Doctor of Philosophy / Department of Biochemistry / Dolores J. Takemoto / The avascular lens tissue depends on the gap junction channels to facilitate intercellular communication for supplying cells deep within the lens with nutrients and removing waste products of cellular metabolism. In the absence of the protein synthesis machinery in the inner lens fiber cells, the proper regulation of gap junction channels becomes extremely important as disturbance of the lens homeostasis can lead to cataract development. Phosphorylation of gap junction subunit connexin proteins has been shown to play an important channel-modulating role in a variety of tissue. Protein kinase C-[Gamma] (PKC[Gamma]) has been implicated in the phosphorylation of connexins in the lens. Here the role of PKC[Gamma] in the regulation of gap junction coupling in the mouse lens has been investigated. We have compared the properties of coupling in lenses from wild type (WT) and PKC[Gamma] knockout (KO) mice. Western blotting, confocal immunofluorescence microscopy, immunoprecipitation, RT-PCR and quantitative real time PCR were used to study gap junction protein and message expression; gap junction coupling conductance and pH gating were measured in intact lenses using impedance studies. PKC[Gamma]was found to regulate the amount and distribution of Cx43 in the lens. Gap junction coupling conductance in the differentiating fibers (DF) of PKC[Gamma] KO lenses was 34% larger than that of WT. In the mature fiber (MF), the effect was much larger with the KO lenses having an 82% increase in coupling over WT. Absence of PKC[Gamma] in the KO mice also caused abnormal persistence of nuclei in the typical nucleus-free region in the DF. These results suggest a major role for PKC[Gamma] in the regulation of gap junction expression and coupling in the normal lens mediated by phosphorylation of the lens connexins. This becomes very vital in the diabetic lenses which contain a depleted amount of PKC[Gamma] and people suffering from spinocerebellar ataxia type-14 (SCA14) who have a mutated inactive form of PKC[Gamma]. Prolonged exposure of lenses to oxidative stress in these patients can lead to cataract formation. In cultured human lens epithelial cells (HLECs), 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) stimulated the depletion of Cx43 protein level via PKC-mediated phosphorylation of Cx43. At the same time Cx46 protein and message levels were upregulated in response to TPA treatment. So, the PKC activator regulates Cx43 and Cx46 in opposing ways. The possible mitochondria localization of Cx46 reported here could help in finding the non-junctional roles for Cx46.

Master of Science / Department of Biochemistry / Dolores J. Takemoto / Spinocerebellar ataxia type 14 (SCA14) is a rare, autosomal dominant neurodegenerative disease caused by mutations in the gene encoding for protein kinase Cγ (PKCγ). These mutations affect the translocation and activation of the protein and are particularly damaging to the Purkinje cells of the cerebellum. This translocation and activation leads to the down regulation of gap junction activity by direct phosphorylation on the C-terminal tail of connexin proteins. This process is necessary in terminating the propagation of apoptotic signaling and is disrupted by SCA14-type mutations. Gap junctions allow the passive diffusion of small molecules from one adjoining cell to another. Gap junctions function as electrical synapses in neuronal tissue and are formed from connexin proteins. The connexin family of proteins contains approximately 20 members, each of which is expressed in a tissue dependent manner. One of the dominant connexin proteins expressed in Purkinje cells is connexin 57 (Cx57). Here, I have tested if Cx57 is regulated by PKCγ. This thesis shows that activation of PKC and PKCγ caused internalization of Cx57 gap junction plaques in HT-22 cell culture. PKC and PKCγ activation led to the phosphorylation of Cx57 primarily on serine residues. Furthermore, the expression of SCA14-type PKCγ led to increased sensitivity to oxidative stress, resulting decreased cell viability.

As células necessitam do contato com outras células e com a matriz extracelular, para a formação de tecidos. As junções gap são estreitos canais que conectam o citoplasma de células adjacentes, promovendo a passagem de íons orgânicos, aminoácidos, nucleotídeos e outros metabólitos. Estas junções são compostas por dois conexons ou hemicanais, que atravessam a membrana plasmática da célula a que pertencem, e são compostos por seis proteínas integrais de membrana denominadas conexinas (Cxs). A Cx43 é a mais expressa, e é fosforilada ao longo do ciclo de vida, sofrendo mudanças conformacionais, resultando em diferentes isoformas (P0, P1 e P2), apresentando propriedades distintas. A Cx43 apresenta-se distribuída em todo o rim adulto. A injúria renal aguda (IRA) é uma síndrome metabólica em que ocorre redução aguda da função renal e rápida diminuição da taxa de filtração glomerular, sendo hipóxia decorrente da isquemia sua causa principal. A restrição de oxigênio e nutrientes, e o acúmulo de metabólitos, resultam na injúria das células epiteliais tubulares. A depleção dos níveis de ATP, aumento nos níveis de cálcio intracelular, alterações na membrana e deformações no citoesqueleto caracterizam esta injúria. A reoxigenação tecidual atua como agressão adicional devido à liberação de radicais livres. Estudos sugerem que a ativação de hemicanais de Cx43, resultante da desfosforilação da proteína, durante depleção de ATP, esteja envolvida na IRA. Este trabalho verificou o envolvimento da Cx43 em modelo murino desta injúria, ocasionada por isquemia/reperfusão. Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6J. A isquemia foi induzida por clampeamento das artérias renais por 45 minutos. A reperfusão ocorreu durante 24 horas após cirurgia. Foram utilizados 6 animais por grupo (isquêmicos, reperfundidos e controle). Após sacrifício, fragmentos dos rins foram submetidos a ensaios de western blot, PCR em tempo real, imuno-histoquímica e imunofluorescência. O modelo experimental foi validado através da dosagem de uréia e creatinina plasmática. As análises estatísticas foram realizadas pela análise de variância (ANOVA), seguido do teste de Bonferroni. Observou-se aumento significativo dos níveis de uréia e creatinina nos animais isquêmicos e reperfundidos, em relação ao controle. A expressão gênica apresentou aumento significativo apenas nos rins de camundongos reperfundidos (1,9 vezes; P<0,01 vs controle). No western blot verificou-se aumento na quantidade da isoforma hiperfosforilada da Cx43 (P2) em rins isquêmicos (2,73 vezes; P<0,05 vs controle), com diminuição significativa nos reperfundidos (2,37 vezes; P<0,05 vs isquêmico). Nas isoformas menos fosforiladas (P1/P0), observou-se aumento nos rins isquêmicos (2,33 vezes; P<0,05 vs controle), com diminuição nos reperfundidos (10 vezes; P<0,01 vs isquêmico). Nos ensaios imuno-histológicos verificou-se diferentes localizações da Cx43 nas células epiteliais de túbulos corticais nos grupos comparados. Nos controles verificou-se distribuição difusa, e nos isquêmicos observou-se intensa marcação em superfície celular apical. Nos rins reperfundidos, a distribuição da Cx43 foi basolateral. As alterações observadas na expressão gênica, fosforilação protéica e distribuição da Cx43 nos rins foram semelhantes às mudanças observadas na isquemia cardíaca. Este estudo mostrou pela primeira vez a regulação da Cx43 em níveis transcricionais e pós-traducionais, e sua localização celular na IRA ocasionada por isquemia/reperfusão, indicando sua participação neste processo. / The cells require contact with other cells and the extracellular matrix for tissue formation. Gap junctions are narrow channels connecting the cytoplasm of two adjacent cells, promoting the passage of inorganic ions, amino acids, nucleotides and other metabolites. These junctions are composed of two conexons or hemichannels, crossing the cell plasma membrane where they belong, and consist of six integral membrane proteins called connexins (Cxs). The Cx43 is the most expressed, and is phosphorylated throughout the life cycle, undergoing conformational changes, resulting in different isoforms (P0, P1 and P2) that have different properties. The Cx43 is distributed throughout the adult kidney. The acute kidney injury (AKI) is a metabolic syndrome that occurs in acute reduction of renal function and rapid decline in glomerular filtration rate. Hypoxia resulting from ischemia is its principal cause. The restriction of oxygen and nutrients, and accumulation of metabolites, result in the injury of tubular epithelial cells. The depletion of ATP levels, increased levels of intracellular calcium, changes in the membrane and cytoskeleton deformation characterize this injury. Reoxygenation tissue acts as additional injury due to release of free radicals. Studies suggest that activation of Cx43 hemichannels, resulting from dephosphorylation of the protein during ATP depletion, is involved in the AKI. This study investigated the involvement of Cx43 in a murine model of this injury, caused by ischemia/ reperfusion. We used male mice of strain C57BL/6J. Ischemia was induced by clamping the renal arteries for 45 minutes. Reperfusion occurred 24 hours after surgery. We used six animals per group (ischemic, reperfused, and sham). After sacrifice, kidney fragments were tested for western blot, real-time PCR, immunohistochemistry and immunofluorescence. The levels of plasma urea and creatinine were measured to validate the experimental model. Statistical analysis was performed by analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni test. We observed significant increase in serum urea and creatinine in ischemic and reperfused animals compared to sham. Gene expression increased significantly only in the reperfused kidneys (1.9 fold, P <0.01 vs sham). The western blot showed an increase in the amount of hyperphosphorylated isoform of Cx43 (P2) in ischemic kidneys (2.73 times, P <0.05 vs sham), with significant reduction in reperfused (2.37 times, P <0 05 vs ischemic). In the less phosphorylated isoforms (P1/P0), we observed an increase in ischemic kidneys (2.33 times, P <0.05 vs sham), with a decrease in reperfused (10 times, P <0.01 vs ischemic). In immuno-histological tests we verified different locations of Cx43 in the epithelial cells of cortical tubules. In normal kidneys there was patchy distribution, while in ischemic there was intense staining in the apical cell surface. In the reperfused kidney, the distribution of Cx43 was basolateral. The changes in gene expression, protein phosphorylation and distribution of Cx43 in the kidney observed in this study were similar to changes observed in cardiac ischemia. This study showed for the first time the regulation of Cx43 in transcriptional and post-translational levels, and its cellular localization in acute renal failure caused by ischemia/reperfusion, indicating its involvement in this injury.

A circulação extracorpórea (CEC) substitui as funções do coração e pulmões durante o tempo principal da cirurgia cardíaca, permitindo que o cirurgião acesse o interior do órgão por longo período de tempo e assegurando a oxigenação dos tecidos e eliminação dos seus produtos finais. Entretanto, tal técnica não é utilizada rotineiramente em medicina veterinária devido aos elevados custos e também em decorrência das alterações deletérias que promove no organismo dos animais. Visando uma melhor compreensão das complicações decorrentes da CEC, possibilitando amenizá-las, aventou-se o estudo da conexina 43 (Cx43), proteína presente no miocárdio e responsável pela formação das junções intercelulares do tipo gap. O presente estudo avaliou cinco cães indenes, SRD, não submetidos à CEC, procedendo-se a colheita de amostras correspondentes à região do septo interventricular, átrios direito e esquerdo, ventrículos direito e esquerdo e posterior análise da Cx43 através da imunofluorescência, western blot e RT-PCR. Avaliou também cinco cães indenes, SRD, submetidos à toracotomia intercostal direita convencional e posterior instituição da CEC. Amostras de miocárdio foram colhidas em três distintos momentos, quais sejam: T0 (antes da CEC), T1 (após duas horas de CEC) e T2 (após uma hora de desmame da CEC), para verificar as possíveis alterações na (Cx43) decorrentes da CEC, pela técnica de imunofluorescência. Ao final do procedimento experimental, os animais foram sacrificados. Os resultados mostraram que nos animais indenes não operados, a Cx43 apresenta localização em todas as regiões estudadas, não apresentando diferença significativa com relação à expressão nas diferentes regiões. Porém, nos animais submetidos à CEC, a referida conexina apresentou-se diminuída. Por fim, concluímos que em cães a CEC por duas horas com uma hora de circulação espontânea é técnica exeqüível, porém determina sérias alterações clínicas e induz a processos patológicos. / Cardiopulmonary bypass (CPB) replaces the heart and lung function during the main period of cardiac surgery, and it allows the access of the surgeon inside the organ for a long time, ensuring tissue oxygenation and the elimination of end products. However, this procedure isn´t used as a routine in veterinary medicine because of the high costs, and besides it causes damage in the animal organism. In order to promote a better comprehension of the complications caused by CPB, and perhaps to assuage them, this work was designed to study the connexin 43 (Cx43), a protein present in myocardium which forms intercellular communications like gap junctions. To do so five health mongrel dogs not submitted to CPB were evaluated and tissue samples were taken from specific locals as ventricular septal, right and left atrium, right and left ventricle, to perform Cx43 analyses by immunofluorescence, western blot and RT-PCR. Were also studied others five health mongrel dogs submitted to a conventional right intercostal thoracotomy for CPB procedure. Samples of myocardium were taken in three different moments: T0 (before CPB), T1 (after two hours of CPB) and T2 (after one hour the end of CPB) to check possible alterations in Cx43 caused by CPB using immunofluorescence technique. The euthanasia of the animals was performed at the end of the experimental period. The results shown that in health animals not operated, the Cx43 is located in every studied local and there is no significant difference in the protein expression areas. Nevertheless, the CPB technique reduced the connexin expressions in the operated animals. Finally, we may conclude that the cardiopulmonary bypass for two hours and a spontaneous perfusion for one hour is a feasible procedure in dogs, but it determines serious clinical alterations and may induce pathophisyological process.

A neuroproteção é um dos tópicos mais relevantes aplicados à neurociência. As junções comunicantes (JC), formadas pelas conexinas (Cx) estão envolvidas na neurodegeneração após lesão. Estudos com animais KO apresentam resultados contraditórios sobre papel das JCs. O objetivo deste trabalho foi analisar o papel das Cxs a partir do trauma mecânico na retina, modelo que permite a visualização do foco, penumbra, e áreas adjacentes à lesão. Observamos regulação distinta das Cx36 e Cx43 durante a neurodegeneração. A Cx36 não se alterou e a Cx43 apresentou desorganização e aumento da imunorreatividade após 7 dias, concomitantemente com GFAP. Células amácrinas apoptóticas encontram-se acopladas a células vizinhas por Cx36. O papel funcional das JCs foi avaliado, utilizando bloqueadores, para verificar a viabilidade/morte de células. Carbenoxolone (CBX), reduziu o espalhamento da apoptose, após 4h, enquanto a quinina, teve o mesmo efeito após 1h. A distribuição de núcleos apoptóticos confirmou que a utilização de bloqueadores de JCs reduz a propagação da apoptose. A quinina, mas não o CBX, diminuiu a expressão de caspases iniciais e efetoras. O controle da permeabilidade de canais de JCs pode participar de estratégias de neuroproteção. / The neuroprotection stands out as one of the most pursued hot topics in applied neurosciences. The gap junctions (GJ), formed by connexin (Cx) are involved in neurodegeneration injury. Studies using KO animal models endowed apparently contradictory results in relation to the role of coupling in neuroprotection. The aim of this study was to analyze the role of Cx-mediated communication in focal lesion induced by mechanical trauma in the retina, a model that alow the visualization of the focus, penumbra and adjacent areas. We observed distinct regulation of Cx36 and Cx43 during neurodegeneration. The Cx36 did not change during the lesion progression and Cx43 showed disorganized pattern and upregulated after 7 days, the same as GFAP. Apoptotic amacrine cells are coupled with health neighborhood cells by Cx36. The functional role of GJ was evaluated using blockers to verify the viability/cell death. Carbenoxolone (CBX) reduced the spread of apoptosis after 4h while quinine had the same effect after 1h. The distribution of apoptotic nuclei confirmed that the use of GJ blockers reduced the propagation of apoptosis. Quinine, but not CBX, decreases initial and effector caspases expression. The control of GJ channels permeability can participate in neuroprotection strategies.

Atualmente, as pesquisas sobre a as células epiteliais biliares expressam uma grande quantidade de conexina 43. O presente estudo avaliou influência do genótipo de camundongos Cx 43 +/- ou Cx 43 +/+, sobre a hiperplasia de ductos biliares, após a ligação do ducto biliar comum (colédoco). Neste estudo, foram utilizados seis grupos de camundongos BALB/c fêmeas de ambos os genótipos, que foram submetidos à ligação do ducto biliar com fio de seda por meio de procedimento cirúrgico, sendo eutanasiados nos tempos de 48 horas, 7 e 14 dias. Aproveitando-se o campo microscópico, cinco estruturas hepáticas: hepatócitos, arteríolas, vênulas, ductos biliares e veia centrolobular foram quantificados para verificar a existência de possível diferença entre os genótipos. Observou-se na análise quantitativa, diferença significante somente quanto ao número de vasos sanguíneos entre os dois grupos, sendo que as outras estruturas hepáticas quantificadas não apresentaram diferenças significativas. A proliferação celular foi avaliada pela técnica western blot para a proteína PCNA (Proliferation Cell Nuclear Antigen), somente dos grupos de 48 horas pós-cirúrgico, quando ocorre o pico de proliferação. Quanto à análise quantitativa do western blot, não houve diferenças significativas quanto ao genótipo. Já na das bandas protéicas, observou-se maior concentração nos camundongos controle, indicando maior número de células em divisão. / The goal in this study was evidence, after duct biliar common ligation (coledoco), using mice geneticly modified with connection in one of the alels to connexin 43 (Cx 43+/-) and comparing them to the group control (Cx 43+/+), in order to find out the participation of this protein, even though the epithelials biliary cells express a big quantity of cx 43. The experimental outline were made up of three mice groups BALB/c females of different genotypes which were subdued to surgery procedure using a wire of silk 3.0 and euthanased in each 48 hours during 7 to 14 days. Also using the microscopic view the fives hepatics structures such as, hepatocites, arterioles, veins, bile ductules and centrelobular vein were quantified, trying to obtain possible differences among the genetypes and to do the qualification of protein concentration was used the western blot to PCNA in order to compare the cells divided in 48 hours. It has observed in the quantitative analysis, strong difference only in the blood vein number among the two groups, however the orders quantitative hepatics structures did not present strong differences. About the quantitative analysis related to western blot did not have strong differences in the genotype, and finally in the proteic staff it has observed bigger concentration in the mice control showing bigger number of cells in division.

A expressão da conexina 32 e 43 nas células gigantes trofoblásticas foi analisada em condições de cultura celular com e sem influência de hormônios sexuais. Placentônios bovinos foram coletados de vacas prenhes em abatedouro nos diferentes períodos gestacionais e divididos em três grupos, primeiro terço (I), segundo terço (II), terceiro terço (III) e transportados ao laboratório em condições assépticas à temperatura de 4ºC em solução de PBS com antibiótico. No laboratório as células foram isoladas e cultivadas em meio D-MEM com 10% SFB por cinco dias. As detecções das conexinas 32 e 43 foram realizadas através de munofluorescencia, pelo método de amplificação da tiramida-fluoresceina, utilizando anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho, anti-conexina 32 e 43 de camundongo. Os resultados mostraram que as células gigantes trofoblásticas expressam conexinas 32 e 43 nos três períodos gestacionais com exceção da Cx32 no primeiro terço gestacional sem adição de hormônios, a qual passou a expressar fluorescência após a adição de hormônios. A distribuição da Cx43 evoluiu com a progressão da gestação, permanecendo limitada ao interior das células gigantes trofoblásticas, sem formar junções comunicantes. O terceiro terço gestacional mostra a Cx43 na CGTT localizada no interior do núcleo. A adição de hormônios ao meio de cultura vem confirmar que a progesterona e o estrógeno podem ter um papel no controle da Cx32. Para Cx43 onde se adicionou progesterona os níveis de expressão foram baixos no início aumentando no decorrer da gestação, o mesmo foi encontrado para o conjugado de progesterona/ estrógeno. Para o estrógeno no grupo I os níveis de expressão foram menores se comparados aos três grupos diminuindo no grupo II e voltando a aumentar no grupo III. / The trophoblast cells expression of connexins 32 and 43 was studied in cell culture conditions with or without influence of sexual hormones. Bovine placentomes were collected from pregnant cows in slaughterhouses in different gestational periods and so divided into three groups, first term (I), second term (II), and third term (III), and transported to the laboratory in aseptic conditions at a temperature of 40C in PBS solution with antibiotics. At the laboratory the cells were isolated and cultivated in D-MEM environment with 10% SFB for five days. The detections of connexins 32 and 43 were achieved through immunofluorescence, by the tyramide-fluorescein amplification method, using a rabbit polyclonal primary antibody anti-connexin 32 and 43 of mice. The results showed that the trophoblast cells expressed connexins 32 and 43 in the three gestational periods with an exception of the Cx32 at the first gestational period. However, after the addition of sexual hormones, they began to express the connexins in the cytoplasm in the first stage. The distribution of the Cx43 evolved with the progression of the gestation, remaining limited to the trophoblast`s cells interior, without formation of gap junctions. The third gestational term shows the Cx43 located inside the nuclei of the CGTT. Addition of hormones in the culture environment confirmed that estrogen and progesterone may have an important action controlling Cx32. For Cx43, the expression was low after prosterone was added to the culture medium, but increased as the gestation evolved, the same was found for a combined compost of estrogen\\ progesterone. For estrogen, in group I the expression levels were inferior when compared to the three groups decreasing in group II and increasing again in group III. We may conclude that the sexual hormes, specially estrogen, affect the expression of connexins in trophoblastic cells.

O presente trabalho estudou a expressão da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas, em especial nas células trofoblásticas gigantes binucleadas. Foram utilizadas 12 amostras de placenta bovina, divididas em três grupos segundo a fase gestacional, primeiro terço, segundo terço e terceiro terço da gestação. O tecido placentário foi fixado em solução metacarn e, posteriormente, submetido ao método tradicional de inclusão em parafina. A detecção da conexina 43 foi realizada através de imuno-histoquímica, pelo método de amplificação da tyramida, utilizando como anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho anti-conexina 43 de camundongo. Os resultados deste trabalho indicaram que as células trofoblásticas gigantes bovinas são capazes de expressar a conexina 43 nas três fases da gestação. A distribuição da conexina 43 evoluiu com a progressão da gestação, mas ficou limitada ao interior das células trofoblásticas gigantes bovinas, sem formar marcações pontuais na membrana citoplasmática que pudessem indicar a formação de junções comunicantes. A avaliação de diferentes protocolos histológicos e imuno-histoquímicos permitiu estabelecer a melhor metodologia para a preservação do arranjo tecidual da placenta bovina e a identificação da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas / The present study has researched the expression of Connexin-43 in bovine trophoblast giant cells, especially in binucleate trophoblast giant cells. Twelve samples of bovine placenta were used, divided into three groups according to the gestational phase, first part, second part and third part of gestation. The placental tissue was fixed in Methacarn solution and later submitted to the traditional method, that is, embedded in paraffin. The detection of Connexin-43 was done through immunohistochemistry by the tyramide amplification method, using as polyclonal primary antibody, rabbit immunoglobuline anti-mouse Connexin-43. The results of this study have revealed that the bovine trophoblast giant cells are capable of the expression of Connexin-43 in the three phases of gestation. The distribution of Connexin-43 evolved as gestation progressed, but was limited to the interior of the bovine trophoblast giant cells without punctate markings in the cytoplasmic membrane which could indicate the formation of communicating junctions. The assessment of different histological and immunohistochemical protocols allowed us to establish the best methodology for the preservation of the tissue arrangement of bovine placenta and the identification of Connexin-43 in the bovine trophoblast giant cells

As células necessitam do contato com outras células e com a matriz extracelular, para a formação de tecidos. As junções gap são estreitos canais que conectam o citoplasma de células adjacentes, promovendo a passagem de íons orgânicos, aminoácidos, nucleotídeos e outros metabólitos. Estas junções são compostas por dois conexons ou hemicanais, que atravessam a membrana plasmática da célula a que pertencem, e são compostos por seis proteínas integrais de membrana denominadas conexinas (Cxs). A Cx43 é a mais expressa, e é fosforilada ao longo do ciclo de vida, sofrendo mudanças conformacionais, resultando em diferentes isoformas (P0, P1 e P2), apresentando propriedades distintas. A Cx43 apresenta-se distribuída em todo o rim adulto. A injúria renal aguda (IRA) é uma síndrome metabólica em que ocorre redução aguda da função renal e rápida diminuição da taxa de filtração glomerular, sendo hipóxia decorrente da isquemia sua causa principal. A restrição de oxigênio e nutrientes, e o acúmulo de metabólitos, resultam na injúria das células epiteliais tubulares. A depleção dos níveis de ATP, aumento nos níveis de cálcio intracelular, alterações na membrana e deformações no citoesqueleto caracterizam esta injúria. A reoxigenação tecidual atua como agressão adicional devido à liberação de radicais livres. Estudos sugerem que a ativação de hemicanais de Cx43, resultante da desfosforilação da proteína, durante depleção de ATP, esteja envolvida na IRA. Este trabalho verificou o envolvimento da Cx43 em modelo murino desta injúria, ocasionada por isquemia/reperfusão. Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6J. A isquemia foi induzida por clampeamento das artérias renais por 45 minutos. A reperfusão ocorreu durante 24 horas após cirurgia. Foram utilizados 6 animais por grupo (isquêmicos, reperfundidos e controle). Após sacrifício, fragmentos dos rins foram submetidos a ensaios de western blot, PCR em tempo real, imuno-histoquímica e imunofluorescência. O modelo experimental foi validado através da dosagem de uréia e creatinina plasmática. As análises estatísticas foram realizadas pela análise de variância (ANOVA), seguido do teste de Bonferroni. Observou-se aumento significativo dos níveis de uréia e creatinina nos animais isquêmicos e reperfundidos, em relação ao controle. A expressão gênica apresentou aumento significativo apenas nos rins de camundongos reperfundidos (1,9 vezes; P<0,01 vs controle). No western blot verificou-se aumento na quantidade da isoforma hiperfosforilada da Cx43 (P2) em rins isquêmicos (2,73 vezes; P<0,05 vs controle), com diminuição significativa nos reperfundidos (2,37 vezes; P<0,05 vs isquêmico). Nas isoformas menos fosforiladas (P1/P0), observou-se aumento nos rins isquêmicos (2,33 vezes; P<0,05 vs controle), com diminuição nos reperfundidos (10 vezes; P<0,01 vs isquêmico). Nos ensaios imuno-histológicos verificou-se diferentes localizações da Cx43 nas células epiteliais de túbulos corticais nos grupos comparados. Nos controles verificou-se distribuição difusa, e nos isquêmicos observou-se intensa marcação em superfície celular apical. Nos rins reperfundidos, a distribuição da Cx43 foi basolateral. As alterações observadas na expressão gênica, fosforilação protéica e distribuição da Cx43 nos rins foram semelhantes às mudanças observadas na isquemia cardíaca. Este estudo mostrou pela primeira vez a regulação da Cx43 em níveis transcricionais e pós-traducionais, e sua localização celular na IRA ocasionada por isquemia/reperfusão, indicando sua participação neste processo. / The cells require contact with other cells and the extracellular matrix for tissue formation. Gap junctions are narrow channels connecting the cytoplasm of two adjacent cells, promoting the passage of inorganic ions, amino acids, nucleotides and other metabolites. These junctions are composed of two conexons or hemichannels, crossing the cell plasma membrane where they belong, and consist of six integral membrane proteins called connexins (Cxs). The Cx43 is the most expressed, and is phosphorylated throughout the life cycle, undergoing conformational changes, resulting in different isoforms (P0, P1 and P2) that have different properties. The Cx43 is distributed throughout the adult kidney. The acute kidney injury (AKI) is a metabolic syndrome that occurs in acute reduction of renal function and rapid decline in glomerular filtration rate. Hypoxia resulting from ischemia is its principal cause. The restriction of oxygen and nutrients, and accumulation of metabolites, result in the injury of tubular epithelial cells. The depletion of ATP levels, increased levels of intracellular calcium, changes in the membrane and cytoskeleton deformation characterize this injury. Reoxygenation tissue acts as additional injury due to release of free radicals. Studies suggest that activation of Cx43 hemichannels, resulting from dephosphorylation of the protein during ATP depletion, is involved in the AKI. This study investigated the involvement of Cx43 in a murine model of this injury, caused by ischemia/ reperfusion. We used male mice of strain C57BL/6J. Ischemia was induced by clamping the renal arteries for 45 minutes. Reperfusion occurred 24 hours after surgery. We used six animals per group (ischemic, reperfused, and sham). After sacrifice, kidney fragments were tested for western blot, real-time PCR, immunohistochemistry and immunofluorescence. The levels of plasma urea and creatinine were measured to validate the experimental model. Statistical analysis was performed by analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni test. We observed significant increase in serum urea and creatinine in ischemic and reperfused animals compared to sham. Gene expression increased significantly only in the reperfused kidneys (1.9 fold, P <0.01 vs sham). The western blot showed an increase in the amount of hyperphosphorylated isoform of Cx43 (P2) in ischemic kidneys (2.73 times, P <0.05 vs sham), with significant reduction in reperfused (2.37 times, P <0 05 vs ischemic). In the less phosphorylated isoforms (P1/P0), we observed an increase in ischemic kidneys (2.33 times, P <0.05 vs sham), with a decrease in reperfused (10 times, P <0.01 vs ischemic). In immuno-histological tests we verified different locations of Cx43 in the epithelial cells of cortical tubules. In normal kidneys there was patchy distribution, while in ischemic there was intense staining in the apical cell surface. In the reperfused kidney, the distribution of Cx43 was basolateral. The changes in gene expression, protein phosphorylation and distribution of Cx43 in the kidney observed in this study were similar to changes observed in cardiac ischemia. This study showed for the first time the regulation of Cx43 in transcriptional and post-translational levels, and its cellular localization in acute renal failure caused by ischemia/reperfusion, indicating its involvement in this injury.

Conexinas são proteínas que compõem as junções comunicantes do tipo gap, e a diminuição na sua expressão tem sido relacionada com diversas alterações fisiológicas, entre elas algumas síndromes, malformações genéticas, o aumento da proliferação celular e a carcinogênese. Dentre as isoformas das conexinas presentes nos tecidos animais, a Cx43 é a mais abundante e a mais estudada, tendo a sua importância relatada in vivo em camundongos que tiveram um dos alelos de Cx43 deletado (Cx43+/-), devido a morte desses animais logo após o nascimento devido a malformações cardíacas. Considerando o fato de esse gene ser expresso em dezenas de tipos celulares, tivemos como objetivo avaliar os outros tecidos em busca de anomalias ocorridas durante o desenvolvimento, e a possível interferência do background gentético. Para isso acompanhamos dia-a-dia o último terço gestacional de camundongos de background C57BL/6 e CD1, avaliando histologica e morfologicamente os fetos em busca de anomalias nos animais Cx43+/- e Cx43-/- em relação aos animais Cx43+/+. Exceto pelo tecido ósseo, não encontramos alterações nos órgãos que expressam esse gene, bem como alterações causadas pelo refluxo de sangue causado pela malformação da válvula tricúspide. Durante a osteogênese, por meio da avaliação das costelas e tíbia, percebemos um retardo no desenvolvimento, que se agrava conforme a deficiência do gene Cx43. Percebemos nitidamente que o processo de diferenciação celular ocorre de maneira menos eficiente, atrasando processos como deposição de colágeno e de matriz óssea. Conclui-se que a Cx43 é importante para o desenvolvimento ósseo na fase fetal em camundongos. / Connexins are proteins that compose the gap junctions, and the reduction in its expression has been related with diverse physiological alterations, like some syndromes, malformations, the increase of the cellular proliferation and carcinogenesis. Among isoforms of the connexins in animal cells, the Cx43 is the most abundant and studied, having its importance been shown up in alive mice that had one allele of Cx43 (Cx43+/-) deleted. REAUME et al. related that Cx43-/- mice presented cardiac malformation and died immediately after birth. Considering the fact that this gene is expressed in many cell types, we evaluate the possibility of other tissues also to present alterations during the fetal development. Due to this, we studied the mouse development initiating in 12.5 to 19.5 DE (embryologic day) and evaluated the histology of C57BL/6 and CD1 mice searching for anomalies of Cx43+/- and Cx43-/- mice in relation to the Cx43+/+ animals. We did not find alterations in the main organs that express Cx43, nor alterations due to blood out flow related to cardiac malformations. We only found significant difference was the bones; through the evaluation of the ribs and tibia. It has been observed a delay in the development, that was more important in Cx43 knockout mice. We observed clearly that the process of cellular differentiation occurs in less efficient way, delaying processes as deposition of collagen and bone matrix. In conclusion, this study showed that Cx43 is important for bone development in mice.