l’endoréduplication n’est pas responsable de la croissance cellulaire du mésocarpe de tomate. / Within the Joint Research Unit 619 of the National Institute of Agronomic Research (INRA), the group "Organogenesis of the Fruit and endoreduplication" examines the molecular players involved in cell cycle control in tomato fruit. The purpose of this thesis is the study of the cell cycle inhibitor Kip-Related Protein and its role during fruit development. Identification of protein motifs in the functional inhibitor of Cyclin-Dependent Kinase in Solanum lycopersicum SlKRP1: Their role in interactions with partners in the cell cycle The Kip-related proteins (KRPs) play a major role in the regulation of cell cycle. It has been shown to inhibit the CDK / Cyclin and thus block cell cycle progression. Despite their lack of homology with their counterparts in animals beyond their binding motif CDK / Cyclin, located at the C-terminal protein sequences in the plant, previous studies have shown the presence of conserved motifs plant specific in some KRPs, but there is little information about their function. We show here that the KRPs are distributed into two phylogenetic groups, and that each subgroup has specific short conserved motifs. The KRPs from subgroup 1 have six conserved motifs. Using SlKRP1, which belongs to subgroup 1, we have identified the motifs responsible for the localization of the protein and protein-protein interactions. We demonstrate that the pattern 2 is responsible for the interaction with CSN5, a subunit of the signalosome complex, and that the motif 5 is redundant with motif 3 with respect to the sub-cellular localization of the protein. We also show that SlKRP1 is capable of guiding SlCDKA1 and SlCycD3; 1 to the nucleus, even in the absence of CDK / cyclin binding motif previously referenced. This new site of interaction is probably located in the central part of the sequence of SlKRP1. These results provide new clues about the role of the little-known part of this protein. Overexpression of SlKRP1 in tomato mesocarp disrupts the proportionality between endoreduplication and cell size The fruit is a specialized organ which results from the ovary after pollination and fertilization, and provides a suitable environment for seed maturation and dispersal. Because of their importance in human nutrition and economic importance, fleshy fruit species have been the subject of study mainly focused on the developmental formation of the ovary, fruit set and fruit ripening. The stage of fruit growth has been much less studied, although cell division and cell growth taking place during this period are crucial to determining the final size of the fruit, as well as its mass and shape. The development of tomato fruit mesocarp occurs by the estate of a phase of cell division followed by a phase of cell expansion associated with endoreduplication, leading to the formation of giant cells (up to 0.5 mm) with ploidy levels of up to 256C. Although a clear relationship between endoreduplication and cell growth has been shown by many examples in plants, the exact role of endoreduplication has still not been elucidated, since most of the experiments leading to a change in the level of endoreduplication in plants also affected cell division. We studied the kinetics of the development of tomato mesocarp morphologically and cytologically and studied the effect of the reduced level of endoreduplication in the development of the fruit over-expressing the cell cycle inhibitor Kip-Related Protein 1 (SlKRP1) specifically in the growing cells of the tomato mesocarp. We show a direct proportionality between endoreduplication and cell size during normal development of the fruit, which allowed us to build a model for development of mesocarp defining the thickness of the pericarp by taking into account the number of cell divisions and the number of rounds of endoreduplication. Surprisingly, the tomato mesocarps affected in their level of endoreduplication by over-expression of SlKRP1 are not affected in terms of cell size and fruit, or on their metabolic content. Our results demonstrate for the first time that while the level of ploidy is closely linked with cell size and fruit, endoreduplication is not responsible for the cell growth of tomato mesocarp.

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L'ADN de chaque cellule est constamment soumis à des stress pouvant compromettre son intégrité. Les bris double-brins sont probablement les dommages les plus nocifs pour la cellule et peuvent être des sources de réarrangements chromosomiques majeurs et mener au cancer s’ils sont mal réparés. La recombinaison homologue et la jonction d’extrémités non-homologues (JENH) sont deux voies fondamentalement différentes utilisées pour réparer ce type de dommage. Or, les mécanismes régulant le choix entre ces deux voies pour la réparation des bris double-brins demeurent nébuleux. Le complexe Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) est le premier acteur à être recruté à ce type de bris où il contribue à la réparation par recombinaison homologue ou JENH. À l’intersection de ces deux voies, il est donc idéalement placé pour orienter le choix de réparation. Ce mémoire met en lumière deux systèmes distincts de phosphorylation du complexe MRX régulant spécifiquement le JENH. L’un dépend de la progression du cycle cellulaire et inhibe le JENH, tandis que l’autre requiert la présence de dommages à l’ADN et est nécessaire au JENH. Ensembles, nos résultats suggèrent que le complexe MRX intègre différents phospho-stimuli pour réguler le choix de la voie de réparation. / The genome of every cell is constantly subjected to stresses that could compromise its integrity. DNA double-strand breaks (DSB) are amongst the most damaging events for a cell and can lead to gross chromosomal rearrangements, cell death and cancer if improperly repaired. Homologous recombination and non-homologous end joining (NHEJ) are the main repair pathways responsible for the repair of DSBs. However, the mechanistic basis of both pathways is fundamentally different and the regulation of the choice between both for the repair of DSBs remains largely misunderstood. The Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) complex acts as a DSB first responder and contributes to repair by both homologous recombination and NHEJ. Being at the crossroads of both DSB repair pathways, the MRX complex is therefore in a convenient position to influence the repair choice. This thesis unravels two distinct phosphorylation systems modifying the MRX complex and specifically regulating repair by NHEJ. The first relies on cell cycle progression and inhibits NHEJ, while the second requires the presence of DNA damage and is necessary for efficient NHEJ. Together, our results suggest a model in which the MRX complex would act as an integrator of phospho-stimuli in order to regulate the DSB repair pathway choice.