Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-05-09T16:15:34Z No. of bitstreams: 1 2013_CristianoGuimaraesAmaralPinheiro.pdf: 98196823 bytes, checksum: 92ddc22d9a3c0935f9972f02346c75be (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-14T11:22:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_CristianoGuimaraesAmaralPinheiro.pdf: 98196823 bytes, checksum: 92ddc22d9a3c0935f9972f02346c75be (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-14T11:22:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_CristianoGuimaraesAmaralPinheiro.pdf: 98196823 bytes, checksum: 92ddc22d9a3c0935f9972f02346c75be (MD5) / O papel fundamental dos canais catiônicos dependentes de voltagem (VGCC) nos mais diversos organismos baseia-se no seu complexo mecanismo de ativação, i.e a transição entre dois estado fisiológicos funcionais desses canais: ativado/aberto (AT) e desativado/fechado (RT). Logo após a publicação da primeira estrutura cristalográfica do canal de mamífero Kv1.2 na conformação AT, alguns modelos do estado RT tem sido propostos na literatura para este canal. Para todos esses modelos, análises estruturais tem sugerido um consenso com os dados experimentais, destacando portanto a natureza inequívoca dessas estruturas RT. Tomados em conjunto, os estudos estruturais sobre o Kv1.2 são até agora o único conjunto de dados disponível, no nível das interações atômicas, para o entendimento sobre o mecanismo de ativação da superfamília VGCC. Recentemente, a estrutura cristalográfica de um canal de sódio de procarioto, dependente de voltagem (NavAb), foi resolvida numa conformação interpretada como estado pré-ativado do canal. Como um possível ancestral da superfamília dos canais de sódio e cálcio dependentes de voltagem de vertebrados, o surgimento da estrutura atomística do NavAb nos proporciona a primeira, e até então a única, estrutura de alta resolução para estender nossa compreensão sobre outros membros da superfamília VGCC. Dessa forma, de modo a contribuir com o referido tema, consideramos as estruturas AT e RT do Kv1.2, equilibradas na membrana, como guias estruturais em uma série de simulações de dinâmica molecular no intuito de investigar o processo de ativação do canal NavAb. Além de identificar a estrutura cristalográfica do NavAb como um estado intermediário dentro do caminho de ativação, nosso trabalho permitiu determinar conformações relacionadas aos estados fisiológicos funcionais estruturalmente relacionados às estruturas AT e RT. De maneira geral, os resultados suportam a ideia de um mecanismo de ativação altamente conservado ao longo de toda a superfamília de VGCC. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The critical role of voltage-gated cation channels (VGCCs) relies on a complex voltage-dependent activation mechanism linking two physiologically relevant channel states, activated- open (AT) and resting-closed (RT) states. Following the early publication of the x-ray crystal structure of the mammalian Kv1.2 channel in the AT conformation, atomistic models for the RT state of the channel have been proposed. For all of these models, structural analyses demonstrated a consensual explanation of experimental data, thereby highlighting the unambiguous nature of these RT structures. Taken together, these structural studies on Kv1.2 have contributed so far with most of our atomic-level knowledge on the activation mechanism of VGCCs. More recently, the x-ray structure of a prokaryotic voltage-gated sodium channel, NavAb, was resolved in a conformation that was interpreted as representative of the pre-open state of the channel. As one of the possible ancestors of the large family of vertebrate voltage- + ++gated Na and Ca channels, the appearance of the NavAb structure has provided us with a first, and so far unique, template to extend our knowledge towards other members of the large family of VGCCs. Accordingly, in this contribution, we have considered the well-understood AT and RT structures of Kv1.2, equilibrated in a lipid bilayer, as guide structural models to drive a series of molecular dynamics (MD) simulations aimed at to study the activation process of NavAb. While identifying the reported NavAb structure as an intermediate conformation, not fully-activated, our work has enabled us to determine channel conformations likely related to the RT and AT states of the channel. Overall, the structural results support an activation mechanism highly conserved across the entire family of VGCCs.

Canais iônicos são nanoporos aquosos formados por proteínas imersas na membrana celular. Sua função biológica básica é permitir o transporte de íons no sentido de seu gradiente eletroquímico. Dada a enorme quantidade de processos biológicos relacionados ao movimento iônico, a importância dos canais iônicos em biologia e medicina dificilmente pode ser exagerada. Neste trabalho, apresentamos uma introdução à vasta área do conhecimento de canais iônicos, discutimos suas perspectivas em pesquisa básica e aplicada e, em especial, a importância do estudo computacional da permeação iônica por canais. Seguimos analisando o estado da arte em relação a modelos computacionais de canais iônicos e discutindo criticamente as vantagens e desvantagens das abordagens existentes, fazendo considerações sobre suas perspectivas. Concluindo que a técnica de Dinâmica Browniana apresenta potencial para o estudo de propriedades básicas da condução iônica por nanoporos, propomos um modelo simples de canal iônico unidimensional através desta técnica para uma geometria que permite solução analítica da equação de Poisson, a qual é apresentada. A simplicidade do modelo proposto lhe confere grande eficiência computacional, a qual é ampliada com a proposta de um critério de “tempo de injeção” dos íons no canal, cuja expressão é demonstrada e que poupa o simulador de considerar explicitamente dois reservatórios eletrolíticos junto ao canal. O simulador desenvolvido baseado neste modelo é estudado e comparado com a literatura, mostrando bons resultados em sua região esperada de validade. Dado o estágio atual do estudo computacional de canais iônicos, é importante dispormos de modelos conceitualmente simples e computacionalmente eficientes. A sua existência possibilita, por exemplo, estudos de Dinâmica Molecular muito eficientes considerando a água explicitamente, algo importante para a análise de novos modelos da água adequados a nanoporos. / Ion channels are nanopores formed through the cell membrane by proteins. Their basic biological function is allowing ionic transport down the electrochemical gradient. Given the huge amount of biological processes that are related to ionic fluxes, the biological and medical importance of ion channels hardly can be overstated. In this work we present a brief introduction to the vast field of ion channels and discuss its perspectives in basic and applied research, emphasizing the importance of computational approaches to study ion permeation through channels. Next, we analyze the state of the art regarding computational models of ion channels, critically discussing the advantages and disadvantages of the current approaches and considering the perspectives of each. We conclude that the Brownian Dynamics approach has potential to be used to study ionic conductance through nanopores and we propose a simple Brownian Dynamics unidimensional channel model for a geometry that allows analytical solution of the Poisson equation, which is presented. The simplicity of the proposed model grants it great computational efficiency, which is further amplified with the proposal of an “injection time” criterion to allow ions to enter the channel. The formula for the “injection time” is demonstrated and its implementation lifts the requirement to simulate two reservoirs next to the channel. The simulator developed based on this model is studied and its results are compared with the literature, showing good agreement in its expected region of validity. Given the current state of computational study of ion channels, it is important to have simple and efficient models, such as ours, available. For instance, their existence allows the realization of very fast Molecular Dynamics studies that consider water explicitly, something very important for the analysis of new explicitly polarizable water models that are required for nanopores.

Esta dissertação apresenta uma revisão sobre canais iônicos com respeito aos seus aspectos biofísicos e sobre alguns modelos matemáticos utilizados em sua análise. As abordagens dividem-se em duas classes: uma em que é possível realizar análises exatas e outra mais apropriada à análise numérica. Será revista a solução da equação de Poisson em coordenandas toroidais, que fornece uma expressão para o potencial elétrico na região do canal. Uma outra abordagem estudada utiliza os ensembles da mecânica estatística de equilíbrio para determinar a forma do potencial elétrico médio nessa mesma região. As descrições destinadas à análise numérica compreendem: uma formulação em que todos os elementos são considerados como meios contínuos; a Dinâmica Browniana e a Dinâmica Molecular. A dissertação é encerrada com a apresentação de alguns resultados experimentais sobre canais reais. Ao final, o leitor deverá ter um panorama sobre os estudos, teóricos e aplicados, no campo da condução passiva de íons através de membranas celulares. Esta dissertação não tem por finalidade esgotar os tópicos que abrangem esta área do conhecimento. / This dissertation presents a review about ion channels with respect to their biophysical aspects and some mathematical models employed in its analysis. Our approach is separated in two parts: one where it is possible to achieve exact results and another more suitable to numerical analysis. There will be reviewed a solution for Poisson’s equation in toroidal coordinates which gives an expression for electrical potential in the region of the channel. Also, There will be reviewed the mean force potential formulation derived from the ensembles of equilibrium statistical mechanics. The numerical analysis approach comprehends formulations where all elements are considered as a continuum media and via Brownian Dynamics and the Molecular Dynamics. This dissertation finishes with a discussion of some experimental results about real channels. At the end of this all, the reader should have an overview about the studies, both theoretical and applied, in the field of passive conduction of ions through cell membranes. However, this dissertation has no intention to be a comprehensive review of the subject.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-10-25T11:17:38Z No. of bitstreams: 1 2017_HarryMoralesDuque.pdf: 4563170 bytes, checksum: c4e65c2f9e037eeb6f5786fa0c41a04a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-30T19:39:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_HarryMoralesDuque.pdf: 4563170 bytes, checksum: c4e65c2f9e037eeb6f5786fa0c41a04a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-30T19:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_HarryMoralesDuque.pdf: 4563170 bytes, checksum: c4e65c2f9e037eeb6f5786fa0c41a04a (MD5) Previous issue date: 2017-10-30 / Toxinas de escorpiões têm sido alvo de pesquisa dada suas propriedades farmacológicas. Estas toxinas agem sobre quatro tipos de canais iônicos (Na+ , K+ , Ca++ e Cl- ). As que agem sobre os canais iônicos para sódio (NaScTx) são divididas em dois grupos α- ou β-toxinas segundo seu alvo molecular dentro desses canais iônicos. As primeiras interferem na cinética de inativação e as do segundo grupo afetam a cinética de ativação do canal iônico alvo. Muitas destas toxinas já foram identificadas e testadas sobre diferentes alvos farmacológicos. A maioria é proveniente de escorpiões da família Buthidae, conhecidos como os escorpiões de relevância médica devido à capacidade toxica de sua peçonha. No entanto, ainda falta elucidar sobre toxinas das peçonhas de espécies potencialmente perigosas à saúde humana. A pesquisa de toxinas está sendo promissora para diversos estudos e desenvolvimento biotecnológico. Dado que a maioria age sobre canais iônicos, elas se tornam ferramentas para estudar interações ou mecanismos moleculares de ação desses alvos. Portanto, as toxinas podem favorecer direta ou indiretamente no desenvolvimento de estratégias para tratar, por exemplo, doenças como as canalopatias. Tityusobscurus é um escorpião que ocorre no norte do Brasil, onde acontecem acidentes por sua picada. Os componentes de sua peçonha estão sendo pesquisados e os alvos farmacológicos das NaScTxs descritas ainda não foram identificados. Neste trabalho, pela primeira vez, duas NaScTxs (To4 e To5) foram purificadas da peçonha de T. obscurus por cromatografia RP-HPLC, sequênciadas por in-sourcedecay ISD e por meio da biblioteca de cDNA previamente descrita. A validação do alvo molecular especifico destas toxinas foi realizada testando sete subtipos de canais iônicos humanos hNav1.1 – hNav1.7 usando a técnica eletrofisiológica de patch clamp. Adicionalmente, tentou-se expressar a toxina To5 heterólogamente em Escherichia coli, visando comparar a atividade eletrofisiológica desta com a nativa. Nossos resultados mostraram que tanto a To4, quanto a To5 são β-toxinas que afetam a ativação e correntes de todos os canais iônicos testados. Estas toxinas não mostraram algum efeito tipo α, assim, descarta-se a possibilidade de estas agirem sobre outro sitio destes canais testados. Futuros testes eletrofisiológicos poderão ser feitos sobre canais iônicos próprios de inseto, já que estas duas toxinas potencialmente agem nos dois grupos taxonômicos. Dada sua capacidade promiscua sobre os hNavs testados, as toxinas To4 e To5 mostram ser componentes virtualmente tóxicos da peçonha deste escorpião. Estes e outros componentes dessa peçonha tornam do T. obscurus, um escorpião potencialmente perigoso à saúde humana. / Scorpion toxins have been research targets due its pharmacological properties. They can target four ion-channels types (Na+ , K+ , Ca++ e Cl- ). Such toxins active on sodium channels (NaScTx) have two interaction points on them, thus being classified as α- or β-toxins. The first group interferes with the kinetic inactivation, and the second group affects the kinetic activation from sodium channels (Navs). Several toxins were identified and tested on pharmacological targets. Most of these are from Buthidae scorpion family, a taxonomic group considered as of medical relevance. It is necessary to elucidate toxins from potentially dangerous scorpion venom species yet not described. The toxins study is being promissory to diverse research and biotechnological development. Due that the most of them target on ion channels, they would become tools to ion channels interaction studies or action molecular mechanisms analysis of them. Thus, toxins could promote direct or indirectly the strategies development to treat, for example, diseases as channelopathies. Tityus obscurus scorpion from north of Brazil is cause of accidents for sting. Its venom components are being investigated, among them, the described NaScTxs do not have the target Navdefined. By first time, in this work, two T. obscurusNaScTxs (To4 e To5) were purified from venom by RP-HPLC chromatography, sequenced by in-source decay ISD and by cDNA library previously described. The specific molecular target validation was testing the human Navs (hNav1.1 – hNav1.7) by electrophysiological technique patch clamp. Additionally, To5 toxin was expressed in Escherichia coli to perform futures electrophysiological tests. Our results showed than To4 and To5 are β-toxins affecting the both activation and ionic currents from all hNavs isoforms tested. These toxins did not show α- activity discarding other possible target site on these hNavs. Electrophysiological tests on insect Navs are recommended because these toxins are potentially active on them. The promiscuous capacity of the To4 and To5 toxins on hNavs make of them compounds potentially toxic to humans. The T. obscurus venom would be potentially dangerous to human health.

Orientador: Eduardo Tené Pérez González / Banca: Hans Viertler / Banca: Ricardo Maurício Xavier Leão / O Programa de Pós Graduação em Ciência e Tecnologia dos Materiais, PosMat, tem caráter institucional e integra as atividades de pesquisa em materiais de diversos campi / Resumo: O desenvolvimento de novos fármacos mais eficientes, menos tóxicos e com menores efeitos colaterais, tem se mostrado um tema de grande importância e interesse científico. Neste contexto o presente trabalho apresenta a síntese de N-alquilsulfonamidas análogos do PABA, com potencial propriedades farmacológicas interessantes como efeito ou atividade bloqueadora sobre canais iônicos de potássio dependentes de voltagem. Além disso, algumas dessas sulfonamidas sintetizadas apresentam N-(aminoalquil)-lactamas como cadeia lateral. Estes grupos lactânicos que têm sido descritos como inibidores de tryptase humana, um mediador importante na asma, e atividade como inibidores de protease do HIV-1. As análises físico-químicas foram realizadas por diferentes técnicas espectroscópicas (RMN de 1H e 13C, FT-IR) e espectrométricas (EI-MS e ESI-MS). As estruturasde todos os compostos foram confirmadas sem ambiguidade. Foi realizado um estudo por espectrometria de massas de alta resolução para todos os produtos. Esse estudo permitiu observar a formação do íon sulfoxilato e propor mecanismos para explicar este e outros fragmentos experimentais. As moléculas sintetizadas estão sob investigação para determinar sua atividade inibitória de canais de potássio. Algumas moléculas mostraram bons resultados / Abstract: The development of new drugs more efficient, less toxic and with fewer side effects has been a subject of great importance and scientific interest. Un this context the present work shows the sythesis of new sulfonated compounds analogues of PABA, with potential interesting pharmacological properties, as the effect or blocking activity on ion channels of voltage gated potassium. In addition, some of these sufonamides, have N-(aminoalkyl) lactams as side chain. These lactamic groups have been described as inhibitors of human tryptase, an important mediator in asthma, and activity as HIV-1 protease inhibitors. The physical-chemical analyses have been carried out by different spectrocopic (1H and 13C NMR, FT-IR) and spectrometric techniques (EI-MS and ESI-MS). The structures of all compounds were unambiguously confirmed. A study for High Resolution Mass Spectrometry was peformed for all products. This study allowed to observe the formation of sulfoxylates ions and to propouse mechanisms to explain this and other experimental fragments. The synthesized molecules are under current investigation of its inhibiting channels and some molecules showed good results / Mestre

Esta dissertação apresenta uma revisão sobre canais iônicos com respeito aos seus aspectos biofísicos e sobre alguns modelos matemáticos utilizados em sua análise. As abordagens dividem-se em duas classes: uma em que é possível realizar análises exatas e outra mais apropriada à análise numérica. Será revista a solução da equação de Poisson em coordenandas toroidais, que fornece uma expressão para o potencial elétrico na região do canal. Uma outra abordagem estudada utiliza os ensembles da mecânica estatística de equilíbrio para determinar a forma do potencial elétrico médio nessa mesma região. As descrições destinadas à análise numérica compreendem: uma formulação em que todos os elementos são considerados como meios contínuos; a Dinâmica Browniana e a Dinâmica Molecular. A dissertação é encerrada com a apresentação de alguns resultados experimentais sobre canais reais. Ao final, o leitor deverá ter um panorama sobre os estudos, teóricos e aplicados, no campo da condução passiva de íons através de membranas celulares. Esta dissertação não tem por finalidade esgotar os tópicos que abrangem esta área do conhecimento. / This dissertation presents a review about ion channels with respect to their biophysical aspects and some mathematical models employed in its analysis. Our approach is separated in two parts: one where it is possible to achieve exact results and another more suitable to numerical analysis. There will be reviewed a solution for Poisson’s equation in toroidal coordinates which gives an expression for electrical potential in the region of the channel. Also, There will be reviewed the mean force potential formulation derived from the ensembles of equilibrium statistical mechanics. The numerical analysis approach comprehends formulations where all elements are considered as a continuum media and via Brownian Dynamics and the Molecular Dynamics. This dissertation finishes with a discussion of some experimental results about real channels. At the end of this all, the reader should have an overview about the studies, both theoretical and applied, in the field of passive conduction of ions through cell membranes. However, this dissertation has no intention to be a comprehensive review of the subject.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-05-27T15:35:37Z No. of bitstreams: 1 2013_LeticiaStockVieira.pdf: 18600579 bytes, checksum: 14a54125f3b23d05237dce58119ad628 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-27T16:11:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_LeticiaStockVieira.pdf: 18600579 bytes, checksum: 14a54125f3b23d05237dce58119ad628 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-27T16:11:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_LeticiaStockVieira.pdf: 18600579 bytes, checksum: 14a54125f3b23d05237dce58119ad628 (MD5) / Canais iônicos (CIs) são proteínas transmembrânicas capazes de regular o fluxo de íons, para dentro e para fora das células, abrindo e fechando seus poros. Tal regulação se da em resposta a diferentes estímulos, como ligação de moléculas, diferenças de potencial eletrostático, estímulos mecânicos, etc. Além disso, em geral, CIs são altamente seletivos a um íon. Assim, em função do íon transportado pelo canal, estes podem ser denominados canais de Na+, K+, Ca++ ou Cl-. O funcionamento de CIs está relacionado a uma variedade de funções biológicas essenciais como: contração muscular, sinapses, geração e transmissão de impulsos nervosos, controle da pressão osmótica, secreção hormonal, percepção do ambiente e consciência, entre outros. Portanto, essas proteínas tem sido alvo de intensas investigações ao longo das ultimas décadas. Diversas estruturas cristalográficas de canais iônicos foram resolvidas nos últimos anos. Conjuntamente com avanços no poder computacional, tais estruturas possibilitam a investigação de CIs com alta resolução, via simulações de dinâmica molecular (DM). Em 2011 foi publicada a primeira estrutura cristalográfica de canal de Na+: um CI bacteriano denominado NavAb (Payandeh et al., 2011). Observa-se que o poro de CIs apresenta uma estrutura geral comum. Em contrapartida, a região responsável pela discriminação dos íons, o chamado filtro de seletividade (FS), naturalmente mostra diferenças consideráveis. Segundo pode ser observado na estrutura cristalográfica, o FS de canais de Na+ e relativamente curto e amplo, sendo portanto capaz de acomodar íons hidratados no seu interior. Além disso, e sugerido que íons dispõem de certa mobilidade no interior desse FS. Tal descrição difere significativamente do ambiente constrito e pouco hidratado observado no FS de canais de K+. Frente a isso, espera-se que os mecanismos de condução em canais de Na+ e K+ sejam diferentes. Neste trabalho, cálculos de energia livre (via metadinâmica) e simulações de DM com aplicação de potenciais eletrostáticos transmembrânicos foram empregados na investigação do mecanismo de condução de canais de Na+, através do CI NavAb. Conjuntamente, ambas metodologias mostram que os íons ligam-se essencialmente a três sítios no interior do FS, chamados HFS, CEN e IN. Mostrou-se também que o movimento de íons e água no interior do filtro e pouco restrito. Em decorrência disso, e permitida a ocupação concomitante de um único sitio do FS por mais de um íon, o que implica em um mecanismo fundamentalmente distinto daquele observado em canais de K+. Outro resultado interessante aponta para uma assimetria nos mecanismos de condução de Na+ em condições de hiperpolarização ou equilíbrio (ΔV≤0) e de despolarização (ΔV>0). O mecanismo de condução predominante a ΔV ≤ 0 envolve essencialmente a participação de dois Na+. Em contrapartida, a ΔV > 0, o mecanismo conta com três íons, sendo que a chegada do terceiro estimula a liberação de um dos íons anteriormente presentes no canal. Perspectivas desse estudo impactam algumas das questões mais desafiantes da biofísica molecular atual, tais como: identificar os fatores determinantes da seletividade iônica; compreender melhor a relação estrutura-função de canais iônicos eucariotos, particularmente canais de Na+ e Ca++; mecanismo de ação de anestésicos e aplicações nanobiotecnológicas. _______________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Ion channels (ICs) are transmembrane (TM) protein pores, capable of regulating the flow of ions in and out of the cells by opening and closing the hydrated pathway they form. This can be done in response to various stimuli, such as binding of ligands, voltage, mechanical stimuli, etc. Moreover, most ICs are highly selective. Hence, according to the ion they selectively transport, ICs can be denominated either Na+, K+, Ca++ or Cl- channels. ICs functioning is essential to a variety of biological functions, e.g.: muscular contraction, electric signaling in neurons, control of the osmotic pressure, hormone secretion, consciousness, etc. Therefore have been the subject of intense research over the last 50 years. Several IC crystal structures have been resolved over the last few years. Along with improvements in computer processing power, such structures enable the investigation of ICs with atomic resolution, by means of molecular dynamics (MD) simulations. In 2011 the first crystal structure of a sodium channel (a bacterial channel named NavAb) was published (Payandeh et al., 2011). While ICs display a pore with overall conserved structure, significant differences can be seen in the so-called selectivity filter (SF): the pore region responsible for discriminating between different ionic species. As of its crystal structure, the Na+ channel SF is relatively short and wide, and thence can fit hydrated cations. Besides, ions and water molecules are expected to have a certain degree of mobility inside the SF. Such SF characteristics greatly differ from the narrow dehydrated environment described for the K+ channel SF. In this context, conduction mechanisms are also expected to be significantly different in these channels. Here, free energy calculations and MD simulations with an applied TM voltage were harnessed to investigate the conduction mechanisms of Na+ channels. Altogether, these methodologies indicate that Na+ ions can bind to three main sites within the SF, named HFS, CEN and IN. Because the movement of ions and water is less restricted, a side-by-side configuration of ions is permitted. This implies in a conduction mechanism fundamentally different from what is known for K+ channels. What is more, this study describes an asymmetry in the conduction mechanisms taking place under hyperpolarizing/neutral (ΔV≤0) and depolarizing (ΔV>0) conditions. Under ΔV≤0, conduction involves two Na+ ions bound to the filter. Contrastingly, under ΔV>0, 3 ions participate and the approach of the third ion triggers the conduction. Perspectives of this study can impart some of the most interesting questions in the molecular biophysics field, such as: identify the determinants of ion selectivity; better understand the structure-function interplay in eukaryotic ICs, specially Na+ and Ca++; the molecular mechanism of anesthetics action and nanobiotechnological applications.

Esta dissertação apresenta uma revisão sobre canais iônicos com respeito aos seus aspectos biofísicos e sobre alguns modelos matemáticos utilizados em sua análise. As abordagens dividem-se em duas classes: uma em que é possível realizar análises exatas e outra mais apropriada à análise numérica. Será revista a solução da equação de Poisson em coordenandas toroidais, que fornece uma expressão para o potencial elétrico na região do canal. Uma outra abordagem estudada utiliza os ensembles da mecânica estatística de equilíbrio para determinar a forma do potencial elétrico médio nessa mesma região. As descrições destinadas à análise numérica compreendem: uma formulação em que todos os elementos são considerados como meios contínuos; a Dinâmica Browniana e a Dinâmica Molecular. A dissertação é encerrada com a apresentação de alguns resultados experimentais sobre canais reais. Ao final, o leitor deverá ter um panorama sobre os estudos, teóricos e aplicados, no campo da condução passiva de íons através de membranas celulares. Esta dissertação não tem por finalidade esgotar os tópicos que abrangem esta área do conhecimento. / This dissertation presents a review about ion channels with respect to their biophysical aspects and some mathematical models employed in its analysis. Our approach is separated in two parts: one where it is possible to achieve exact results and another more suitable to numerical analysis. There will be reviewed a solution for Poisson’s equation in toroidal coordinates which gives an expression for electrical potential in the region of the channel. Also, There will be reviewed the mean force potential formulation derived from the ensembles of equilibrium statistical mechanics. The numerical analysis approach comprehends formulations where all elements are considered as a continuum media and via Brownian Dynamics and the Molecular Dynamics. This dissertation finishes with a discussion of some experimental results about real channels. At the end of this all, the reader should have an overview about the studies, both theoretical and applied, in the field of passive conduction of ions through cell membranes. However, this dissertation has no intention to be a comprehensive review of the subject.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3132_1.pdf: 3125724 bytes, checksum: 3bf874d76ef407eac106e41b1d8b6065 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Canais iônicos são proteínas integrais, formadoras de poros na membrana plasmática das células e são de extrema importância para as funções intra e extracelulares. Os poros ajudam no transporte rápido e seletivo dos íons, nutrientes e metabolitos pela membrana plasmática, portanto estão diretamente relacionados a diferentes funções no organismo como, transmissão sináptica, contração muscular, secreção hormonal, regulação do volume celular, proliferação celular e diferenciação. Podemos classificar os canais iônicos de acordo com seu principal estímulo para ativação: temos os canais ativados por ligantes intracelulares, canais ativados por ligantes extracelulares, canais de potássio e cloreto ativados por cálcio, canais sensíveis a ácidos e canais dependentes de voltagem (Na+, K+, Ca+ e Cl-). Os canais iônicos têm sido extensamente estudados, e novas informações vêm sendo acumuladas nos últimos anos, mostrando a importância da participação destes canais em processos relacionados à homeostase, como também sua contribuição na proliferação e diferenciação celular. Nesse trabalho procuramos identificar os níveis de RNAm em quatro tipos de canais iônicos, canal de potássio de alta condutância ativado por cálcio (MaxiK), canal aniônico dependente de voltagem (pl-VDAC), Canal de cloreto ativado por cálcio (CLCA1) e Canal de potássio dependente de voltagem (hEAG1) nas células-tronco mesenquimais de cordão umbilical, a partir da geléia de Wharton (hwCTMs), nas diferentes fases do ciclo (G0/G1, S e G2/M) e diferenciação celular (adipo- e osteogênica), visando contribuir no processo de terapia celular. O RNA total de hwCTMs foi extraído utilizando RNeasy mini kit (QIAGEN). O RNA transcrito em cDNA com superScript reverse (Invitrogen). PCR em Tempo Real foi realizada no ABI prisma 7500 (Applied Biosystems) usando supermix UDG (Invitrogen). Em acordo com os dados publicados, o estímulo osteogênico originou características osteoblásticas das células comprovadas por coloração histoquímica (alizarin red S) onde se observou o aparecimento células alongadas com presença de granulações escuras (cristais de hidroxiapatita) na matriz extracelular. A comprovação da diferenciação adipogênica foi feita por coloração histoquímica com oil red O, mostrando células com morfologia mais arredondada e presença de vacúolos de gordura. Estabelecemos que entre os quatro canais estudados, dois, CLCA1 e hEAG1, não se expressaram, enquanto a expressão dos MaxiK e pl-VDAC foi consideravelmente alto atingindo ~10% do valor de housekeeping gene Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Encontramos que a expressão dos MaxiK e pl-VDAC aumentaram durante a progressão do ciclo celular (G0/G1, S e G2/M) nas hwCTMs. Detectamos que a diferenciação muda a expressão dos canais MaxiK e pl-VDAC de maneira oposta: o canal MaxiK aumenta enquanto que o pl-VDAC diminui. Os dados ampliam o conhecimento sobre os tipos dos canais iônicos e o nível da expressão nas hwCTMs aumentando a compreensão da biologia de células-tronco mesenquimais

Orientador: Gaston Eduardo Barberis / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-09-11T21:02:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MorenoSalazar_NelsonOrlando_D.pdf: 2044778 bytes, checksum: ce923740927e8df60d16125355bea882 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Nesta tese, tem-se estudado três diferentes sistemas magnéticos de atual interesse; (i) Os compostos de Li3Fe2(AsO4)3 - x(PO4)x pertencem à família de eletrólitos sólidos que despertam grande interesse por seu grande número de aplicações em dispositivos eletroquímicos de estado sólido. As medidas de magnetização dc/ac, ressonância paramagnética eletrônica, EPR e Mossbauer mostram que esses compostos ordenam antiferromagneticamente a 35.5 K, 33 K, 32 K, 31 K e 29 K para x = 0, 1, 1.5, 2 e 3, respectivamente. Abaixo destas temperaturas uma componente ferromagnética fraca que diminui com a temperatura é observada. Esses resultados são explicados pela competção entre duas sub-redes diferentes correspondentes aos sítios Fe(1) e Fe(2). A componente ferromagnética fraca origina-se da compensação incompleta do arranjo colinear dos momentos (weak ferrimagnetism) para x = 3 e por um canting leve dos momentos magnéticos no estado ordenado (weak ferromagnetismo para os compostos de arsenato.(ii) O sistema biológico do complexo de cobre do aminoácido L-aspártico, Cu(L-asp) que apresenta um comportamento da baixa dimensionalidade como consequência do arranjo dos íons de Cu no aminoácido, é de importância na biofísica. Medidas de magnetização entre 1.8 K e 300 K e calor especifico entre 1.5 K e 20 K foram realizadas na amostra policristalina Cu(L-asp). Os dados foram ajustados propondo um comportamento característico de uma cadeia linear alternada antiferromagnética com um acoplamento ferromagnético entre cadeias usando a aproximação de campo médio. Cada íon de Cu acopla-se dentro da cadeia ao Cu da direita com uma interação de troca isotrópica Jo/k = -5.3 K, e ao Cu da esquerda com a Jo/k = -1.5 K (a = 0.29). A interação entre cadeias foi J¿/k = 0.7 K. (iii)Foram estudadas as propriedades intrínsecas e extrínsecas da manganita de dupla camada La1.2Sr1.8Mn2O7 por medidas de EPR e de magnetização dc. Encontrou-se um aumento da magnetização, M perto de 300 K, a uma temperatura bem acima de Tc ~ 125 K. A altas temperaturas modos ferromagnéticos, FMR, aparecem. De nossa analise conclui-se que o aumento na M e a FMR se deve à presença de fases Ruddlesden-Popper e não a efeitos intrínsecos como foi reportado por outros autores. Além disso, o campo de ressonância da linha de EPR devido à fase La1.2Sr1.8Mn2O7 apresenta uma anisotropia que depende da temperatura até ~ 450 K. A anisotropia é proporcional a M, independente do conteúdo de fase extrínseca, sendo portanto intrínseca ao sistema / Abstract: In this thesis, we have studied three different magnetic systems of current scientific interest (i) Li3Fe2(AsO4)3 - x(PO4)x compounds belonging to family of the solid electrolytes have attracted a great interest due to its large number of applications in solid state electrochemical devices. The magnetization dc/ac, electron paramagnetic resonance, EPR, and Mossbauer measurements, show that all those compounds order antiferromagnetically at 35.5 K, 33 K, 32 K, 31 K and 29 K for x = 0, 1, 1.5, 2 and 3, respectively. Below these temperatures a component weak ferromagnetic decreasing with the temperature, is observed. Those results are explained by the competition among two different sublattices corresponding to the sites Fe(1) and Fe(2). The weak ferromagnetic component originates from the an incomplete compensation of the arrangement collinear of the moments (weak ferrimagnetism) for x = 3 and for a canting light of the magnetic moments in the state orderly (weak ferrimagnetism) for the compound of arsenate. (ii) The biological system of the compound of copper of the amino acid L-aspartic, Cu(L-asp) that presents a behavior of the low dimensionality as a consequence of the arrangement of the ions of Cu in the amino acid, is of importance in the biophysics. Specific heat, magnetic susceptibility and magnetization measurements were performed in polycrystalline samples of the Cu(L-asp)]. The data were well fitted proposing for Cu(L-asp) a behavior characteristic of an alternating linear chain antiferromagnet. Each S=1/2 copper ion is coupled with an isotropic exchange interaction Jo/k=( - 5.3 ± 0.1) K with one copper neighbor in the chain, and Jo/k =-1.5 K with the other a = 0.29. The interchain ferromagnetic coupling is J¿/k= 0.7 K. (iii) We have performed EPR and dc magnetization measurements on bilayer La1.2Sr1.8Mn2O7 manganite. We found an increase in the magnetization, M, near to 300 K, a temperature well above Tc ~ 125 K. We have observed at theses high temperatures the appearance of new ferromagnetic resonances, FMR. We conclude that the increase in M and the FMR are due to the presence of extrinsic Ruddlesden-Popper phases and not to intrinsic effects as has been claimed. Furthermore, the resonance field of the EPR line due to La1.2Sr1.8Mn2O7 phase presents a measurable temperature-dependent anisotropy up to ~ 450 K / Doutorado / Física / Doutor em Ciências