Uma das marcantes características morfológicas e funcionais dos crustáceos e de outros artrópodes é a presença de um exoesqueleto que cria uma barreira física para o crescimento desses animais. Nos crustáceos, a muda é um evento cíclico, dividido em 5 estágios, e um deles compreende a troca desse exoesqueleto, permitindo o aumento de tamanho. O início, período e a frequência do ciclo de muda dependem da idade e do sexo do animal e de fatores ambientais e fisiológicos. Hormônios como os ecdiesteróides e o hormônio inibidor da muda produzidos e secretados pelos órgãos Y e X, respectivamente, atuam diretamente no ciclo de muda, porém outros hormônios podem regular, de forma positiva ou negativa, este processo. A melatonina é um hormônio encontrado amplamente no reino animal, porém em crustáceos, diferentemente do que ocorre nos vertebrados, a sua síntese e secreção não estão relacionadas com a presença ou ausência de luz, e seu papel na muda tem sido pouco investigado. Os animais foram aclimatados no laboratório à temperatura 22±2 °C e ciclo claro-escuro 12h:12h LD, sendo os experimentos realizados nesta mesma condição. Considerando o acima exposto, os objetivos do presente trabalho foram (1) verificar a produção de melatonina no siri azul Callinectes sapidus, através da investigação da expressão das enzimas AANAT e ASMT no pedúnculo óptico e hepatopâncreas, bem como os níveis hemolinfáticos da indolamina; (2) avaliar se existe um perfil oscilatório diário na expressão gênica dos fatores relacionados com a muda, CasMIH e CasEcR1; (3) verificar se a manipulação com melatonina exógena influencia essa expressão. Para isso, técnicas de imunohistoquímica, citometria de fluxo, ensaio imunoenzimático e PCR quantitativo foram empregadas. Nossos resultados demonstraram uma oscilação dos níveis hemolinfáticos de melatonina em siris em pré-muda, com pico às 8 horas; entretanto, no estágio de intermuda os níveis deste hormônio foram menores e constantes ao longo de 24 horas. Não pudemos comprovar a presença das enzimas da via de síntese da melatonina, uma vez que os anticorpos utilizados não apresentaram homologia às proteínas de C. sapidus. Quanto à expressão gênica, uma oscilação diária semelhante nos transcritos dos genes CasMIH e CasEcR1 ocorreu no hepatopâncreas, independente do estágio de muda. No pedúnculo óptico a oscilação dos genes em questão também foi semelhante, mas apenas na pré-muda; na intermuda houve entre eles uma relação de anti-fase. A administração de melatonina exógena (10-7 mol/siri) levou à inibição da expressão dos genes em relação ao controle: no caso de CasMIH foi de 99,7% no pedúnculo óptico e 100% no hepatopâncreas e o CasEcR1 sofreu inibição de 77% no pedúnculo óptico e 99% no hepatopâncreas. A presença de melatonina na hemolinfa é um forte indício de que o animal a sintetiza e pode estar atuando no ciclo de muda, uma vez que a administração deste hormônio inibiu a transcrição dos genes relacionados ao processo. Diante disso, fica mais clara a relevância de entender a flutuação de hormônios que não estão classicamente envolvidos no ciclo de muda, essencial para o crescimento dos crustáceos, mas que podem apresentar a função de regular este processo, como a melatonina. Ademais, a melatonina poderá ser uma boa ferramenta a ser utilizada no cultivo do siri-azul, como agente indutor da redução do período de intermuda levando à uma ecdise precoce / One of the remarkable morphological and functional features of crustaceans and other arthropods is the presence of an exoskeleton that creates a physical barrier for the animal growth. In crustaceans, molting is a cyclic event usually divided into five stages, one of them comprising the exoskeleton exchange what thus allows the increase in size. The onset, period, and frequency of the molt cycle depend on the animal age and sex, as well as on environmental and physiological factors. Hormones such as ecdysteroids and the molt-inhibiting hormone produced and secreted by the Y- and X- organ, respectively, exert direct effects on the molt cycle. Nevertheless, other hormones are known to positively or negatively regulate this process, such as melatonin. Melatonin is a hormone widely found in the animal kingdom, but in crustaceans, differently from what happens in vertebrates, its synthesis and secretion are not regulated by the presence or absence of light. In fact, its role in the molting process has been poorly investigated. The animals were acclimated in the laboratory at 22±2 °C and light-dark cycle 12h:12h LD, and the experiments were performed under the same condition. Considering the above, the objectives of this study were to: 1) verify the production of melatonin in the blue crab Callinectes sapidus, through the evaluation of the expression of key enzymes involved in the synthesis of melatonin, AANAT and ASMT, in the eyestalk and hepatopancreas, as well as melatonin levels in the hemolymph; 2) evaluate whether there exists a daily oscillatory profile in gene expression of the related molt factors, CasMIH and CasEcR1; (3) whether the exogenous melatonin influences the expression of the latter genes. To achieve these goals, immunohistochemistry, flow cytometry, immunoenzymatic assay, and quantitative PCR techniques were used. Our results demonstrated an oscillation of the hemolymphatic levels of melatonin in premolt crabs, peaking at 8 AM; however, in the intermolt stage, the levels of this hormone were smaller and constant along 24 hours. We were not able to show the presence of the enzymes involved in melatonin synthesis, since the antibodies used had no homology with C. sapidus proteins. We also demonstrated a daily oscillatory profile of CasMIH and CasEcR1 transcripts in hepatopancreas independently of the molt stage. In the eyestalk the oscillatory profile of both genes was also similar, but only in the premolt stage; in intermolt, an antiphase relationship between both genes was found. The exogenous administration of melatonin (10-7 mol/crab) inhibited the expression of CasMIH by 99.7 and 100% in eyestalk and hepatopancreas, respectively, whereas CasEcR1 was inhibited by 77% and 99%, in the eyestalk and hepatopancreas, respectively, compared to saline-treated animals. The presence of melatonin in the hemolymph is a reliable indicator that the animal synthesizes the hormone, and thus melatonin may influence the molt cycle since it inhibited the expression of molt-related genes. Therefore, the relevance of understanding the oscillation of hormones that are not classically involved in the molt cycle - essential for crustacean growth - but which can regulate the process, becomes evident. From an economic standpoint, melatonin may be a useful tool in culturing blue crab, which ultimately can shorten the intermolt stage period leading to an early ecdysis

A caracterização bioquímica da (Na+,K+)-ATPase, uma importante enzima envolvida no controle osmo-iônico nos crustáceos osmorreguladores, foi realizada a partir de centrifugação diferencial de frações microsomais do tecido branquial do siri eurialino C. danae, coletado na Baía de Ubatuba e mantido a 33o/oo de salinidade (animais recém-capturados). A ultracentrifugação da fração microsomal em um gradiente contínuo de sacarose (10-50%) revelou a presença de um único pico de atividade (Na+, K+)-ATPase, coincidente com o pico de atividade K+-fosfatase. Ambas as atividades foram inibidas completamente pela ouabaína. O Western blotting da fração microsomal apresentou uma única banda imunoespecífica contra a subunidade alfa da (Na+, K+)-ATPase, sugerindo a presença de uma única isoforma para a cadeia alfa da enzima. A hidrólise do ATP ocorreu em sítios de alta afinidade que apresentaram interações sítio-sítio (nH=3,6) com uma atividade específica V= 35,4 ± 2,1 U/mg e K0,5= 54,0 ± 4,0 nM, bem como em sítios de baixa afinidade, que obedeceram uma cinética Michaeliana, com V= 271,5 ± 17,2 U/mg e KM = 55,0 ± 3,0 uM. A estimulação da atividade da enzima pelos íons Na+ (V= 302,1 ± 14,1 U/mg e K0,5= 5,80 ± 0,3 mM), Mg2+ (V= 309,7 ± 15,7 U/mg e K0,5= 0,48 ± 0,02 mM) e K+ (V= 294,0 ± 11,8 U/mg e K0,5= 1,61 ± 0,06 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio, enquanto a estimulação pelos íons NH4+ obedeceu a uma cinética Michaeliana com V= 377,8 ± 22,7 U/mg e KM= 4,61 ± 0,27 mM). Interessantemente, os íons NH4+ estimularam sinergisticamente a atividade específica da enzima em cerca de 90% (V= 557,0 ± 28,3 U/mg), sugerindo que esses íons se ligam em diferentes sítios na molécula. A (Na+,K+)-ATPase do tecido branquial de C. danae hidrolisou o PNFF com V= 125,4 ± 7,5 U/mg, K0,5= 1,2 ± 0,1 mM, através de interações cooperativas (nH= 1,5). Além disso, essa atividade K+-fosfatase foi inibida competitivamente pelo ATP (KI= 57,2 ± 2,6 µM), sugerindo que os dois substratos foram hidrolisados no mesmo sítio da enzima. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na+,K+)-ATPase pelos íons K+ (V= 121,0 ± 6,1 U/mg; K0,5= 2,1 ± 0,1 mM), Mg2+ (V= 125,3 ± 6,3 U/mg; K0,5= 1,0 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 126,1 ± 4,8 U/mg; K0,5= 13,7 ± 0,5 mM) ocorreram através de interações sítio-sítio, similarmente ao observado para o ATP. A ouabaína e o ortovanadato inibiram completamente a atividade (Na+,K+)-ATPase (KI= 147,2 ± 7,2 uM; KI= 11,2 ± 0,6 nM, respectivamente). Entretanto, para a atividade K+-fosfatase os valores determinados foram significativamente superiores (KI= 830,3 ± 42,5 uM; KI= 34,0 ± 1,4 nM, respectivamente). A inibição da atividade da (Na+,K+)-ATPase por essas duas substâncias foi afetada pela presença de íons NH4+. Entretanto, o mesmo não ocorreu com a atividade K+-fosfatase da enzima. A representação de Arrhenius revelou a ocorrência de uma transição de fase próximo a 19°C, com deltaH1= 15.939 cal/mol e outra a 38°C com deltaH2= 7.719 cal/mol. Temperaturas acima de 43°C provocaram uma rápida inativação da (Na+,K+)-ATPase. Esta é a primeira demonstração da presença de um sítio de alta afinidade para o ATP na (Na+,K+)-ATPase de crustáceo. Os resultados obtidos sugerem que as atividades (Na+,K+)-ATPase e K+-fosfatase pertencem à mesma enzima e que a preparação não apresenta contaminações por outras ATPases e/ou fosfatases. Do ponto de vista fisiológico, os resultados deste trabalho são relevantes em relação à excreção ativa dos íons NH4+ pelos crustáceos. / The modulation by Mg+2, Na+, K+, NH4+ ions and ATP of the (Na+, K+)-ATPase activity in a microsomal fraction from Callinectes danae gills was analyzed. ATP was hydrolyzed at high-affinity binding sites at a maximal rate of V= 35.4 ± 2.1 U/mg and K0.5= 54.0 ± 3.6 nM, obeying cooperative kinetics (nH= 3.6). At low-affinity sites, the enzyme hydrolyzed ATP obeying Michaelis-Menten kinetics with KM= 55.0 ± 3.0 uM and V= 271.5 ± 17.2 U/mg. This is the first demonstration of a crustacean (Na+, K+)-ATPase possessing two ATP hydrolyzing sites. Stimulation by sodium (K0.5= 5.80 ± 0.30 mM), magnesium (K0.5= 0.48 ± 0.02 mM) and potassium ions (K0.5= 1.61 ± 0.06 mM) exhibited site-site interactions, while that by ammonium ions obeyed Michaelis-Menten kinetics (KM= 4.61 ± 0.27 mM). Ouabain (KI= 147.2 ± 7.2 uM) and orthovanadate (KI= 11.2 ± 0.6 nM) completely inhibited ATPase activity, indicating the absence of contaminating ATPase and/or neutral phosphatase activities. Ammonium and potassium ions synergistically stimulated the enzyme, increasing specific activities up to 90%, suggesting that these ions bind to different sites on the molecule and that the presence of each ion modulates enzyme stimulation by the other. The kinetic properties of a microsomal gill (Na+,K+)-ATPase were also analyzed using p-nitrophenylphosphate as substrate. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed the substrate obeying cooperative kinetics (n= 1.5) at rates of V= 125.4 ± 7.5 U/mg and K0.5= 1.2 ± 0.1 mM and ATP competitively inhibited K+-phosphatase activity (KI= 57.2 ± 2.6 µM). Enzyme stimulation by potassium (V= 121.0 ± 6.1 U/mg; K0.5= 2.1 ± 0.1 mM) and magnesium ions (V= 125.3 ± 6.3 U/mg; K0.5= 1.0 ± 0.1 mM) was cooperative. Ammonium ions stimulated the enzyme through site-site interactions to a rate of V= 126.1 ± 4.8 U/mg with K0.5= 13.7 ± 0.5 mM. However, the K+-phosphatase activity was not synergistically stimulated using potassium plus ammonium ions. Sodium ions (KI= 36.7 ± 1.7 mM), ouabain (KI= 830.3 ± 42.5 uM) and orthovanadate (KI= 34.0 ± 1.4 nM) completely inhibited K+-phosphatase activity. The data show that the K+-phosphatase activity corresponds strictly to the (Na+,K+)-ATPase. This is the first invertebrate (Na+,K+)-ATPase shown to exhibit both high- and low-affinity sites for ATP hydrolysis and synergistic stimulation by potassium and ammonium ions (Masui et al., 2002). Further characterization of the K+-phosphatase activity will reveal its specific kinetic characteristics and may become a useful tool in comparative osmoregulatory studies.

O presente estudo teve como objetivo desenvolver uma nova proposta de uso de um biomonitor na identificação de fontes emissoras de metais no meio ambiente. Foi selecionada a espécie de siri Callinectes danae como biomonitor e o estuário de Santos como área de estudo. Numa primeira etapa e considerando que o siri é um organismo bentônico, foi realizada uma avaliação preliminar do teor de metais no sedimento do estuário. Em seguida, foi realizada uma avaliação preliminar do teor de metais nos diferentes tecidos de indivíduos coletados na região (brânquias, hepatopâncreas e músculos). Baseado nos experimentos anteriores, foi proposto um modelo de distribuição dos metais entre os tecidos e destes em relação aos sedimentos. A validação deste modelo de distribuição (assinatura química) foi realizada por meio de um conjunto de procedimentos que visaram testar: 1) a robustez em função do tempo; 2) a especificidade para a região de estudo; 3) a sensibilidade às alterações dos níveis de metais em cada tecido. A partir deste modelo, foram identificados indícios para atribuição de fontes emissoras de metais. Desta forma, concluiu-se que, para a região do estuário de Santos, o siri da espécie C. danae pode ser utilizado como um biomonitor. O modelo proposto foi eficaz, uma vez que foi capaz de responder de forma conclusiva-positiva a todos os testes realizados na sua validação, confirmando esta espécie como um biomonitor definitivo para região. A robustez do modelo irá aumentar com novas coletas e a realimentação do banco de dados. / This study aimed to develop a new methodology for the use of a biomonitor in the identification of metal discharges in environmental evaluations. Crabs of Callinectes danae species were used in an evaluation conducted in the Santos Estuarine System. In the first experiment and since C. danae is a benthic species, a preliminary assessment of the metal concentrations in sediment samples collected in the Santos Estuarine System was performed. Subsequently, a preliminary assessment of metal concentrations in the C. danae tissues was also peformed. The last experiment aimed to identify a chemical fingerprint for the Santos Estuarine System.The development of validation procedures for this model (chemical fingerprint) was conducted and aimed to test: 1) the stability of this model through time; 2) its local specificity for the Santos Estuarine System; 3) the sensibility of this model due to modifications in the metal concentrations in each tissue (gills, hepatopancreas and muscles). By the use of this model, it was possible to identify the sources of metal emissions. According to the results, C. danae can be used as a biomonitor for the Santos Estuarine System. The established model was able to responde in a positive-conclusive way to all the tests performed in its validation, confirming this species as a definitive biomonitor for this area. Thus, the stability of this model will increase with new sampling campaings and consequently introduction of new information in the database.

O presente estudo teve como objetivo desenvolver uma nova proposta de uso de um biomonitor na identificação de fontes emissoras de metais no meio ambiente. Foi selecionada a espécie de siri Callinectes danae como biomonitor e o estuário de Santos como área de estudo. Numa primeira etapa e considerando que o siri é um organismo bentônico, foi realizada uma avaliação preliminar do teor de metais no sedimento do estuário. Em seguida, foi realizada uma avaliação preliminar do teor de metais nos diferentes tecidos de indivíduos coletados na região (brânquias, hepatopâncreas e músculos). Baseado nos experimentos anteriores, foi proposto um modelo de distribuição dos metais entre os tecidos e destes em relação aos sedimentos. A validação deste modelo de distribuição (assinatura química) foi realizada por meio de um conjunto de procedimentos que visaram testar: 1) a robustez em função do tempo; 2) a especificidade para a região de estudo; 3) a sensibilidade às alterações dos níveis de metais em cada tecido. A partir deste modelo, foram identificados indícios para atribuição de fontes emissoras de metais. Desta forma, concluiu-se que, para a região do estuário de Santos, o siri da espécie C. danae pode ser utilizado como um biomonitor. O modelo proposto foi eficaz, uma vez que foi capaz de responder de forma conclusiva-positiva a todos os testes realizados na sua validação, confirmando esta espécie como um biomonitor definitivo para região. A robustez do modelo irá aumentar com novas coletas e a realimentação do banco de dados. / This study aimed to develop a new methodology for the use of a biomonitor in the identification of metal discharges in environmental evaluations. Crabs of Callinectes danae species were used in an evaluation conducted in the Santos Estuarine System. In the first experiment and since C. danae is a benthic species, a preliminary assessment of the metal concentrations in sediment samples collected in the Santos Estuarine System was performed. Subsequently, a preliminary assessment of metal concentrations in the C. danae tissues was also peformed. The last experiment aimed to identify a chemical fingerprint for the Santos Estuarine System.The development of validation procedures for this model (chemical fingerprint) was conducted and aimed to test: 1) the stability of this model through time; 2) its local specificity for the Santos Estuarine System; 3) the sensibility of this model due to modifications in the metal concentrations in each tissue (gills, hepatopancreas and muscles). By the use of this model, it was possible to identify the sources of metal emissions. According to the results, C. danae can be used as a biomonitor for the Santos Estuarine System. The established model was able to responde in a positive-conclusive way to all the tests performed in its validation, confirming this species as a definitive biomonitor for this area. Thus, the stability of this model will increase with new sampling campaings and consequently introduction of new information in the database.

Uma das marcantes características morfológicas e funcionais dos crustáceos e de outros artrópodes é a presença de um exoesqueleto que cria uma barreira física para o crescimento desses animais. Nos crustáceos, a muda é um evento cíclico, dividido em 5 estágios, e um deles compreende a troca desse exoesqueleto, permitindo o aumento de tamanho. O início, período e a frequência do ciclo de muda dependem da idade e do sexo do animal e de fatores ambientais e fisiológicos. Hormônios como os ecdiesteróides e o hormônio inibidor da muda produzidos e secretados pelos órgãos Y e X, respectivamente, atuam diretamente no ciclo de muda, porém outros hormônios podem regular, de forma positiva ou negativa, este processo. A melatonina é um hormônio encontrado amplamente no reino animal, porém em crustáceos, diferentemente do que ocorre nos vertebrados, a sua síntese e secreção não estão relacionadas com a presença ou ausência de luz, e seu papel na muda tem sido pouco investigado. Os animais foram aclimatados no laboratório à temperatura 22±2 °C e ciclo claro-escuro 12h:12h LD, sendo os experimentos realizados nesta mesma condição. Considerando o acima exposto, os objetivos do presente trabalho foram (1) verificar a produção de melatonina no siri azul Callinectes sapidus, através da investigação da expressão das enzimas AANAT e ASMT no pedúnculo óptico e hepatopâncreas, bem como os níveis hemolinfáticos da indolamina; (2) avaliar se existe um perfil oscilatório diário na expressão gênica dos fatores relacionados com a muda, CasMIH e CasEcR1; (3) verificar se a manipulação com melatonina exógena influencia essa expressão. Para isso, técnicas de imunohistoquímica, citometria de fluxo, ensaio imunoenzimático e PCR quantitativo foram empregadas. Nossos resultados demonstraram uma oscilação dos níveis hemolinfáticos de melatonina em siris em pré-muda, com pico às 8 horas; entretanto, no estágio de intermuda os níveis deste hormônio foram menores e constantes ao longo de 24 horas. Não pudemos comprovar a presença das enzimas da via de síntese da melatonina, uma vez que os anticorpos utilizados não apresentaram homologia às proteínas de C. sapidus. Quanto à expressão gênica, uma oscilação diária semelhante nos transcritos dos genes CasMIH e CasEcR1 ocorreu no hepatopâncreas, independente do estágio de muda. No pedúnculo óptico a oscilação dos genes em questão também foi semelhante, mas apenas na pré-muda; na intermuda houve entre eles uma relação de anti-fase. A administração de melatonina exógena (10-7 mol/siri) levou à inibição da expressão dos genes em relação ao controle: no caso de CasMIH foi de 99,7% no pedúnculo óptico e 100% no hepatopâncreas e o CasEcR1 sofreu inibição de 77% no pedúnculo óptico e 99% no hepatopâncreas. A presença de melatonina na hemolinfa é um forte indício de que o animal a sintetiza e pode estar atuando no ciclo de muda, uma vez que a administração deste hormônio inibiu a transcrição dos genes relacionados ao processo. Diante disso, fica mais clara a relevância de entender a flutuação de hormônios que não estão classicamente envolvidos no ciclo de muda, essencial para o crescimento dos crustáceos, mas que podem apresentar a função de regular este processo, como a melatonina. Ademais, a melatonina poderá ser uma boa ferramenta a ser utilizada no cultivo do siri-azul, como agente indutor da redução do período de intermuda levando à uma ecdise precoce / One of the remarkable morphological and functional features of crustaceans and other arthropods is the presence of an exoskeleton that creates a physical barrier for the animal growth. In crustaceans, molting is a cyclic event usually divided into five stages, one of them comprising the exoskeleton exchange what thus allows the increase in size. The onset, period, and frequency of the molt cycle depend on the animal age and sex, as well as on environmental and physiological factors. Hormones such as ecdysteroids and the molt-inhibiting hormone produced and secreted by the Y- and X- organ, respectively, exert direct effects on the molt cycle. Nevertheless, other hormones are known to positively or negatively regulate this process, such as melatonin. Melatonin is a hormone widely found in the animal kingdom, but in crustaceans, differently from what happens in vertebrates, its synthesis and secretion are not regulated by the presence or absence of light. In fact, its role in the molting process has been poorly investigated. The animals were acclimated in the laboratory at 22±2 °C and light-dark cycle 12h:12h LD, and the experiments were performed under the same condition. Considering the above, the objectives of this study were to: 1) verify the production of melatonin in the blue crab Callinectes sapidus, through the evaluation of the expression of key enzymes involved in the synthesis of melatonin, AANAT and ASMT, in the eyestalk and hepatopancreas, as well as melatonin levels in the hemolymph; 2) evaluate whether there exists a daily oscillatory profile in gene expression of the related molt factors, CasMIH and CasEcR1; (3) whether the exogenous melatonin influences the expression of the latter genes. To achieve these goals, immunohistochemistry, flow cytometry, immunoenzymatic assay, and quantitative PCR techniques were used. Our results demonstrated an oscillation of the hemolymphatic levels of melatonin in premolt crabs, peaking at 8 AM; however, in the intermolt stage, the levels of this hormone were smaller and constant along 24 hours. We were not able to show the presence of the enzymes involved in melatonin synthesis, since the antibodies used had no homology with C. sapidus proteins. We also demonstrated a daily oscillatory profile of CasMIH and CasEcR1 transcripts in hepatopancreas independently of the molt stage. In the eyestalk the oscillatory profile of both genes was also similar, but only in the premolt stage; in intermolt, an antiphase relationship between both genes was found. The exogenous administration of melatonin (10-7 mol/crab) inhibited the expression of CasMIH by 99.7 and 100% in eyestalk and hepatopancreas, respectively, whereas CasEcR1 was inhibited by 77% and 99%, in the eyestalk and hepatopancreas, respectively, compared to saline-treated animals. The presence of melatonin in the hemolymph is a reliable indicator that the animal synthesizes the hormone, and thus melatonin may influence the molt cycle since it inhibited the expression of molt-related genes. Therefore, the relevance of understanding the oscillation of hormones that are not classically involved in the molt cycle - essential for crustacean growth - but which can regulate the process, becomes evident. From an economic standpoint, melatonin may be a useful tool in culturing blue crab, which ultimately can shorten the intermolt stage period leading to an early ecdysis

A caracterização bioquímica da (Na+,K+)-ATPase, uma importante enzima envolvida no controle osmo-iônico nos crustáceos osmorreguladores, foi realizada a partir de centrifugação diferencial de frações microsomais do tecido branquial do siri eurialino C. danae, coletado na Baía de Ubatuba e mantido a 33o/oo de salinidade (animais recém-capturados). A ultracentrifugação da fração microsomal em um gradiente contínuo de sacarose (10-50%) revelou a presença de um único pico de atividade (Na+, K+)-ATPase, coincidente com o pico de atividade K+-fosfatase. Ambas as atividades foram inibidas completamente pela ouabaína. O Western blotting da fração microsomal apresentou uma única banda imunoespecífica contra a subunidade alfa da (Na+, K+)-ATPase, sugerindo a presença de uma única isoforma para a cadeia alfa da enzima. A hidrólise do ATP ocorreu em sítios de alta afinidade que apresentaram interações sítio-sítio (nH=3,6) com uma atividade específica V= 35,4 ± 2,1 U/mg e K0,5= 54,0 ± 4,0 nM, bem como em sítios de baixa afinidade, que obedeceram uma cinética Michaeliana, com V= 271,5 ± 17,2 U/mg e KM = 55,0 ± 3,0 uM. A estimulação da atividade da enzima pelos íons Na+ (V= 302,1 ± 14,1 U/mg e K0,5= 5,80 ± 0,3 mM), Mg2+ (V= 309,7 ± 15,7 U/mg e K0,5= 0,48 ± 0,02 mM) e K+ (V= 294,0 ± 11,8 U/mg e K0,5= 1,61 ± 0,06 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio, enquanto a estimulação pelos íons NH4+ obedeceu a uma cinética Michaeliana com V= 377,8 ± 22,7 U/mg e KM= 4,61 ± 0,27 mM). Interessantemente, os íons NH4+ estimularam sinergisticamente a atividade específica da enzima em cerca de 90% (V= 557,0 ± 28,3 U/mg), sugerindo que esses íons se ligam em diferentes sítios na molécula. A (Na+,K+)-ATPase do tecido branquial de C. danae hidrolisou o PNFF com V= 125,4 ± 7,5 U/mg, K0,5= 1,2 ± 0,1 mM, através de interações cooperativas (nH= 1,5). Além disso, essa atividade K+-fosfatase foi inibida competitivamente pelo ATP (KI= 57,2 ± 2,6 µM), sugerindo que os dois substratos foram hidrolisados no mesmo sítio da enzima. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na+,K+)-ATPase pelos íons K+ (V= 121,0 ± 6,1 U/mg; K0,5= 2,1 ± 0,1 mM), Mg2+ (V= 125,3 ± 6,3 U/mg; K0,5= 1,0 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 126,1 ± 4,8 U/mg; K0,5= 13,7 ± 0,5 mM) ocorreram através de interações sítio-sítio, similarmente ao observado para o ATP. A ouabaína e o ortovanadato inibiram completamente a atividade (Na+,K+)-ATPase (KI= 147,2 ± 7,2 uM; KI= 11,2 ± 0,6 nM, respectivamente). Entretanto, para a atividade K+-fosfatase os valores determinados foram significativamente superiores (KI= 830,3 ± 42,5 uM; KI= 34,0 ± 1,4 nM, respectivamente). A inibição da atividade da (Na+,K+)-ATPase por essas duas substâncias foi afetada pela presença de íons NH4+. Entretanto, o mesmo não ocorreu com a atividade K+-fosfatase da enzima. A representação de Arrhenius revelou a ocorrência de uma transição de fase próximo a 19°C, com deltaH1= 15.939 cal/mol e outra a 38°C com deltaH2= 7.719 cal/mol. Temperaturas acima de 43°C provocaram uma rápida inativação da (Na+,K+)-ATPase. Esta é a primeira demonstração da presença de um sítio de alta afinidade para o ATP na (Na+,K+)-ATPase de crustáceo. Os resultados obtidos sugerem que as atividades (Na+,K+)-ATPase e K+-fosfatase pertencem à mesma enzima e que a preparação não apresenta contaminações por outras ATPases e/ou fosfatases. Do ponto de vista fisiológico, os resultados deste trabalho são relevantes em relação à excreção ativa dos íons NH4+ pelos crustáceos. / The modulation by Mg+2, Na+, K+, NH4+ ions and ATP of the (Na+, K+)-ATPase activity in a microsomal fraction from Callinectes danae gills was analyzed. ATP was hydrolyzed at high-affinity binding sites at a maximal rate of V= 35.4 ± 2.1 U/mg and K0.5= 54.0 ± 3.6 nM, obeying cooperative kinetics (nH= 3.6). At low-affinity sites, the enzyme hydrolyzed ATP obeying Michaelis-Menten kinetics with KM= 55.0 ± 3.0 uM and V= 271.5 ± 17.2 U/mg. This is the first demonstration of a crustacean (Na+, K+)-ATPase possessing two ATP hydrolyzing sites. Stimulation by sodium (K0.5= 5.80 ± 0.30 mM), magnesium (K0.5= 0.48 ± 0.02 mM) and potassium ions (K0.5= 1.61 ± 0.06 mM) exhibited site-site interactions, while that by ammonium ions obeyed Michaelis-Menten kinetics (KM= 4.61 ± 0.27 mM). Ouabain (KI= 147.2 ± 7.2 uM) and orthovanadate (KI= 11.2 ± 0.6 nM) completely inhibited ATPase activity, indicating the absence of contaminating ATPase and/or neutral phosphatase activities. Ammonium and potassium ions synergistically stimulated the enzyme, increasing specific activities up to 90%, suggesting that these ions bind to different sites on the molecule and that the presence of each ion modulates enzyme stimulation by the other. The kinetic properties of a microsomal gill (Na+,K+)-ATPase were also analyzed using p-nitrophenylphosphate as substrate. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed the substrate obeying cooperative kinetics (n= 1.5) at rates of V= 125.4 ± 7.5 U/mg and K0.5= 1.2 ± 0.1 mM and ATP competitively inhibited K+-phosphatase activity (KI= 57.2 ± 2.6 µM). Enzyme stimulation by potassium (V= 121.0 ± 6.1 U/mg; K0.5= 2.1 ± 0.1 mM) and magnesium ions (V= 125.3 ± 6.3 U/mg; K0.5= 1.0 ± 0.1 mM) was cooperative. Ammonium ions stimulated the enzyme through site-site interactions to a rate of V= 126.1 ± 4.8 U/mg with K0.5= 13.7 ± 0.5 mM. However, the K+-phosphatase activity was not synergistically stimulated using potassium plus ammonium ions. Sodium ions (KI= 36.7 ± 1.7 mM), ouabain (KI= 830.3 ± 42.5 uM) and orthovanadate (KI= 34.0 ± 1.4 nM) completely inhibited K+-phosphatase activity. The data show that the K+-phosphatase activity corresponds strictly to the (Na+,K+)-ATPase. This is the first invertebrate (Na+,K+)-ATPase shown to exhibit both high- and low-affinity sites for ATP hydrolysis and synergistic stimulation by potassium and ammonium ions (Masui et al., 2002). Further characterization of the K+-phosphatase activity will reveal its specific kinetic characteristics and may become a useful tool in comparative osmoregulatory studies.

As propriedades bioquímicas da (Na+,K+)-ATPase branquial do siri eurialino Callinectes danae aclimatado à salinidade de 15 o/oo foram estudadas. A análise do gradiente de centrifugação em sacarose revelou a presença de um único pico entre 30-35% de sacarose, com uma boa correlação entre as atividades PNFFase a ATPase totais e (Na+,K+)-ATPase. A atividade residual observada na presença de ouabaína 3 mM sugere a presença de outros sistemas de enzimas atuantes. A eletroforese em condições desnaturantes nos microsomas de brânquias de C. danae em animais recém-coletados em salinidade de 33 o/oo (não aclimatados) e de aclimatados a salinidades de 15 e 33 o/oo por um período de 10 dias mostrou a presença de pequenas diferenças nos padrões eletroforéticos das diferentes amostras. A análise por Western blot mostrou um aumento significativo da proporção relativa da subunidade alfa da (Na+,K+)-ATPase em relação à proteína total na fração microsomal do tecido branquial de animais aclimatados à salinidade de 15 o/oo quando comparados aos animais aclimatados a 33 o/oo. Entretanto, proporções similares de subunidade alfa foram observadas para amostras de animais recém-coletados a salinidade de 33 o/oo e aclimatados a 15 o/oo. A estimulação da atividade (Na+,K+)-ATPase pelo ATP ocorreu através de uma curva de saturação monofásica apresentando interações sítio-sítio (nH=1,2), com V= 298,8 ± 16,7 U/mg, com K0,5 de 174,2 ± 9,8 uM. A estimulação da atividade ATPase da (Na+,K+)-ATPase por íons Mg2+ (V= 299,16 ± 14,06 U/mg; K0,5= 767,31 ± 36,06 uM), íons Na+ (V= 309,0 ± 15,8 U/mg; K0,5= 7,8 ± 0,4 mM), íons K+ (V= 300,6 ± 15,3 U/mg; K0,5= 1,63 ± 0,08 mM) e íons NH4+ (V= 345,1 ± 19,0 U/mg; K0,5= 6,0 ± 0,3 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. A atividade da enzima foi modulada sinergisticamente pelos íons K+ com atividade máxima variando de 300,6 ± 15,3 U/mg para 514,6 ± 26,2 U/mg, na ausência e na presença 50 mM de íons NH4+, respectivamente. Além disso, foi observado um significativo aumento na afinidade aparente da enzima pelo íon K+ da ordem de 10 vezes (diminuiu de 1,6 ± 0,08 mM para 0,157 ± 0,008 mM). Similarmente ao observado para os íons K+, o íon NH4+ estimulou sinergisticamente a atividade da enzima na presença de diferentes concentrações de íons K+. A estimulação da atividade da enzima pelo íon NH4+ também ocorreu através de interações cooperativas entre os sítios. Embora tenha sido observado um aumento da atividade específica da enzima de 345,1 ± 19,0 U/mg para 516,8 ± 27,9 U/mg, não foram observadas variações significativas nos valores de nH e K0,5 com o aumento da concentração de íons K+. A ouabaína inibiu cerca de 90% da atividade ATPase total. A inibição pela ouabaína apresentou valor de KI de 45,09 ± 2,51 uM. O ortovanadato também inibiu atividade (Na+,K+)-ATPase na mesma faixa (90%) através de uma curva de inibição monofásica, com valor de KI da ordem de 1,31 ± 0,06 uM. O emprego de bafilomicina A1, tapsigargina e teofilina, juntamente com a ouabaína, na atividade ATPase total descartam a presença de V-ATPase, Ca2+-ATPase ou fosfatase, respectivamente. Apesar da inibição por oligomicina corresponder a menos de 3,7%, esse valor aparentemente sugere a presença de uma F0F1-ATPase. Além disso, a inibição por ácido etacrínico, em conjunto com os experimentos de estimulação por da atividade ATPase da enzima por íons Na+ sugere fortemente a presença de uma K+-ATPase. A (Na+,K+)-ATPase hidrolisou o substrato PNFF obedecendo à cinética Michaeliana com velocidade de V= 102,9 ± 4,3 U/mg e KM= 1,7 ± 0,1 mM. Já a estimulação da atividade K+-fosfatase da enzima por íons Mg2+ (V= 93,7 ± 2,3 U/mg; K0,5= 1,40 ± 0,03 mM), K+ (V= 94,9 ± 3,5 U/mg; K0,5= 2,9 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 106,2 ± 2,2 U/mg; K0,5= 9,8 ± 0,2 mM) seguiu uma cinética cooperativa, sugerindo a presença de múltiplos sítios de ligação. Entretanto, a atividade K+-fosfatase não foi estimulada sinergísticamente na presença de íons K+ mais NH4+. Os íons sódio (KI= 22,7 ± 1,7 mM) e ortovanadato (KI= 28,1 ± 1,4 nM) inibiram completamente a atividade fosfatase total através de uma única curva de inibição. / The biochemical properties of the (Na+,K+)-ATPase from the gill microsomal tissue of the euryhaline, marine, swimming crab Callinectes danae, acclimated to 15 0/00 salinity, were investigated. Sucrose gradient centrifugation analyses revealed a unique peak, between 30-35% sucrose, coincident with the total PNPPase, ATPase, and (Na+,K+)-ATPase activities. The residual activity observed in the presence of 3 mM ouabain suggests the existence of other enzyme systems. Electrophoresis under denaturing conditions, using material from fresh-caught crabs (33 o/oo salinity, not acclimated), and from crabs acclimated to 15 or 33 o/oo salinity, for 10 days, revealed differences in migration pattern. Western blot analyses showed a significant increase in the amount of (Na+,K+)-ATPase alpha-subunit relative to total protein, for crabs acclimated to 15 o/oo compared to those acclimated to 33 o/oo salinity. However, the proportion of alpha-subunit in samples from fresh-caught crabs acclimated to 33 o/oo and those acclimated to 15 o/oo salinity was similar. (Na+,K+)-ATPase activity was stimulated by ATP and showed a single saturation curve, exhibiting site-site interactions (nH=1.2), with V= 298.8 ± 16.7 U/mg, and K0.5= 174.2 ± 9.8 uM. Stimulation of the ATPase activity by Mg2+ (V= 299.16 ± 14.06 U/mg; K0.5= 767.31 ± 36.06 uM), Na+ (V= 309.0 ± 15.8 U/mg; K0.5= 7.8 ± 0.4 mM), K+ (V= 300.6 ± 15.3 U/mg; K0.5= 1.63 ± 0.08 mM) and NH4+ ions (V= 345.1 ± 19.0 U/mg; K0.5= 6.0 ± 0.3 mM) occurred through site-site interactions. (Na+,K+)-ATPase activity was synergistically modulated by K+ ions, maximum activity varying from 300.6 ± 15.3 U/mg to 514.6 ± 26.2 U/mg, in the absence and presence of 50 mM NH4+ ions, respectively. K+ ions induced a 10-fold increase in enzyme apparent affinity (from 1.6 ± 0.08 mM to 0.157 ± 0.008 mM). As for K+ ions, NH4+ synergistically stimulated enzyme activity in the presence of variable K+ concentrations. The stimulation by NH4+ ions exhibited cooperative, site-site interactions. Although an increase in specific activity from 345.1 ± 19.0 U/mg to 516.8 ± 27.9 U/mg was seen, no significant changes in nH and K0.5 were observed. Ouabain inhibited total ATPase activity by about 90%, showing a KI= 45.09 ± 2.51 uM. Orthovanadate also inhibited the (Na+,K+)-ATPase with a KI of 1.31 ± 0.06 uM. Although the inhibitory effect of oligomycin was minimal (3.7%), this inhibition may suggest F0F1-ATPase activity. The inhibition by ethacrynic acid, in association with Na+ ion stimulation of the ATPase activity, suggests the presence of a K+-ATPase. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed PNPP (K+-phosphatase activity) obeying Michaelian kinetics, with V= 102.9 ± 4.3 U/mg and KM= 1.7 ± 0.1 mM. The stimulation of K+-phosphatase activity by Mg2+ (V= 93.7 ± 2.3 U/mg; K0.5= 1.4 ± 0.03 mM), K+ (V= 94.9 ± 3.5 U/mg; K0.5= 2.9 ± 0.1 mM), and NH4+ ions (V= 106.2 ± 2.2 U/mg; K0.5= 9.8 ± 0.2 mM) following cooperative kinetics, suggests multiple binding sites. K+-phosphatase activity, however, was not synergistically stimulated by K+ and NH4+. Sodium ions (KI= 22.7 ± 1.7 mM), and orthovanadate (KI= 28.1 ± 1.4 nM) totally inhibited the total phosphatase activity.

As propriedades bioquímicas da (Na+,K+)-ATPase branquial do siri eurialino Callinectes danae aclimatado à salinidade de 15 o/oo foram estudadas. A análise do gradiente de centrifugação em sacarose revelou a presença de um único pico entre 30-35% de sacarose, com uma boa correlação entre as atividades PNFFase a ATPase totais e (Na+,K+)-ATPase. A atividade residual observada na presença de ouabaína 3 mM sugere a presença de outros sistemas de enzimas atuantes. A eletroforese em condições desnaturantes nos microsomas de brânquias de C. danae em animais recém-coletados em salinidade de 33 o/oo (não aclimatados) e de aclimatados a salinidades de 15 e 33 o/oo por um período de 10 dias mostrou a presença de pequenas diferenças nos padrões eletroforéticos das diferentes amostras. A análise por Western blot mostrou um aumento significativo da proporção relativa da subunidade alfa da (Na+,K+)-ATPase em relação à proteína total na fração microsomal do tecido branquial de animais aclimatados à salinidade de 15 o/oo quando comparados aos animais aclimatados a 33 o/oo. Entretanto, proporções similares de subunidade alfa foram observadas para amostras de animais recém-coletados a salinidade de 33 o/oo e aclimatados a 15 o/oo. A estimulação da atividade (Na+,K+)-ATPase pelo ATP ocorreu através de uma curva de saturação monofásica apresentando interações sítio-sítio (nH=1,2), com V= 298,8 ± 16,7 U/mg, com K0,5 de 174,2 ± 9,8 uM. A estimulação da atividade ATPase da (Na+,K+)-ATPase por íons Mg2+ (V= 299,16 ± 14,06 U/mg; K0,5= 767,31 ± 36,06 uM), íons Na+ (V= 309,0 ± 15,8 U/mg; K0,5= 7,8 ± 0,4 mM), íons K+ (V= 300,6 ± 15,3 U/mg; K0,5= 1,63 ± 0,08 mM) e íons NH4+ (V= 345,1 ± 19,0 U/mg; K0,5= 6,0 ± 0,3 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. A atividade da enzima foi modulada sinergisticamente pelos íons K+ com atividade máxima variando de 300,6 ± 15,3 U/mg para 514,6 ± 26,2 U/mg, na ausência e na presença 50 mM de íons NH4+, respectivamente. Além disso, foi observado um significativo aumento na afinidade aparente da enzima pelo íon K+ da ordem de 10 vezes (diminuiu de 1,6 ± 0,08 mM para 0,157 ± 0,008 mM). Similarmente ao observado para os íons K+, o íon NH4+ estimulou sinergisticamente a atividade da enzima na presença de diferentes concentrações de íons K+. A estimulação da atividade da enzima pelo íon NH4+ também ocorreu através de interações cooperativas entre os sítios. Embora tenha sido observado um aumento da atividade específica da enzima de 345,1 ± 19,0 U/mg para 516,8 ± 27,9 U/mg, não foram observadas variações significativas nos valores de nH e K0,5 com o aumento da concentração de íons K+. A ouabaína inibiu cerca de 90% da atividade ATPase total. A inibição pela ouabaína apresentou valor de KI de 45,09 ± 2,51 uM. O ortovanadato também inibiu atividade (Na+,K+)-ATPase na mesma faixa (90%) através de uma curva de inibição monofásica, com valor de KI da ordem de 1,31 ± 0,06 uM. O emprego de bafilomicina A1, tapsigargina e teofilina, juntamente com a ouabaína, na atividade ATPase total descartam a presença de V-ATPase, Ca2+-ATPase ou fosfatase, respectivamente. Apesar da inibição por oligomicina corresponder a menos de 3,7%, esse valor aparentemente sugere a presença de uma F0F1-ATPase. Além disso, a inibição por ácido etacrínico, em conjunto com os experimentos de estimulação por da atividade ATPase da enzima por íons Na+ sugere fortemente a presença de uma K+-ATPase. A (Na+,K+)-ATPase hidrolisou o substrato PNFF obedecendo à cinética Michaeliana com velocidade de V= 102,9 ± 4,3 U/mg e KM= 1,7 ± 0,1 mM. Já a estimulação da atividade K+-fosfatase da enzima por íons Mg2+ (V= 93,7 ± 2,3 U/mg; K0,5= 1,40 ± 0,03 mM), K+ (V= 94,9 ± 3,5 U/mg; K0,5= 2,9 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 106,2 ± 2,2 U/mg; K0,5= 9,8 ± 0,2 mM) seguiu uma cinética cooperativa, sugerindo a presença de múltiplos sítios de ligação. Entretanto, a atividade K+-fosfatase não foi estimulada sinergísticamente na presença de íons K+ mais NH4+. Os íons sódio (KI= 22,7 ± 1,7 mM) e ortovanadato (KI= 28,1 ± 1,4 nM) inibiram completamente a atividade fosfatase total através de uma única curva de inibição. / The biochemical properties of the (Na+,K+)-ATPase from the gill microsomal tissue of the euryhaline, marine, swimming crab Callinectes danae, acclimated to 15 0/00 salinity, were investigated. Sucrose gradient centrifugation analyses revealed a unique peak, between 30-35% sucrose, coincident with the total PNPPase, ATPase, and (Na+,K+)-ATPase activities. The residual activity observed in the presence of 3 mM ouabain suggests the existence of other enzyme systems. Electrophoresis under denaturing conditions, using material from fresh-caught crabs (33 o/oo salinity, not acclimated), and from crabs acclimated to 15 or 33 o/oo salinity, for 10 days, revealed differences in migration pattern. Western blot analyses showed a significant increase in the amount of (Na+,K+)-ATPase alpha-subunit relative to total protein, for crabs acclimated to 15 o/oo compared to those acclimated to 33 o/oo salinity. However, the proportion of alpha-subunit in samples from fresh-caught crabs acclimated to 33 o/oo and those acclimated to 15 o/oo salinity was similar. (Na+,K+)-ATPase activity was stimulated by ATP and showed a single saturation curve, exhibiting site-site interactions (nH=1.2), with V= 298.8 ± 16.7 U/mg, and K0.5= 174.2 ± 9.8 uM. Stimulation of the ATPase activity by Mg2+ (V= 299.16 ± 14.06 U/mg; K0.5= 767.31 ± 36.06 uM), Na+ (V= 309.0 ± 15.8 U/mg; K0.5= 7.8 ± 0.4 mM), K+ (V= 300.6 ± 15.3 U/mg; K0.5= 1.63 ± 0.08 mM) and NH4+ ions (V= 345.1 ± 19.0 U/mg; K0.5= 6.0 ± 0.3 mM) occurred through site-site interactions. (Na+,K+)-ATPase activity was synergistically modulated by K+ ions, maximum activity varying from 300.6 ± 15.3 U/mg to 514.6 ± 26.2 U/mg, in the absence and presence of 50 mM NH4+ ions, respectively. K+ ions induced a 10-fold increase in enzyme apparent affinity (from 1.6 ± 0.08 mM to 0.157 ± 0.008 mM). As for K+ ions, NH4+ synergistically stimulated enzyme activity in the presence of variable K+ concentrations. The stimulation by NH4+ ions exhibited cooperative, site-site interactions. Although an increase in specific activity from 345.1 ± 19.0 U/mg to 516.8 ± 27.9 U/mg was seen, no significant changes in nH and K0.5 were observed. Ouabain inhibited total ATPase activity by about 90%, showing a KI= 45.09 ± 2.51 uM. Orthovanadate also inhibited the (Na+,K+)-ATPase with a KI of 1.31 ± 0.06 uM. Although the inhibitory effect of oligomycin was minimal (3.7%), this inhibition may suggest F0F1-ATPase activity. The inhibition by ethacrynic acid, in association with Na+ ion stimulation of the ATPase activity, suggests the presence of a K+-ATPase. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed PNPP (K+-phosphatase activity) obeying Michaelian kinetics, with V= 102.9 ± 4.3 U/mg and KM= 1.7 ± 0.1 mM. The stimulation of K+-phosphatase activity by Mg2+ (V= 93.7 ± 2.3 U/mg; K0.5= 1.4 ± 0.03 mM), K+ (V= 94.9 ± 3.5 U/mg; K0.5= 2.9 ± 0.1 mM), and NH4+ ions (V= 106.2 ± 2.2 U/mg; K0.5= 9.8 ± 0.2 mM) following cooperative kinetics, suggests multiple binding sites. K+-phosphatase activity, however, was not synergistically stimulated by K+ and NH4+. Sodium ions (KI= 22.7 ± 1.7 mM), and orthovanadate (KI= 28.1 ± 1.4 nM) totally inhibited the total phosphatase activity.

Made available in DSpace on 2015-02-04T21:42:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rossana Helena Pitta Virga.pdf: 7486817 bytes, checksum: a4326e2ffe0867f72d0a87a60718e71b (MD5) Previous issue date: 2006-08-14 / Metais pesados por não serem biodegradáveis podem se acumular nos tecidos vivos ao longo da cadeia alimentar chegando ao homem principalmente por meio da alimentação. Siris e outros organismos que se alimentam de matéria orgânica existente em sistemas aquáticos, podem absorver uma carga maior destes contaminantes e assim, representar um risco potencial à saúde da população da região. Neste trabalho, foram realizados estudos quantitativos sobre o teor de Pb, Cd, Cr, Zn e Cu em quatro espécies de siri-azul do gênero Callinectes (C. sapidus, C. danae, C. bocourti e C. ornatus), coletados ao longo do rio Cubatão, utilizando um Espectrofotômetro de Absorção Atômica por Chama (EAA). A análise estatística dos resultados experimentais foi efetuada com o auxílio do programa SYSTAT utilizando a rotina GLM com análise de resíduo. Foram analisados 144 siris do gênero Callinectes distribuídos da seguinte forma: C. danae (63%), C. sapidus (23%), C. bocourti (10,5%) e C. ornatus ( 3,5%). Todos os teores de metais pesados encontrados nas quatro espécies de siris azuis estiveram abaixo do limite máximo permitido pela legislação brasileira. A espécie Callinectes sapidus foi a que apresentou a maior concentração dos metais. Com exceção do Cu, onde foi obtida uma concentração 40% maior nas fêmeas (p < 0,05), não houve variação significativa no teor dos metais pesados com relação tanto à classe de comprimento quanto ao sexo dos animais. Embora não tenha sido identificada contaminação nos siris azuis do gênero Callinectes da região de Cubatão, recomenda-se um monitoramento periódico destes animais, uma vez que possuem hábito onívoro e se alimentam de detritos que ficam nos sedimentos podendo, portanto, acumular poluentes e transferí-los para os humanos através do seu consumo.

<p>Reactive oxygen species (ROS) are produced endogenously in all aerobes and are induced by environmental stressors. ROS oxidize and disable essential cellular components such as DNA, proteins, and lipid membranes. Exposure to metals, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), and some pesticides can induce oxidative stress in marine invertebrates. All aerobic organisms have a network of antioxidants and enzymes to quench ROS and prevent oxidative damage. This dissertation examines antioxidant and oxidative stress biomarkers in endemic molluscs and crabs from two natural extreme environments: deep-sea hydrothermal vents in the Lau and North Fiji Basin, and cold seeps in the Gulf of Mexico. In addition, the acute toxicity and sub-lethal effects of four insecticides and an herbicide are examined in the estuarine blue crab, <italics>Callinectes sapidus</italics>. Blue crabs are North Carolina's most important fishery species and are frequently found in agricultural drainage ditches, an example of an anthropogenic extreme environment. </p> <p>Total glutathione, catalase, superoxide dismutase, and lipid peroxidation levels were of the same respective order of magnitude in the two vent gastropods, <italics>Alviniconcha</italics> sp. and <italics>Ifremeria nautilei</italics>, and vent mussel, <italics>Bathymodiolus brevior</italics>. These biomarkers activities were similar to those from previous reports on Mid-Atlantic Ridge mussels, except for ~100-fold higher lipid peroxidation levels among Lau molluscs. Principal component analysis (PCA) of mollusc tissue-specific biomarker levels grouped individuals by species rather than by site. </p> <p>Biomarker levels in the seep mussels <italics>Bathymodiolus childressi, B. brooksi</italics>, and <italics>B. heckerae</italics> were similar across species except for elevated foot and gill cytosolic SOD in mussels from MC-640 compared to those from AC-645. PCA of seep mussel biomarker levels differentiated by species with <italics>B. childressi</italics> isolated from <italics>B. brooksi</italics> and <italics>B. heckerae</italics>. The addition of <italics>B. brevior</italics> biomarker data to the PCA showed them grouping around <italics>B. brooksi</italics> and <italics>B. heckerae</italics>. <italics>Bathymodiolus childressi</italics> is ancestral to the other species and contains only methanotrophic endosymbionts. Whether symbionts play a role in alleviating possible toxic conditions remains unknown.</p> <p>Pesticides were acutely toxic to blue crabs in the order of Lambda-cyhalothrin > imidacloprid &#8776; aldicarb > acephate &#8776; Roundup® (glyphosate). Megalopae were almost always more sensitive to pesticides than early stage juveniles. Commercial formations of pesticides generally showed similar toxicity to active ingredients alone. Exposure to LC₂₀ levels of acephate, aldicarb, imidacloprid and Roundup significantly increased the frequency of juvenile mortality after molting. There was no significant change in total glutathione or lipid peroxidation of exposed megalopae. Lambda-cyhalothrin-, imidacloprid-, and aldicarb-based products have the potential to cause acute toxicity and molting-related mortality in shallow creeks and ditches.</p> / Dissertation