No / The genome of Caenorhabditis elegans encodes multiple homologues of the two major families of mammalian equilibrative and concentrative nucleoside transporters. As part of a programme aimed at understanding the biological rationale underlying the multiplicity of eukaryote nucleoside transporters, we have now demonstrated that the nematode genes ZK809.4 (ent-1) and K09A9.3 (ent-2) encode equilibrative transporters, which we designate CeENT1 and CeENT2 respectively. These transporters resemble their human counterparts hENT1 and hENT2 in exhibiting similar broad permeant specificities for nucleosides, while differing in their permeant selectivities for nucleobases. They are insensitive to the classic inhibitors of mammalian nucleoside transport, nitrobenzylthioinosine, dilazep and draflazine, but are inhibited by the vasoactive drug dipyridamole. Use of green fluorescent protein reporter constructs indicated that the transporters are present in a limited number of locations in the adult, including intestine and pharynx. Their potential roles in these tissues were explored by using RNA interference to disrupt gene expression. Although disruption of ent-1 or ent-2 expression alone had no effect, simultaneous disruption of both genes yielded pronounced developmental defects involving the intestine and vulva.

G-protein signalling is an evolutionary conserved concept highlighting its fundamental impact on developmental and functional processes. Studies on the effects of G protein signals on tissues as well as an entire organism are often conducted in Caenorhabditis elegans. To understand and control dynamics and kinetics of the processes involved, pharmacological modulation of specific G protein pathways would be advantageous, but is difficult due to a lack in accessibility and regulation. To provide this option, we designed G protein-coupled receptor-based designer receptors (DREADDs) for C. elegans. Initially described in mammalian systems, these modified muscarinic acetylcholine receptors are activated by the inert drug clozapine N-oxide, but not by their endogenous agonists. We report a novel C. elegans-specific DREADD, functionally expressed and specifically activating Gq-protein signalling in vitro and in vivo which we used for modulating mating behaviour. Therefore, this novel designer receptor demonstrates the possibility to pharmacologically control physiological functions in C. elegans.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-12-03T17:42:10Z No. of bitstreams: 1 ANA HELENA DE CASTRO DAL FORNO.pdf: 1125113 bytes, checksum: bac2174a37c6246d7048e40640b14f02 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-12-03T17:42:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ANA HELENA DE CASTRO DAL FORNO.pdf: 1125113 bytes, checksum: bac2174a37c6246d7048e40640b14f02 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-12-03T17:42:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANA HELENA DE CASTRO DAL FORNO.pdf: 1125113 bytes, checksum: bac2174a37c6246d7048e40640b14f02 (MD5) Previous issue date: 2017-03-17 / A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença paralisante e fatal caracterizada por degeneração e morte dos neurônios motores que é geralmente fatal dentro de cinco anos após diagnóstico e sem tratamento eficaz atual. Aproximadamente 10% dos casos de ELA são familiares (ELAf) e cerca de 20% de ELAf estão associados a mutações no gene superóxido dismutase 1 (sod1). Em busca de modelos experimentais alternativos que possam substituir e oferecer novas possibilidades de ensaio de toxicidade xenobiótica, o nematóide Caenorhabditis elegans foi considerado favorável como um valioso organismo bioindicador. Utilizando cepas transgênicas de C. elegans como modelo ELA HA2619, HA2622, HA2425, HA2426 testamos diferentes compostos para avaliar sua eficácia nas alterações resultantes da mutação em modelo da ELA. Foram testados trealose (5 mM) com vitamina E (200 μg/mL) e os compostos orgânicos (1 μM) 4-fenilselanil-7-cloroquinolina (PSQ) e 4-feniltellanil-7-cloroquinolina (PTQ). Nenhum dos tratamentos testados apresentou resultados positivos para o aumento da longevidade ou diminuição na paralisia, o que nos levou a questionar se os tratamentos podem ter desencadeado um aumento dos sintomas e consequentemente uma piora nos vermes. Também observamos que o tratamento com os compostos orgânicos contra o dano oxidativo causado pelo peróxido de hidrogênio (0,6 mM) não foi revertido. Em nossas perspectivas, mais estudos são necessários para encontrar terapias que podem prolongar a longevidade e diminuir ou retardar a paralisia. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal paralytic disorder characterized by degeneration of motorneuron which is generally fatal within five years of diagnosis and with no current effective treatment. Approximately 10% of the ALS cases are familial ALS (fALS) and about 20% of fALS are associated with mutations in the superoxide dismutase 1 gene (sod1). Seeking for alternative experimental models that may substitute and offer new possibilities to assay xenobiotics toxicity, the nematode Caenorhabditis elegans has been found favorable as a valuable bioindicator organism. Using C. elegans transgenic strains as ALS model HA2619, HA2622, HA2425, HA2426 we tested compounds to evaluate the efficacy in treatment of ALS. Trehalose (5mM) with vitamin E (200μg/mL) and the organocompounds (1μM) 4-phenylselanyl-7-chloroquinoline (PSQ) and 4-phenyltellanyl-7-chloroquinoline (PTQ) were tested. None of the treatments tested positive for increased longevity or delayed or decreased paralysis, which led us to wonder if the treatments may have triggered an increase in symptoms and worsening of the worms. We also observed the treatment with the organocompounds against the oxidative damage caused by hydrogen peroxide (0.6mM) was not reversed. In our perspectives further studies are needed to find therapies that may prolong longevity and decrease or delay paralysis.

Le vieillissement et les maladies associées constituent une préoccupation croissante des sociétés modernes. En effet, l'espérance de vie augmente rapidement et ceci n'est pas accompagné par une fécondité accrue. Par conséquent, la proportion de personnes âgées augmente et la science doit fournir des solutions pour traiter les maladies liées à l'âge. Dans ce travail, nous avons étudié une partie du réseau génétique qui a un impact sur la durée de vie par le biais du régime alimentaire. Nous nous sommes concentrés en particulier sur le rôle d'un gène conservé qui code pour la sphingosine kinase (SPHK), et nous décrivons ici pour la première fois son rôle dans la longévité induite par la restriction alimentaire. Cette thèse se compose de deux parties. Dans la première partie, C. elegans a été utilisé pour comprendre le rôle que la sphingosine kinase (sphk-1) joue dans le vieillissement. Nous rapportons que les vers porteur d'une mutation dans le gène sphk-1 vivent plus longtemps que des vers sauvages et ne répondent pas à une restriction alimentaire (RA) et ressemblent à des animaux sauvages soumis à RA. De plus, nos données suggèrent que la longévité causée par une mutation du gène sphk-1 nécessite la présence du facteur de transcription SKN-1b, connue pour son rôle dans la RA. De plus, sphk-1 et skn-1b sont tout deux exprimés dans les neurones de la tête. Nos travaux suggèrent également que la voie TOR/autophagie est impliquée dans la longévité de sphk-1 mutants. Nous avons également montré que d'autres gènes dans la voie de synthèse des céramides ont un effet similaire sur la longévité suggérant que cette voie toute entière est capable d’affecter la longévité.La deuxième partie de ce travail a été réalisée sur un modèle de souris de la maladie d’Alzheimer (MA) pour tester le rôle des gènes SPHK dans la MA et la dégénérescence neuronale. Nous avons constaté que le niveau d'expression de SPHK était significativement augmenté dans nos modèles de souris par rapport à leurs contrôles de la même portée dès l’âge de 6 mois. Un inhibiteur de la SPHK (SKI-II) a été administré à ces souris et ce traitement a permis une amélioration des performances des souris dans des tests de marche sur balancier et une augmentation du poids de cerveau, mais pas d'amélioration de la mémoire dépendante de l'hippocampe. Un autre traitement de SKI-II sur des souris de type sauvage n'a pas montré d’amélioration significative, mais la restriction calorique (RC) a réduit les niveaux de SPHK chez les souris sauvage, ce qui suggère que la sphingosine kinase a des fonctions conservées dans les voie de signalisation liés au sensing des nutriments. / Advances in medical technology and hygiene standards have increased human life expectancy at unprecedented rates worldwide. Nevertheless, one of the consequences of a growing elderly population is an increased prevalence of age-related disease. A scientific understanding of the underlying biological mechanisms of aging is essential to develop effective treatments for age-related diseases and to provide adequate health care to the elderly. In this study, we investigated part of the genetic network that mediates lifespan extension resulting from dietary restriction. We focused on the contribution of a conserved gene encoding the enzyme sphingosine kinase, and describe for the first time its role in diet-mediated longevity.This thesis is composed of two parts. In the first part, we used the nematode Caenorhabditis elegans as a model organism to investigate the role of the sphingosine kinase gene (sphk-1) in aging. We found that worms carrying a sphk-1 null mutation (sphk-1(ok1097)) are long-lived and do not benefit from further lifespan extension upon dietary restriction (DR), a regimen that extends the lives of wild-type worms. sphk-1(ok1097) animals exhibit many phenotypes displayed by animals subjected to DR, suggesting that sphk-1(ok1097) acts through the DR longevity pathway. In support of this, sphk-1(ok1097)-mediated lifespan extension requires the essential DR regulator, SKN-1b, and, similar to SKN-1b, sphk-1 is expressed in head neurons. A search for possible sphk-1(ok1097)-associated longevity determinants suggested the involvement of the TOR/autophagy pathway. Moreover, we found that mutations in ceramide pathway genes other than sphk-1 have similar effects on longevity. Finally, we discovered that sphk-1 mutants fail to reduce germ cell numbers in response to DR. Because such a reduction appears to be an essential feature of DR-mediated lifespan extension, we propose that this failure to reduce germ cell numbers may explain why sphk-1(ok1097) mutant longevity is not extended when nutrient levels are low.The second part of this study investigated the role of sphingosine kinase in brain function during normal and pathologic aging. We examined the expression of sphingosine kinase genes in wild-type mice and in a mouse model of Alzheimer’s disease (AD)-like neurodegeneration. Expression of both mouse SphK genes was increased in the brains of AD-like mice as early as 6 months of age. Chronic administration of an SphK inhibitor elevated the brain weight of AD-like mice and improved their performance in the beam walking test, but not in hippocampus-dependent memory tasks. Treatment of wild-type mice with SKI-II had little effect, but calorie restriction reduced the expression of SphK mRNA in the brain, suggesting that sphingosine kinase may play some conserved roles in nutrient sensing pathways. / 在工业化水平越来越高的当今社会，人口的老龄化正逐渐成为一个严重的社会问题。医疗手段的发展、生活水平的提高使得人们的寿命在不断增加，而与此同时生育率并没有同步增加，这就导致老年人口在整个社会人口中的比重快速增长，因此，衰老以及一些相关的疾病就得到了人们越来越多的关注，也正在成为一个越来越热门的科研领域。从科研工作者的角度，我们希望能够通过实验手段破解衰老及其相关疾病的机制从而寻找延缓衰老或治疗相关疾病的方法。在本论文中，我们研究了一个通过限制饮食来调控寿命的基因网络的一部分。我们的主要研究对象是编码鞘氨醇激酶的基因（SphK），我们第一次发现了它在饮食介导的寿命调控中的作用。本论文由两个章节组成。在第一章中，我们使用秀丽隐杆线虫作为模式动物来研究鞘氨醇激酶基因（sphk-1）在其衰老调控过程中的作用。在研究中，我们发现，携带一种sphk-1 删除突变（sphk-1(ok1097)）的突变体线虫的平均寿命显著延长，而饮食限制（DR）并不能进一步延长它的寿命。另外，这种突变体还表现出一系列与受饮食限制调控的动物相类似的表型，尽管并不是全部。这些结果都表明sphk-1 基因通过饮食介导的途径参与线虫的寿命调控。我们随后的研究显示，由sphk-1 突变引起的寿命延长依赖于DR 的一个调控因子：SKN-1b；并且，与skn-1b 类似，sphk-1 表达的位置也在线虫头部的神经元。对于其它DR 相关因子的研究还发现线虫sphk-1(ok1097)突变引起的寿命延长可能与TOR 及自噬通路的作用有关。此外，我们还发现，不仅是sphk-1，神经酰胺通路中的其它基因对于寿命调控也有类似的效果。最后，我们的研究结果显示，DR 未能减少sphk-1(ok1097)突变体线虫的生殖细胞数量，这一发现或许能够解释为什么DR不能够进一步延长sphk-1(ok1097)突变体线虫的寿命。在第二章中，我们使用了一种模拟阿尔茨海默症（AD）的小鼠模型来测试哺乳类SphK 基因在神经退行性病变中的作用。我们发现，在模型小鼠脑组织中，两种哺乳类SphK 基因的表达水平与它们的同窝对照相比显著增加，而这一显著差异早在6 月龄的小鼠脑中就能发现。在后续的实验中，我们给这些小鼠喂食了一种SphK 的抑制剂——SKI-II。这种抑制剂显著改善了模型小鼠在平衡木实验中的表现，并且显著增加了它们的脑重量，但对于海马依赖性的记忆并没有改善。在另一个实验中，给野生型小鼠注射SKI-II 并没有表现出明显的差异，但热量限制（CR）降低了野生小鼠脑中两种SphK基因的表达量，这一与线虫中类似的结果提示，鞘氨醇激酶在营养通路中可能有一些进化保守的功能。

Sous le terme de maladies mitochondriales, on désigne des maladies multi-systémiques ou à expression tissu-spécifique dues à un déficit de la phosphorylation oxydative qui est assurée par le fonctionnement de 5 complexes protéiques enzymatiques (chaîne respiratoire) parmi lesquelles 13 sous-unités sont codées par le génome mitochondrial, les autres par le génome nucléaire. Ces pathologies recouvrent donc en pratique des maladies génétiques par mutation de l’ADN mitochondrial (ADNmt) mais aussi des maladies génétiques à hérédité mendélienne classique. Dans les cytopathies mitochondriales liées à des mutations de gènes nucléaires, il existe deux sortes de gènes (i) à effet direct correspondant à des gènes codant pour les sous-unités protéiques de la chaîne respiratoire ou leur assemblage, et (ii) à effet indirect correspondant à des gènes codant pour des protéines impliquées dans le maintien et la réplication de l'ADN mitochondrial. Des mutations dans cette dernière classe de gènes peuvent s'accompagner d'anomalies quantitatives ou qualitatives de l'ADNmt : déplétion de l'ADNmt (réduction majeure du nombre de molécules d'ADNmt) et délétions multiples.Après des dosages enzymatiques de l’activité des complexes respiratoires mitochondriaux chez les patients, le ou les types de complexes altérés sont connus. Un grand nombre de gènes mutés responsables de pathologies mitochondriales ont été identifiés, tous codant des constituants des différents complexes de la chaîne respiratoire. Ces dernières années, le groupe d’Agnès Rötig (Hôpital Necker, Paris) a identifié de nouveaux gènes grâce à une approche gènes candidats ou grâce à des tours de génome de familles consanguines de patients qui permettent de délimiter une région chromosomique portant la mutation à l’état homozygote. La validation de l’effet délétère de la mutation identifiée se fait en général en utilisant des organismes modèles d’étude comme les cellules humaines en culture ou bien la levure. Cependant, il reste un grand nombre de cas où la mutation n’a pas pu être identifiée, soit parce que le déficit de tel ou tel complexe ne met pas en jeu un des composants connus de ce complexe ou bien plusieurs complexes de la chaîne respiratoire sont déficitaires mettant en jeu, dans un grand nombre de cas, le maintien de l’ADN mitochondrial pour lequel peu de gènes sont connus.Au laboratoire d’Orsay, nous disposons de deux organismes modèles d’étude, la levure S. cerevisiae et le nématode C. elegans. La levure S. cerevisiae est l’organisme modèle de choix pour étudier les fonctions mitochondriales grâce à ses caractéristiques comme la respiration facultative, mais aussi et surtout par la puissance de sa génétique et le fait que les mitochondries peuvent être transformées. Cependant de par sa respiration facultative et sa division clonale, elle ne se prête pas facilement à des études sur la stabilité de l’ADNmt. En effet, S. cerevisiae perd très facilement son ADNmt après inactivation d’un grand nombre de gènes impliqués dans pratiquement toutes les voies de la biogenèse mitochondriale. Cette levure ne peut donc pas être utilisée de façon simple pour l’étude de la transmission de l’ADN mitochondrial. C’est pourquoi nous nous sommes alors intéressés à l’autre organisme modèle développé au laboratoire, le nématode C. elegans dont ses caractéristiques en font un excellent modèle complémentaire à la levure. / Mitochondrial respiratory chain diseases of nuclear origin represent one of the major causes of metabolic disorders. These diseases are characterized by a huge clinical and genetic heterogeneity which is a major problem in identifying the disease causing gene. Although several gene mutations have already been found in some patients or families, the disease causing gene of the majority is yet to be determined. The overall structure and gene content of the mitochondrial genome and the proteins required for mtDNA transactions are largely conserved from yeast to human offering the opportunity to use animal models to understand the molecular basis of mitochondrial dysfunctions. To expand the number of human candidate genes of mitochondrial diseases involved in mtDNA maintenance, we have developed in this study, the nematode Caenorhabditis elegans as a model organism to identify new proteins involved in mtDNA maintenance by combining RNAi and ethidium bromide exposure. We have developed a large-scale screening method of genes required for mtDNA maintenance in the worm and initially indentified four new C. elegans genes (atad-3, dnj-10, polrmt, phi-37 and immt-1) involved in mtDNA stability. The human homologs of these genes (ATAD3, DNAJA3, POLRMT and ATP5A1) can be now considered as candidate genes for patients with quantitative mtDNA deficiencies. Using our screening design we have begun to screen all the C. elegans genes encoding mitochondrial proteins. Of the 721 estimated C. elegans mitochondrial genes homologous to human genes, we have tested 185 genes and found that 41 genes are required for the maintenance of the mitochondrial genome in post mitotic cells. These genes fall into three main functional categories of metabolism, protein synthesis and oxidative phosphorylation. Finally, in this study, we investigated the reversibility of mtDNA depletion with drugs to counteract POLG dificiency. Three molecules, Chlorhexidine, Resveratrol and Bezafibrate, have been tested to restore normal mtDNA content and worm life cycle. These experiments hold promise for future work using C. elegans as a pharmacological model for mitochondrial diseases.Altogether, the data generated in this work is a starting point for promising advances in the mitochondrial field, showing the relevance of the nematode as a model organism to study fundamental processes as well as human health research.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2009. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2004. / Vita. Includes bibliographical references (p. 68-76).

Thesis (Ph.D. in Cell and Developmental Biology) -- University of Colorado at Denver and Health Sciences Center, 2005. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 82-86). Free to UCDHSC affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Comprendre les mécanismes de sénescence ou développer de nouveaux anti-cancéreux impose d’utiliser des modèles biologiques divers et complémentaires. De par sa facilité de mise en œuvre, la culture cellulaire est une des méthodes les plus employées. Cependant, travailler sur des cellules isolées ne permet pas toujours d’extrapoler les résultats à des conditions plus complexes comme un organisme entier. Les biologistes disposent alors de modèles intégrés plus ou moins évolués : levures, poissons (zebrafish …), grenouille (xénope …), insectes (drosophile …), rongeurs (souris, rats …), chien, primates, etc. Cependant leur mise en œuvre est souvent difficile, tant d’un point de vue administratif que technologique.L’objectif de notre travail a été d’initier le développement de deux nouveaux modèles biologiques intégrés (Caenorhabditis elegans et Hypsibius dujardini), beaucoup plus facilement manipulables, pour des études en oncopharmacologie et sénescence.Le potentiel de Caenorhabditis elegans a été évalué au travers de deux axes : (i) nous avons utilisé le nématode pour déterminer les potentiels toxiques, mutagènes et cancérogènes de gaz candidats au remplacement du gaz SF6 (ii) à l’aide du Seahorse XF24 Analyzer, nous avons mis au point un test fonctionnel original : la mesure de la respiration mitochondriale du nématode entier.Nous avons choisi de développer comme second modèle, Hypsibius dujardini, beaucoup moins travaillé que C. elegans. C’est un tardigrade connu pour sa résistance aux conditions extrêmes, notamment à la dessication. Afin de mieux comprendre cette résistance, nous avons choisi d’analyser le fonctionnement mitochondrial de cet organisme en sortie d’anhydrobiose, en utilisant des marquages mitochondriaux et en mesurant sa respiration à l’aide du Seahorse XF24 Analyzer. / Biological models are necessary to understand how organisms works, how evolution of living run, to test new treatments or to perform toxicological assessments as well. Cellular culture is one of the methods employed because it is easy to use. However, working on isolated cells doesn’t always allow to challenge of the results with more complex conditions as found in full organisms. Biologist needs to develop new biological models for new assessments but the new model choice can be a problem. Murine model, frog, drosophila, yeast, zebrafish,… have each other some benefits and limits. Their choice is directly linked with their use and with the type of research we intend to make.The aim of our work was to develop biological models to oncopharmacology and aging studies.The nematode model with Caenorhabditis elegans was used in several projects. One study was made on gases. They were tested in terms of toxicity, mutagenicity and cancerogenicity. On the other hand, a new tool was developed for prospective studies on either toxicology or mechanistic with the mitochondrial respiration measure with the Seahorse XF24 Analyzer device.The second biological model studied is the tardigrade and more exactly Hypsibius dujardini. Tardigrades are extremely resistant organisms to harshest conditions. They can resist to desiccation. To gain insights on tardigrade resistance, we have choice to analyze the mitochondrial dynamics in the course of anhydrobiosis exit by using mitochondrial dyes and respiration measurements.

Le développement de Caenorhabditis elegans est finement régulé et aboutit au nombre constant de 959 cellules par individu. Une partie de ces régulations repose sur les microARN, ARN simple brin d’environ 22 nucléotides. Ils peuvent diminuer l'expression des gènes en ciblant des séquences homologues dans les régions 3' non transcrites (3'UTR) des ARN messagers. Pour déterminer l'impact de cette régulation, nous utilisons une méthode permettant de visualiser in vivo une différence d'expression induite post-transcriptionnellement. Cette méthode se base sur l'utilisation de deux protéines fluorescentes : la GFP (verte) et la mCherry (rouge) exprimées sous le contrôle du promoteur du gène d'intérêt. La mCherry est suivie par un 3'UTR contrôle et reflète l'activité du promoteur. La GFP est suivie par le 3'UTR du gène d'intérêt et subit les mêmes régulations que le gène endogène. La différence d'expression entre les deux protéines devrait donc refléter la régulation s'opérant sur le 3'UTR du gène. La transparence de C. elegans permet de localiser les protéines rapportrices par microscopie en fluorescence à tous les stades du développement dans l'organisme entier. Initialement, le 3'UTR du gène unc-54 (myosine de type II) a été choisi comme contrôle. Le rapporteur bicolore a révélé une régulation s’opérant sur unc-54 3’UTR jusqu’ici considérée comme permissif. La régulation observée s’opère dans les muscles et les neurones ADF. La caractérisation de cette régulation a permis de mettre en évidence le rôle potentiel de mir-1820. Le profil d’expression de mir-1820 a pu être établi grâce à une fusion avec la GFP et correspond au profil des régulations observées sur unc-54 3’UTR. / Caenorhabditis elegans development is very tightly regulated, leading to the same number of cells in each individual. Part of this regulation network relies on small single strand RNAs (miRNAs), which can target homologous sequences in the 3’ untranslated regions (3’UTR) of messenger RNAs. We want to investigate the contribution of miRNAs during neurons differentiation. In order to study the miRNA contribution to gene regulation we use double fluorescent reporters that allow us to visualize the posttranscriptional contribution to regulation throughout development. The GFP and the mCherry are expressed under the control of the gene promoter, but followed by either the 3’UTR of interest, or a control 3’UTR. We first chose as a control 3’UTR the unc-54 3’UTR (myosin class II). The gene unc-54 is expressed through all larval stages and in the adult worms. The two colors reporter system showed that unc-54 3’UTR undergoes a regulation in the ADF pair of neurons and partially in the body wall muscle. The characterization of this regulation pointed out a potential role for mir-1820. The GFP was cloned between mir1820 5’ and 3’ sequences and the construction displayed an expression profile overlapping with the regulation pattern observed on unc-54 3’UTR.