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Les vaccins à base de cellules dendritiques (DCs) constituent une avenue très populaire en immunothérapie du cancer. Alors que ces cellules peuvent présenter des peptides exogènes ajoutés au milieu, l’efficacité de chargement de ces peptides au le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II est limitée. En effet, la majorité des molécules du CMH II à la surface des DCs sont très stable et l’échange de peptide spontané est minime. Confinée aux vésicules endosomales, HLA-DM (DM) retire les peptides des molécules du CMH II en plus de leur accorder une conformation réceptive au chargement de peptides. Il est possible, cependant, de muter le signal de rétention de DM de façon à ce que la protéine s’accumule en surface. Nous avons émis l’hypothèse que ce mutant de DM (DMY) sera aussi fonctionnel à la surface que dans la voie endosomale et qu’il favorisera le chargement de peptides exogènes aux DCs. Nous avons utilisé un vecteur adénoviral pour exprimer DMY dans des DCs et avons montrer que la molécule augmente le chargement de peptides. L’augmentation du chargement peptidique par DMY est autant qualitatif que quantitatif. DMY améliore la réponse T auxiliaire (Th) du coté Th1, ce qui favorise l’immunité anti-cancer. Du côté qualitatif, le chargement de peptides résulte en des complexes peptide-CMHII (pCMH) d’une conformation supérieure (conformère). Ce conformère (Type A) est le préféré pour la vaccination et DMY édite avec succès les complexes pCMH à la surface en éliminant ceux de type B, lesquels sont indésirables. La fonction de DM est régulée par HLA-DO (DO). Ce dernier inhibe l’habilité de DM à échanger le peptide CLIP (peptide dérivée de la chaîne invariante) en fonction du pH, donc dans les endosomes tardifs. Mes résultats indiquent que la surexpression de DO influence la présentation des superantigènes (SAgs) dépendants de la nature du peptide. Il est probable que DO améliore indirectement la liaison de ces SAgs au pCMH dû à l’accumulation de complexe CLIP-CMH, d’autant plus qu’il neutralise la polarisation Th2 normalement observée par CLIP. Ensemble, ces résultats indiquent que DMY est un outil intéressant pour renforcer le chargement de peptides exogènes sur les DCs et ainsi générer des vaccins efficaces. Un effet inattendu de DO sur la présentation de certains SAgs a aussi été observé. Davantage de recherche est nécessaire afin de résoudre comment DMY et DO influence la polarisation des lymphocytes T auxiliaires. Cela conduira à une meilleure compréhension de la présentation antigénique et de son étroite collaboration avec le système immunitaire. / Dendritic cell peptide-based vaccines are the most common immunotherapy approach in cancer therapy. While, in principle, dendritic cells (DCs) could be loaded efficiently by exogenously added tumor peptides, their loading efficacy is severely reduced due to low number of peptide-receptive MHC II on cell surface. Most surface MHC II molecules are either occupied by endogenous peptides or are inactive due to a conformation that is not receptive for free peptides. In MHC II antigen presentation pathway, HLA-DM (DM) in acidic endosomal vesicles removes the self-peptides and grants a peptide receptive conformation to MHC II. Mutating of an intracellular sorting motif in DM, renders its accumulation on cell surface. We hypothesized that the mutant DM (DMY) is functional on cell surface and can generate peptide receptive MHC II on surface of DCs for exogenous peptide loading. By using an adenoviral vector that expresses DMY, we found that DMY is functional on surface of DCs. DMY supplied peptide receptive MHC II on surface of DCs and improved exogenous peptide loading. The improvement of peptide loading by DMY is both quantitative and qualitative. DMY improves helper T cell (Th) response in Th1 direction that favors anti-cancer immunity. The qualitative improvement of peptide loading extends to loading of superior conformational isomer (conformer) of peptide-MHC complexes. This superior conformer (type A) is the favourite type for vaccination approaches and DMY successfully edits peptide-MHC conformers on cell surface level by eliminating undesirable one (type B). Function of DM is regulated by HLA-DO (DO) and it is well accepted that in acidic pH of late endosomes, DO inhibits function of DM by preventing removal of class II associated invariant chain peptide (CLIP) from peptide binding groove of MHC II. My results indicate that DO overexpression, changes binding of peptide-dependent superantigens to MHC II molecules. Superantigens (SAgs) are small microbial proteins that bind out side peptide binding groove of MHC II. DO probably enhances binding of peptide-dependent SAgs by forcing the accumulation of CLIP on the cell surface of antigen presenting cells. DO also neutralizes Th2 polarization by CLIP. Collectively, these results indicate that DMY is a valuable tool for improvement of exogenous peptide loading in DCs vaccines. An unnoticed effect of DO on SAgs binding was also recognized. Further investigations are needed to clarify the mechanisms by which, DMY and DO influence Th polarization. This would provide a better understanding of antigen presentation pathway and its interaction with immune system.

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Les microtubules sont des éléments dynamiques du cytosquelette qui contrôlent à la fois l’organisation du cytoplasme, la polarité, la migration et la division cellulaire. Notre laboratoire a précédemment montré que la kinase de stress JNK (c-Jun NH2-terminal Kinase) régule la dynamique des microtubules dans les cellules épithéliales de mammifères, en augmentant les vitesses de polymérisation, ainsi que les fréquences de sauvetage (transition vers une phase de repolymérisation). Alors que certaines protéines neuronales capables de réguler la dynamique des microtubules ont été identifiées comme des substrats de JNK, leurs équivalents dans les cellules épithéliales sont largement méconnus. Dans le but de comprendre comment JNK module la dynamique des microtubules dans les cellules épithéliales de mammifère, nous avons étudié deux substrats potentiels de JNK : la -tubuline et le facteur de sauvetage CLIP-170. Nous avons bien mis en évidence in vitro, une phosphorylation de la -tubuline par JNK sur une thréonine non-consensus, mais cette phosphorylation n’a pas été retrouvée dans les cellules HeLa, suggérant que la -tubuline n’est pas un substrat naturel de JNK in vivo. Nous avons mis en évidence par ailleurs que CLIP-170 est un nouveau substrat de JNK. Dans les cellules épithéliales, JNK activée phosphoryle trois résidus (Thr25, Thr45 et Ser147) situés dans la partie N-terminale de CLIP-170 de part et d’autre du premier domaine CAP-Gly qui est nécessaire pour l’interaction avec les microtubules. Ces acides aminés présentent des différences aussi bien dans leur phosphorylation basale que dans leurs cinétiques de phosphorylation par JNK sous divers stress. De plus, nous avons trouvé que dans différentes cellules épithéliales, la phosphorylation de ces sites est conservée. In vitro, ces résidus sont directement phosphorylés par JNK, préférentiellement quand le domaine N-terminal de CLIP-170 lie la tubuline. De plus, l’expression de mutants de CLIP-170 phospho-mimétiques et non-phosphorylables a montré que la phosphorylation de chaque site augmente la fréquence des sauvetages microtubulaires. Cette modulation n’est pas corrélée à une augmentation de la capacité de CLIP-170 à former des comètes aux extrémités plus en croissance ou à être retenue aux croissements microtubulaires, qui sont des sites de sauvetage potentiels.Ce travail a permis de décrire les premières phosphorylations de CLIP-170 qui stimulent sa fonction de sauvetage in vivo. Il souligne par ailleurs la complexité des mécanismes de sauvetage, qui demeurent un aspect encore énigmatique de l’instabilité dynamique des microtubules. L’activité de JNK sur CLIP-170 ne permet d’expliquer qu’une partie des effets de la kinase sur la dynamique des microtubules, aussi la recherche d’autres protéines cibles de JNK pouvant réguler notamment leur vitesse de polymérisation, reste à entreprendre. / Microtubules are dynamic cytoskeleton elements, which control cytoplasm organization, cell polarity, migration and division. Our laboratory has previously shown that the stress kinase JNK (c-Jun NH2-terminal Kinase) regulates microtubule dynamics in mammalian epithelial cells, by increasing their growth rates, and their rescue frequencies (transition towards phases of repolymerization). While several neuronal proteins regulating microtubule dynamics have been identified as JNK substrates, their counterparts in epithelial cells are largely unknown. With the aim to understand how JNK modulates microtubule dynamics in mammalian epithelial cells, we studied two putative substrates of JNK: -tubulin and the rescue factor CLIP-170. Regarding -tubulin, using an in vitro kinase assay, we found that a non-consensus threonine is actually phosphorylated by JNK, but we were not able to find this phosphorylation in HeLa cells, suggesting that -tubulin is not a natural JNK substrate. In parallel, we found that CLIP-170 is a new substrate of JNK in epithelial cells. Activated JNK phosphorylates three residues (Thr25, Thr45 and Ser147) located in the N-terminal part of CLIP-170, on each side of the first CAP-Gly domain, which is required for CLIP-170 interaction with microtubules. These residues exhibit differences in their level of basal phosphorylation and their kinetics of phosphorylation by JNK under various stresses. Moreover, we found that in different epithelial cells, the phosphorylation of these sites is conserved. Using an in vitro kinase assay, we found that all these residues are directly phosphorylated by JNK, preferentially when the N-terminal domain of CLIP-170 binds tubulin. Furthermore, using phospho-mimetic and non-phosphorylatable CLIP-170 mutants in epithelial cells, we revealed that the phosphorylation of each site increases microtubule rescues. Such modulation operates without increasing CLIP-170 capability to form comets at the microtubule growing plus ends or to accumulate at microtubule crossings, which are potential rescue sites.This work described the first phosphorylations that enhance CLIP-170 rescue factor function in vivo. It also points out to which extent rescue mechanisms are complex and remain an elusive aspect of dynamic instability. JNK-mediated phosphorylation of CLIP-170 only partly explains the kinase effects on microtubule dynamics. Therefore, identifying other JNK targets that may regulate microtubule polymerization rate, remains to be addressed.

Les microtubules (MT) sont des structures dynamiques contrôlant divers aspects essentiels de l'architecture<br />cellulaire. En particulier, les bouts plus des MT (bouts +) sont capables d'accumuler des protéines spécifiques jouant un rôle dans le contrôle de la dynamique microtubulaire et dans l'interaction des MT avec le cortex cellulaire. Ces interactions sont notamment décisives pour le positionnement correct du fuseau mitotique. La description des mécanismes permettant l'accumulation de protéines aux bouts + est donc importante pour la compréhension des fonctions microtubulaires.<br />La tyrosine C-terminale de la tubuline α est cruciale pour l'interaction de protéines à domaine CAP-Gly avec les bouts +. En effet, CLIP-170 et son homologue de S.cerevisiae Bik1p se lient moins bien aux bouts + des MT dépourvus de tyrosine C-terminale (MT Glu).<br />Dans ce travail de thèse, nous avons étudié les perturbations associées au déficit de liaison de Bik1p aux bouts + des MT Glu dans S. cerevisiae.<br />Les modèles actuels proposent que Bik1p est amenée aux bouts + par son association avec la kinésine Kip2p. La dynéine (Dyn1p) est alors recrutée par Bik1p aux bouts + pour être ciblée vers le cortex. Nous montrons<br />que, dans des levures n'exprimant que de la tubuline détyrosinée (souche tub1-Glu), Kip2p et Dyn1p sont<br />correctement associées aux bouts +, malgré le déficit de liaison de Bik1p. Nous proposons que, dans les cellules<br />sauvages, le complexe Kip2p/Bik1p transporte Dyn1p le long des MT vers les bouts +. Kip2, Bik1p et Dyn1p<br />s'associent alors aux bouts + de façon indépendante.<br />De plus, nous montrons que des formes constitutionnellement actives de la petite protéine G Rho1p favorisent l'association de Bik1p avec les bouts +. Ces données seront importantes pour comprendre le rôle des Rho GTPases dans la régulation des MT, notamment dans la migration cellulaire.<br />L'ensemble de ce travail suggère de nouveaux modèles pour la formation et la fonction des complexes protéiques associés aux bouts +.<br />Finalement, nous avons recherché de manière systématique les mutations qui, associées avec la mutation tub1-Glu, sont létales chez la levure (létalité synthétique). Ce crible a identifié des composants participant à la formation de la membrane et de la paroi cellulaire. Ces gènes pourraient être impliqués, au niveau cortical, dans la mise en place des interactions des microtubules avec le cortex, et montrent l'importance de la tyrosine C-terminale de la tubuline α dans cette fonction.

La CLIP-170 (Cytoplasmic Linker Protein of 170 kDa) est requise, in vitro, pour l'établissement d'un lien statique entre les endosomes et les microtubules (MTs). Elle se localise, in vivo, aux bouts « plus » des MTs en croissance et semble participer ainsi à la capture de ces derniers au cortex cellulaire et aux kinétochores. Elle contribue au contrôle de la dynamique des MTs et semble aussi recruter le complexe moteur dynéine cytoplasmique/dynactine sur les extrémités « plus » des MTs, via son domaine carboxy-terminal. La CLIP-170 s'associe également aux kinétochores d'une façon dépendante du complexe dynéine/dynactine et de son domaine C-terminal. Ce domaine C-terminal contient deux motifs de type « doigt de zinc » (proximal et distal) probablement impliqués dans des interactions avec d'autres protéines.<br />Nous rapportons ici la démonstration d'une interaction directe entre la CLIP-170 et LIS1, une protéine capable, par ailleurs, d'interagir directement avec le complexe dynéine/dynactine. LIS1 est mutée chez de nombreux patients atteints d'une lissencéphalie de type I et semble jouer le rôle de co-facteur activateur de la dynéine cytoplasmique. Nous avons montré que cette interaction dépendait du doigt de zinc distal de la CLIP-170 et nous avons apporté des éléments indiquant une possible régulation de cette interaction par phosphorylation.<br />L'étude des fonctions cellulaires potentielles de cette interaction nous a permis de mettre en évidence un enrichissement de LIS1 aux extrémités « plus » des MTs. Elle a fourni des éléments substantiels laissant supposer que cette localisation, comme celle de la dynactine au même endroit, était dépendante du domaine C-terminal de la CLIP-170. Par ailleurs, nous avons démontré que la localisation de la CLIP-170 sur le kinétochore dépendait de son domaine d'interaction avec LIS1, et que le recrutement de LIS1 au même site dépendait du complexe dynéine/dynactine. L'ensemble de ces données suggère que LIS1 constitue un adaptateur entre la CLIP-170 et le complexe moteur dynéine/dynactine.<br />Parallèlement, nous avons initié l'étude de protéines LIS1 qui présentent chacune une mutation ponctuelle dans diverses régions conservées. Ces mutations ponctuelles ont été découvertes chez des patients atteints d'une lissencéphalie de type I plus ou moins sévère. Par des approches biochimiques, moléculaires et cellulaires, nous avons montré que, selon la sévérité de la maladie, les différentes propriétés de LIS1 (repliement, stabilité, localisations sub-cellulaires, interaction avec ses partenaires et liaison aux MTs) étaient plus ou moins affectées. À l'occasion de cette étude, nous avons également identifié les domaines de LIS1 impliqués dans l'interaction avec les MTs et d'autres partenaires comme les sous-unités catalytiques du PAFAH(I) (Platelet-Activating Factor Acétylhydrolase).

<p>Transcatheter Arterial Embolization (TAE) is a method in which a catheter is inserted into an artery under fluoroscopy guidance. By using material that creates a thrombus, inserted through the catheter, the artery can be occluded and the bleeding stopped.</p><p>Endoscopy is the treatment of choice in upper gastrointestinal (GI) bleeding, but 10% to 30% of patients rebleed and needs other treatment options. Post Partum Hemorrhage (PPH) may evolve rapidly and can become life threatening. Obstetrical treatment will manage most cases, but in some cases emergency surgery is needed and in the worst case hysterectomy.</p><p>The primary aim of this thesis was to evaluate the clinical usefulness, improve the TAE technique and compare the outcome of TAE with surgery used as “salvage therapy” in patients with upper GI bleeding. Evaluate TAE technique and the long-term effect on the menstrual cycle and fertility in severe PPH.</p><p>To evaluate the clinical usefulness 13 patients were treated with TAE after endoscopic treatment failure and 5 were treated for recurrent hemorrhage after emergency surgery. </p><p>The clinical outcome and mortality rate of 40 patients treated with TAE was compared with 51 patients treated with surgery of upper GI bleedings. </p><p>In 13 patients the ulcer was marked with placement of a metallic clip at endoscopy to be able to locate the exact site of the bleeding ulcer during the TAE procedure.</p><p>A retrospective study of 20 patients with severe PPH treated with bilateral TAE of the uterine artery was performed. </p><p>TAE was found to be effective and an alternative to emergency surgery for control of massive upper GI bleeding. The 30-day mortality was lower in the TAE group (3%) compared to the surgical group (14%). </p><p>By marking the bleeding ulcer at endoscopy using a metallic clip the site of bleeding could be identified on angiography without extravasation of contrast media.</p><p>No major impact on fertility or menstruation cycle was found in patients treated with TAE in PPH. TAE in PPH is safe and have no major long-term side effect. By using TAE in PPH hysterectomy can be avoided.</p>

Transcatheter Arterial Embolization (TAE) is a method in which a catheter is inserted into an artery under fluoroscopy guidance. By using material that creates a thrombus, inserted through the catheter, the artery can be occluded and the bleeding stopped. Endoscopy is the treatment of choice in upper gastrointestinal (GI) bleeding, but 10% to 30% of patients rebleed and needs other treatment options. Post Partum Hemorrhage (PPH) may evolve rapidly and can become life threatening. Obstetrical treatment will manage most cases, but in some cases emergency surgery is needed and in the worst case hysterectomy. The primary aim of this thesis was to evaluate the clinical usefulness, improve the TAE technique and compare the outcome of TAE with surgery used as “salvage therapy” in patients with upper GI bleeding. Evaluate TAE technique and the long-term effect on the menstrual cycle and fertility in severe PPH. To evaluate the clinical usefulness 13 patients were treated with TAE after endoscopic treatment failure and 5 were treated for recurrent hemorrhage after emergency surgery. The clinical outcome and mortality rate of 40 patients treated with TAE was compared with 51 patients treated with surgery of upper GI bleedings. In 13 patients the ulcer was marked with placement of a metallic clip at endoscopy to be able to locate the exact site of the bleeding ulcer during the TAE procedure. A retrospective study of 20 patients with severe PPH treated with bilateral TAE of the uterine artery was performed. TAE was found to be effective and an alternative to emergency surgery for control of massive upper GI bleeding. The 30-day mortality was lower in the TAE group (3%) compared to the surgical group (14%). By marking the bleeding ulcer at endoscopy using a metallic clip the site of bleeding could be identified on angiography without extravasation of contrast media. No major impact on fertility or menstruation cycle was found in patients treated with TAE in PPH. TAE in PPH is safe and have no major long-term side effect. By using TAE in PPH hysterectomy can be avoided.

This research achieves two main goals: First it proposes a set of extensions to the existing Opencast Matterhorn lecture video capture system, which should enhance its effectiveness and enable the collection of fine-grained datasets for further research. These extensions allow users to quickly and easily create, find, tag, annotate, and share `clipshows' of their video recorded classes both publicly and privately. Second, the tracking data generated when users create or view the clipshows using these extensions are used to analyze the efficacy of the system.