Made available in DSpace on 2014-10-09T12:43:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06555.pdf: 4601344 bytes, checksum: d54da5711d592aac4fbdb3cbb1ac8e1a (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:26:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Resveratrol (3,4,5-trihidroxiestilbeno), um polifenol pertencente ao grupo de compostos denominados fitoalexinas, é sintetizado por uma ampla variedade de plantas, tais como as videiras, em resposta a infecções fúngicas e a exposição à radiação UV. Nos vinhos este composto está presente em elevadas concentrações, sendo considerado um dos constituintes com maior potencial antioxidante. Esta elevada capacidade de absorver os radicais livres presentes em diversos processos biológicos permite ao resveratrol previnir doenças cardiovasculares e diversos tipos de câncer. O principal objetivo do presente estudo foi determinar in vitro o efeito radioprotetor do resveratrol em cultura celular com auxílio dos testes de citotoxicidade do resveratrol (IC50%) e da dose letal 50% da radiação gama (DL50). Os estudos in vitro do nível de toxicidade do resveratrol, verificado pelo ensaio de citotoxicidade utilizando-se o método de incorporação do vermelho neutro, e da determinação da dose letal 50% (DL50) da radiação gama, oriunda de uma fonte de Cobalto-60 (Co-60), foram realizados em cultura de células da linhagem NCTC Clone 929 da ATCC. O IC50% do resveratrol foi de aproximadamente 50 M/L. A DL50 da radiação gama apresentou um valor de aproximadamente 354 Gy. Baseando-se nestes resultados biológicos foram realizados estudos do efeito radioprotetor do resveratrol nas mesmas condições experimentais, constatando-se que o resveratrol nas concentrações entre 12,5 M/L e 25 M/L apresentou um efeito radioprotetor mais acentuado. / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:35:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:03:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O câncer é uma doença de alta incidência e é considerado um problema de saúde pública no mundo todo. O resveratrol é um polifenol de defesa que tem a habilidade de inibir a carcinogênese em múltiplos estágios. Este polifenol é sintetizado por uma grande variedade de plantas em resposta a exposição à radiação ultravioleta (UV) ou também, pelo estresse mecânico produzido pela ação de patógenos, agentes químicos e físicos. As videiras são consideradas as plantas que têm uma capacidade elevada de produzir o resveratrol, portanto suco de uva e vinho, principalmente o vinho tinto são considerados uma boa fonte de resveratrol. Os efeitos protetores exercidos pelo resveratrol promovem efeitos como indução da resposta antiinflamatória, atividade antitumoral, prevenção ou inibição de doenças degenerativas, diminuição da incidência de doenças cardiovasculares, inibição da agregação plaquetária, entre outros. Assim, o resveratrol é considerado um protetor celular. Porém, em concentrações mais elevadas, o resveratrol promove o efeito contrário, sensibilizando as células a algum tipo de efeito, como por exemplo, o efeito da radiação ionizante. O objetivo desse trabalho foi estudar o efeito radiomodificador do resveratrol em cultura de células RD (rabdomiossarcoma humano) aplicando o teste do cometa para avaliação do dano e capacidade de reparo celular. Foi obtida a DL50 das células RD em 403 Gy e o índice de citotoxicidade do resveratrol (IC50%) nas células RD foi de 150 μM. A partir destes resultados foram definidas as doses de radiação gama (50 Gy e 100 Gy) e as concentrações de resveratrol (15 μM 30 μM 60 μM) que foram analisadas no trabalho. Foram evidenciados os efeitos do resveratrol como protetor celular na concentração de 15 μM e seu efeito citotóxico em 60 μM. Com a interação da radiação gama, a concentração de 60 μM não mostrou efeito radiossensibilizador estatisticamente significante. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:38:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:05:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 05680.pdf: 8681194 bytes, checksum: c738dd10c1a17a2b018e74273b788729 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:49:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:09:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Neste trabalho foi estudada a formação de membranas para obtenção de compostos dermo-epidérmicos. A porção dérmica foi desenvolvida utilizando-se mistura de polímeros sintéticos, o poli(álcool vinílico) - PVAl ou poli(vinilpirrolidona) – PVP, com polímero natural, a quitosana. As membranas foram reticuladas pela radiação g ou glutaraldeído. A porção epidérmica destas membranas foi formada por queratinócitos cultivados in vitro, os quais foram semeados sobre as membranas correspondentes e verificada sua interação. As membranas que melhor interagiram com os queratinócitos foram aquelas preparadas com quitosana pela reticulação com glutaraldeído, porém não satisfazendo as características mecânicas de manipulação. As membranas que possuíam as melhores características mecânicas, porém com moderada interação com os queratinócitos, foram as compostas de PVAl, liofilizada e intumescida com quitosana. Os componentes foram caracterizados isoladamente, bem como as membranas formadas pelos mesmos. O PVAl foi caracterizado quanto a sua dose gel e a quitosana quanto à determinação das constantes de Mark-Houwink, grau de acetilação e dissolução em diferentes valores de pH. As membranas foram caracterizadas quanto a sua cinética de intumescimento com água. Na membrana de PVAl com quitosana incorporada foi avaliada sua degradação in vitro, determinada sua cinética de intumescimento com a quitosana e estimado o tamanho do poro. As membranas de quitosana reticuladas com glutaraldeído foram caracterizadas quanto à cinética de intumescimento e verificado o possível desprendimento de glutaraldeído. As duas membranas caracterizadas isoladamente foram unidas para formação de uma única membrana, como a parte dérmica do composto, onde a membrana de PVAl incorporada com quitosana foi recoberta com a membrana de quitosana reticulada com glutaraldeído. Quitosanas de outras procedências foram avaliadas na interação com os queratinócitos. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2014-12-19T17:52:28Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-12-19T17:52:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A pele é o maior órgão do corpo humano e constitui a principal defesa do organismo contra agentes físicos e químicos, sendo também fundamental para evitar a perda de água por dessecação. Formada por três camadas distintas, mas complementares, sendo as duas principais denominadas derme e epiderme, contendo diferentes tipos celulares, como fibroblastos, queratinócitos, melanócitos, células de Merkel e células de Langerhans, sendo que estas últimas desempenham um papel fundamental na hipersensibilidade de contato. Devido à importância da manutenção da pele saudável para a vida humana, existe uma crescente necessidade da elaboração de substitutos de tecidos para o tratamento de feridos e doentes, assim como, há grande demanda de pele para testes químicos das áreas farmacêutica e cosmética. Outro fator de fundamental importância para o desenvolvimento de métodos alternativos in vitro, é a pressão mundial para que estes testes substituam os modelos animais. Esta abordagem vai de encontro aos novos conceitos de substituição, redução e refinamento na utilização de animais em estudos científicos, ditando o futuro da cultura celular e bioengenharia de tecidos. Graças ao grande desenvolvimento do cultivo celular e descoberta de que as células cultivadas podem ser reagrupadas de acordo com o delineamento experimental, se torna possível à criação de equivalentes dermoepidérmicos para estudos in vitro, como por exemplo, testes de cito e fototoxicidade ou avaliação da fase inicial da reação alérgica e processos de sensibilização da pele. Neste caso, se faz necessária a obtenção de grande quantidade de células de Langerhans imaturas. As células de Langerhans (CLs) são células dendríticas imaturas localizadas na epiderme e epitélio superficial que desempenham um papel central na imunidade da pele, agindo como verdadeiras sentinelas capazes de captar antígenos de contato. Desta forma, foram testados quatro diferentes protocolos para extração e criopreservação destas células, sendo ainda analisadas as suas características morfológicas e fenotípicas. Obtivemos resultados não expressivos quanto ao isolamento, pureza e marcação positiva para CD1a no Protocolo 2 (Expansor de Pele). Os Protocolo 1A (Coleta de Sobrenadante) e 3 (Epiderme + Gradiente de Ficoll Paque) ofereceram altos níveis de células marcadas positivamente para CD1a, apresentando a mesma qualidade de marcação. No entanto, o Protocolo 3 forneceu um maior número de células viáveis, e uma maior pureza da amostra, uma vez que só utiliza a epiderme para a obtenção da suspensão de células, o que o coloca como modelo a ser seguido em posteriores experimentos. Os métodos aqui apontados como mais promissores, podem ser reproduzidos em laboratórios de cultura celular convencionais, contribuindo para aumentar a reprodutibilidade e confiabilidade de resultados experimentais relativos às CLs. Da mesma forma, avaliamos a utilização dos equivalentes de pele humana para a realização de testes in vitro de cito e fototoxicidade, os quais podem de fato reduzir a utilização de modelos animais para identificação do perfil tóxico de uma substância ou de formulações mais complexas. / Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

<p>The aim of this study was to better understand the role of conditioned medium (CM) in Spodoptera frugiperda Sf9 insect cell proliferation and recombinant protein production using the baculovirus expression system.</p><p>CM was found to stimulate cell proliferation. Addition of CM and 10 kDa CM filtrate to an Sf9 culture decreased the lagphase and the maximum cell density was reached earlier than for cultures in fresh medium. The positive effect of 10 kDa CM filtrate showed that CM contains at least one small growth promoting factor. The effect was not eliminated by trypsin treatment. Addition of CM or 10 kDa CM filtrate to Sf9 cultures was found to have a negative effect on the recombinant protein production. The effect was thought to be indirect and most probably via the impact of CM on cell physiology. CM was also found to contain proteinase activity. The proteinase was identified as Sf9 cathepsin L. A proform with a molecular mass about 49 kDa and two active forms at about 39 and 22 kDa were found. The role of cathepsin L in Sf9 cultures is not yet clear. However, the knowledge of the presence of this proteinase in CM can be of great value for improving product quality and yield. Further, CM was found to have other properties as well: a concentrated fraction of CM exhibited strong antibacterial activity towards Bacillus megaterium and a weaker activity towards Escherichia coli. B. megaterium lysed rapidly after incubation in the CM fraction.</p><p>Repeated subculturing of Sf9 cells provoked a switch in growth kinetics. After 30-45 passages the cells started to proliferate earlier after inoculation and addition of CM had no longer a growth stimulating effect. However, CM still stimulated growth of a culture with low passage (LP) number (up to 45 passages). High passage cells (HP cells, over 100 passages) displayed a shorter lagphase than LP cells and the culture reached the maximum cell density 24-48 h earlier. Cell cycle analysis showed that the Sf9 cells were transiently synchronised in the G2/M phase 10 h after inoculation, before proliferation was initiated. This synchronisation was more pronounced for HP cells than for LP cells, which correlated to a higher recombinant protein production in baculovirus infected HP cells than in LP cells. Synchronisation of cells in G2/M by yeastolate-limitation before infection with baculoviruses suggested that the degree of synchronisation is connected to the cell density dependent decrease in recombinant protein production of Sf9 cultures.</p>

Este estudo apresenta o desenvolvimento e validação de uma nova abordagem para a avaliação do cálcio intracelular em culturas de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC-CM - do inglês human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes) que pode ser aplicada para avaliar o efeito de drogas no acoplamento excitação-contração. O método consiste na estimulação elétrica e medição conjunta da fluorescência de forma automatizada e foi viabilizado a partir da inclusão de um sistema de estimulação elétrica em um leitor de ELISA (do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Um estimulador eletrônico compacto foi projetado para operar junto a um leitor de placas gerando pulsos quadrados monofásicos com duração de 5 ms e campo elétrico de 8 Vcm-1 aplicados por microeletrodos metálicos de platina-irídio em células em cultura. Uma placa de cultura normalmente utilizada em leitor de placas foi modificada para permitir a colocação do estimulador e dos eletrodos. A intensidade de fluorescência do cálcio intracelular foi avaliada utilizando um leitor de ELISA durante a estimulação elétrica em culturas de células marcadas com o indicador de Ca2+ Fluo-4 AM. A estimulação elétrica das células resultou em contrações regulares nas frequências de 0,1 Hz; 0,2 Hz; 0,3 Hz e 0,5 Hz induzidas pelo estimulador. Parâmetros dos transientes de cálcio foram estudados após a exposição de culturas de células ao Verapamil (0,05; 0,5 e 5,0 µM), a amplitude e a inclinação máxima da fase de subida foram progressivamente reduzidas com doses crescentes da droga. Os dados obtidos demonstraram que o método apresentado permite a avaliação automatizada de transientes de cálcio durante a estimulação elétrica de culturas de hiPSC-CM utilizando o sistema de estimulação em um leitor de ELISA. Esses resultados validaram a aplicabilidade do sistema ao estudo das alterações da dinâmica do cálcio intracelular induzidas por drogas em células sob estimulação elétrica. O sistema de avaliação automatizada desenvolvido pode ser ampliado para realizar a triagem de alto rendimento em bibliotecas de compostos que tem como alvo o acoplamento excitação-contração em células cardíacas humanas in vitro. / This study presents the development and validation of a new approach for the evaluation of intracellular calcium in cultures of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM), which can be applied to evaluate the effect of drugs on excitation-contraction coupling. The method consists of electrical stimulation and joint measurement of fluorescence in an automated manner and was made possible by the inclusion of an electrical stimulation system in an ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). A compact electronic stimulator was designed to operate inside a plate reader generating monophasic square pulses with duration of 5 ms and electric field of 8 Vcm-1 applied by platinum-iridium metal microelectrodes to cells in culture. A culture plate used in a plate reader was modified to allow placement of the stimulator and electrodes. Fluorescence intensity of intracellular calcium was measured during electrical stimulation of cell cultures loaded with Ca2+ Fluo-4 AM indicator using a plate reader. The electrical stimulation of the cells generated regularly spaced contractions following the pace of the stimulator at the frequencies of 0.1 Hz, 0.2 Hz, 0.3 Hz and 0.5 Hz. Transient profile parameters were studied after treating cell cultures with Verapamil (0.05, 0.5 and 5.0 µM) the amplitude and the maximum slope of rising phase were progressively reduced with increasing verapamil doses. The data obtained demonstrated that the method presented allows the automated evaluation of calcium transients during the electrical stimulation of hiPSC-CM cultures using the stimulation system in an ELISA reader. These results demonstrated the applicability of the system to the study of changes in the intracellular calcium dynamics induced by drugs in electrically stimulated cells. The system developed is amenable to scaling thus allowing high content automated drug library screening for compounds that target the excitationcontraction coupling in human heart cells in vitro.

O Adenoma adrenocortical é frequente em adultos, já o carcinoma é raro e agressivo. Mesmo com critérios padronizados, ainda há dificuldade para diferenciar esses tumores, sendo necessário o estudo de marcadores eficientes na detecção e diferenciação. Por serem raros e com diversas manifestações clínicas, culturas in vitro pode ser uma ferramenta para o estudo de processos que envolvem a doença. Foi realizada a caracterização molecular e funcional de culturas de células de tumores de pacientes. Resultados de PCR Array não mostraram um padrão que diferenciasse as culturas em função dos diagnósticos. Desta análise, 7 oncogenes apresentaram maior expressão e 9 supressores de tumor apresentaram baixa expressão nas culturas. WWOX, FHIT e TP73 foram validados por qPCR e a sugestiva interação entre esses fatores nos tumores adrenocorticais merecem futuras investigações. O potencial funcional das culturas T83-ACC, T36-REC e T7-ACA(P) foram evidenciados, e mostraram que podem ser bons modelos para estudo da ação de hormônios e seus mecanismos. / The adrenocortical adenoma is common in adults, since carcinoma is rare and aggressive. Even with standardized scores, it is still difficult to differentiate these tumors, the study of efficient markers in the detection and differentiation is necessary. Because they are rare and diverse clinical manifestations in vitro cultures can be a tool for the study of disease processes that involve. Molecular and functional characterization of cultured tumor cells of patients was conducted. PCR Array results did not show a pattern that differentiates cultures on the basis of diagnoses. This analysis showed higher expression 7 oncogenes and tumor suppressors 9 showed low expression in cultures. WWOX, FHIT and TP73 were validated by qPCR and suggestive interaction between these factors in adrenocortical tumors deserve further investigation. The functional potential of T83-ACC, T36-REC and T7-ACA(P) cell cultures were found, and shown confirm that they can be good models for studying the action of hormones and their mechanisms.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Até a década de 1990 acreditava-se que o DNA era a única molécula alvo das radiações ionizantes. Mas algumas observações questionaram esta teoria. Em 1992 o efeito bystander, em português, efeito espectador, foi descrito por Nagasawa e Little. Este efeito é responsável por uma série de respostas como morte, instabilidade cromossômica ou outras anormalidades que ocorrem em células não irradiadas, que entraram em contato com células irradiadas ou meio irradiado a partir de células irradiadas. Entender o efeito bystander pode ter consequências importantes para a terapia e estudos do risco às exposições de baixas doses de radiação ionizante. Organismos vivos são compostos de milhões de células que, juntas, executam tarefas de grande complexidade. Apesar de cada célula ter uma estrutura interna que obedece às leis da bioquímica, é a interação entre as células que gera uma gama de diferentes fenômenos. Os modelos computacionais buscam soluções elegantes para simular a natureza. Neste trabalho, desenvolvemos um modelo computacional para simular o efeito bystander das radiações ionizantes em culturas celulares. Este modelo computacional é um autômato celular bidimensional, consistindo de duas redes sobrepostas, onde a primeira representa a cultura de células, e a segunda, o meio no qual as células são incorporadas. O modelo computacional descreve o comportamento do efeito bystander para diferentes configurações e densidade de células onde diferentes níveis de sinais são liberados pelas células irradiadas no meio. O efeito de re-emissão de sinais também foi introduzido no modelo. A partir dos dados das simulações foram obtidas equações capazes de antever os resultados experimentais. Os resultados obtidos a partir do modelo computacional e do ajuste matemático mostraram-se em excelente concordância com dados experimentais disponíveis na literatura. Observou-se que há dois pontos de inflexão nas curvas de dose-resposta no regime de baixa dose que podem representar uma adaptabilidade da cultura celular à radiação ionizante, transformando-a mais ou menos rádio resistente. / Until the 1990s it was believed that the DNA was the only target molecule of ionizing radiation. But some observations have questioned this theory. In 1992, the bystander effect was described by Nagasawa and Little. This effect is responsible for a series of answers as death, chromosomal instability or other abnormalities that occur in non-irradiated cells, which get in contact with irradiated or irradiated medium from irradiated cells. Understanding the bystander effect may have important consequences for therapy and exposure risk studies to low doses of ionizing radiation. Living organisms are composed of millions of cells that together perform tasks of great complexity. Although each cell has an internal structure that obeys the biochemistry laws, it is the interaction between the cells that generate a range of different phenomena. Mathematical models seek elegant solutions to simulate nature. In this work, we developed a computer model to simulate the bystander effect of ionizing radiation in cell cultures. This computational model is a two-dimensional cellular automata, consisting of two overlapping networks, where the first represents the cells culture and the second, the medium in which cells are embedded. The computational model describes the behavior of the bystander effect for different configurations and cells density where different signal levels are released by cells irradiated in the medium. The signals re-emission effect was also introduced in this model. From the simulations data, equations capable of predicting the experimental results were obtained. The results obtained from the computational model and the mathematical model are in excellent agreement with experimental data available in the literature. It was observed that there are two inflection points in the dose-response curves in the low dose regime and they may represent a cell culture adaptability to ionizing radiation by transforming it into more or less radio-resistant.