Les adénovirus sont des virus icosaédriques non enveloppés à ADN double brin. Bien que ces virus soient très étudiés dans le but d'une application possible en thérapie génique, le manque de connaissances fondamentales, notamment structurales, est probablement à l'origine du faible succès rencontré lors des premiers essais effectués. Dans le cadre d'un programme général d'étude structurale des protéines de l'adénovirus, nous nous sommes intéressés aux protéines mineures et particulièrement à la protéine IX. Cette dernière est localisée sous forme de 4 trimères au centre de chaque face du virus. Grâce à des reconstructions 3D à partir des images de cryo-microscopie électronique, d'une part, d'un adénovirus humain décoré par des Fabs ciblant le domaine C-terminal de la protéine IX et, d'autre part, d'un adénovirus canin dans lequel le domaine C-terminal de la protéine IX a été fusionné avec la GFP, nous avons pu localiser le domaine C-terminal à la surface de la capside. En combinant ces résultats avec des données biophysiques obtenues pour différents mutants de la protéine IX, nous avons proposé un modèle de son intégration au sein de la capside. Nous avons en particulier montré que la protéine IX formait un maillage localisé entre les différents capsomères.<br /> Nous nous sommes également intéressés à une autre protéine structurale de l'adénovirus : la tête de fibre courte de l'adénovirus aviaire. Nous avons résolu la structure cristallographique de cette protéine à 2 Å de résolution. Cette structure a été comparée avec d'autres structures de tête de fibre d'adénovirus déjà connues. Nous avons pu en déduire que, malgré de faibles homologies de séquences, les structures tertiaire et quaternaire des têtes de fibre étaient conservées au sein de la famille des adénovirus. La construction d'un arbre phylogénique basé sur les structures atomiques des têtes de fibre nous a permis de mettre en évidence une nouvelle filiation entre les adénovirus infectant différentes espèces. La structure a également conduit à des hypothèses quand à la nature des récepteurs cellulaires de l'adénovirus aviaire.<br />La troisième protéine structurale à laquelle nous nous sommes intéressés est la base du penton de l'adénovirus humain de sérotype 3. Cette protéine pentamérique peut s'associer par douze pour former un assemblage hautement symétrique : le dodécaèdre. Grâce à leur cavité de 80Å et leur capacité à entrer dans les cellules, ces particules dodécaédriques ont été proposées comme véhicule de transfert de gène en thérapie génique potentielle. Nous avons réussi récemment à améliorer des cristaux de cet assemblage pour arriver à une diffraction des rayons X allant jusqu'à une résolution de 3.5 Å. La résolution de la structure est en cours.

Les génomes de bactériophages sont connus pour être mosaïques. Avec l'augmentation des structures disponibles sur ces virus, leur morphologie aussi apparaît de plus en plus comme telle. Les structures de 4 différents intermédiaires dans l'assemblage de la capside icosaédrique du bactériophage Gifsy-2, infectant les bactéries Salmonella ont été résolues par cryo-microscopie électronique jusqu'à une résolution de 12Å. Au niveau génétique, un long gène code en partie Cterminale pour la protéine de capside majeure alors que sa partie Nterminale est fortement similaire du point de vue de sa séquence primaire aux protéases de la famille Clp. Ces résultats et ceux obtenus sur d'autres phages suggèrent que les 200 résidus en partie centrale regroupent les fonctions restantes, nécessaire à l'assemblage de la capside. Cette organisation en un gène unique est une nouvelle variante des stratégies développées par les phages pour modifier la voie d'assemblage de leur capside.<br />Nous avons aussi déterminé les structures de la capside et de la queue du phage T5 , infectant la bactérie E.Coli à des résolutions de 19 et 30 Å respectivement confirmant l'inhabituelle symétrie d'ordre 3 de sa queue. Sa capside icosaédrique est composée par des pentamères et hexamères de pb8 et par pb10 s'attachant au centre de ces derniers, le tout étant décrit par une géométrie T=13. La comparaison des séquences primaires de pb8 et gp5 d'HK97 et la modélisation du modèle atomique de gp5 dans la capside de T5 montrent que ces 2 protéines adoptent sûrement le même repliement 3D. Nous proposons aussi que le domaine Nterminal de la protéine pb8 soit impliqué dans l'assemblage initial de la capside d'une manière similaire à HK97.

Le bactériophage T5 est un virus infectant E. Coli. L'assemblage et la maturation de sa capsidecomportent plusieurs étapes critiques pour la formation des virions lors du cycle infectieux.Parmi ces étapes, j'ai étudié les processus d'expansion et de décoration de la capside de T5.L'expansion implique d'importantes réorganisations conformationnelles des 775 sous-unités de laprotéine pb8 composant la capside, conduisant au doublement du volume de la capside qui peutalors contenir le génome du phage. J'ai déterminé des conditions physico-chimiques permettantd'induire l'expansion de la capside in vitro, puis j'ai effectué des expériences de SAXS résoluesdans le temps montrant que l'expansion est un processus hautement coopératif, qui conduit, en uneétape, à un état final remarquablement stable. D'autre part, j'ai réalisé une étude fonctionnelle de laprotéine de décoration pb10, montrant que sa fixation est un marqueur de l'expansion. Enfin l'étudestructurale de pb10 menée par SAXS a permis de déterminer un modèle à basse résolution de sonenveloppe moléculaire.

El virus de l’hepatitis A (HAV), el prototip del gènere Hepatovirus, té una sèrie de característiques que el diferencien de la resta de membres de la família Picornaviridae, entre aquestes l’existència d’un únic serotip del virus, a pesar de que replica seguint una dinàmica de quasiespècies. La falta de correlació entre la variabilitat a nivell de nucleòtids i a nivell d’aminoàcids fa pensar que l’HAV presenta unes fortes constriccions estructurals i biològiques a nivell de la càpsida. Cal tenir en compte que el virus ha de superar el pH àcid de l’estómac en la fase d’entrada, l’eliminació de sang en la fase virèmica i l’acció de proteases i detergents, especialment sals biliars, en la fase de sortida. Per fer front al pH àcid, les proteases i les sals biliars, l’HAV disposa d’una càpsida altament estable i cohesiva. Respecte l’eliminació de sang, l’HAV s’uneix a la glicoforina A dels eritròcits, la qual s’ha descrit que pot actuar com a receptor esquer interaccionant amb els patògens i impedint que arribin al seu teixit o òrgan diana, però la interacció és ineficient a pH fisiològic. Com que aquesta interacció és òptima a pH àcid, es creu que l’HAV ha adoptat una conformació de la càpsida que li permet evadir la interacció amb l’eritròcit i evitar així ser eliminat de sang. Per tant, aquest seria un factor que contribuiria a la baixa variabilitat antigènica de la càpsida, ja que els mutants amb canvis d’aminoàcids en la regió d’unió a la glicoforina A podrien ser més fàcilment eliminats de sang. De fet, en aquest treball s’ha observat com una única mutació en aquesta regió genera un mutant amb una capacitat de replicació in vitro idèntica a la del virus parental però amb una reducció del fitness in vivo pel fet de presentar una cinètica d’eliminació en sang més ràpida. Una altra característica única de l’HAV és que presenta un ús de codons altament deoptimitzat i en certa manera antagònic al de la cèl•lula. Com a conseqüència, el virus utilitza molts codons rars, que s’aparellen amb tRNAs poc abundants, ja que utilitza com a codons rars els codons que són rars per la cèl•lula però també els que la cèl•lula utilitza freqüentment, i que, per tant, no estan disponibles per al virus. Aquesta estratègia li permet minimitzar la competència que ha d’establir amb la cèl•lula hoste pels tRNAs, ja que no posseeix d’un mecanisme específic per induir shut-off de la síntesi proteïca cel•lular. S’ha demostrat que els codons rars tenen un paper important en la regulació de la cinètica de traducció, ja que causen pauses del ribosoma degudes a la dificultat de trobar el tRNA correcte, que es troba en concentracions baixes. Aquestes pauses permeten el correcte plegament de les proteïnes, que té lloc de forma co-traduccional. En el cas de l’HAV, la importància de mantenir les pauses de la traducció per assegurar el correcte plegament de les proteïnes de la càpsida és tal que quan es feia replicar el virus en condicions de shut-off cel•lular artificial, el virus re-deoptimitzava l’ús de codons, al contrari del que s’esperaria en aquestes condicions de major disponibilitat de tRNAs. En aquest treball s’ha estudiat la relació entre les pèrdues i recuperacions del fitness del virus en les diferents condicions de shut-off cel•lular i els canvis en la conformació de la càpsida, els quals afectaven l’estabilitat i la eficiència amb que aquesta interaccionava amb el receptor i/o desencapsidava. Durant l’adaptació a aquestes condicions, els canvis en l’ús de codons que experimentava el virus li permetien recobrar un plegament de la càpsida per a recuperar la interacció amb el receptor o augmentar la eficiència de desencapsidació. A més, les poblacions adaptades a les condicions de shut-off cel•lular presentaven un increment de la infectivitat específica i una replicació més ràpida que el virus parental. Tot plegat ens dona una idea de com la càpsida de l’HAV s’adapta a colls d’ampolla imposats pel seu cicle biològic. / Hepatitis A virus (HAV) is a hepatotropic member of the Picornaviridae family. A single serotype exists, in spite of similar nucleotide diversity to that of the other picornaviruses. This discrepancy between nucleotide and amino acid variability suggests capsid structural and biological constraints. For the development of an infection cycle, HAV has to overcome the challenges posed by the acid pH of the stomach and the action of intestinal proteases and detergents (particularly biliary salts) during the entry phase, the decoy factors during the viremic phase, and again the action of proteases and detergents during the exit phase. HAV binds erythrocytes through the interaction with glycophorin A, however hemagglutination at physiological pH is highly inefficient. As erythrocyte glycoproteins may function as decoy receptors, attracting pathogens and keeping them away from target tissues, the actual virion conformation could represent an escape mechanism from blood clearance due to inefficient erythrocyte binding at physiological pH. The G1217D mutant, with a single mutation in the glycophorin A binding site, binds more efficiently to erythrocytes than the parental strain. In a rat model, it is eliminated from serum more rapidly and consequently reaches the liver with a certain delay compared to the parental strain, suggesting a low fitness phenotype which could explain the lack of natural antigenic variants of the glycophorin A binding site. Another unique characteristic of HAV is the codon usage. HAV don’t induce cellular shut-off and has adopted a deoptimazed codon usage, in order to reduce the competence for the cellular tRNAs. A consequence of this deoptimazed codon usage is an increase of the number of rare codons used by HAV. Adaptation of HAV to replicate in changing conditions of artificially induced cellular shut-off, results in dynamic adjustments of codon usage and in alternate capsid conformations which in turn influence the effectiveness of the initiation of the replicative cycle and the capsid stability. The adaptation processes also involve significant increases in virus specific infectivity and enable the selection of fast growing populations. Fine-tuning translation kinetics selection, i.e., the proper combination of abundant and rare codons in order to get a controlled translation speed and a proper capsid folding plays a critical role in HAV evolution during adaptation in conditions of cellular shut-off. These results suggest and adaptation of the capsid to bottlenecks during the replication cycle.

Le Grapevine fanleaf virus (GFLV) est le principal agent de la maladie du court-noué de la vigne. Sa protéine de capside (CP) permet la formation des virions indispensables à la protection du génome viral, au mouvement de cellule à cellule au sein de tubules formés par la protéine de mouvement (MP) du virus, et à la transmission du GFLV par son nématode vecteur Xiphinema index. Principaux résultats : 1. un motif exposé à la surface de la CP dont la nature est critique pour transmission du GFLV par X. index a été identifié et pourrait constituer un déterminant de la spécificité de transmission. 2. Des tubules fluorescents ont été produits de façon constitutive in planta. Ils permettent de complémenter en trans un GFLV dépourvu de MP. 3. L’expression transitoire de la CP conduit à la production de pseudo-particules. Celles-ci sont modifiables à façon et font de la capside du GFLV une plateforme biotechnologique unique. De plus, c’est un puissant outil pour étudier la biologie du virus. / Grapevine fanleaf virus (GFLV) is the main agent of grapevine fanleaf degeneration disease. Its coat protein (CP) self-assembles in virions necessary for viral genome protection, for cell-to-cell movement using tubules formed by the movement protein (MP) of the virus, and for the transmission of GFLV by its nematode vector Xiphinema index.Main results: 1. An outer surface-exposed CP motif has been identified as critical for GFLV transmission by X. index and could be a determinant of transmission specificity. 2. Fluorescent tubules have been produced by constitutive expression in planta. They allow the complementation in trans of a GFLV deleted of its MP coding sequence. 3. Transient expression of the GFLV CP leads to the production of virus-like particles. They can be easily modified and show that GFLV capsid is a unique biotechnology platform. In addition, they are a powerful tool to study the biology of the virus.

Le virus de l’hépatite B (VHB) est un virus du foie qui cause 1 à 2 millions de morts chaque année. Approximativement 400 millions d’individus sont infectés chroniquement. Le VHB est un virus enveloppé et comprend un génome ADN de ~3.2 kbp au sein d’une capside icosaédrique. La capside est formée de 240 copies d’une protéine unique appelée Core ou protéine de la capside. Durant l’infection, la capside est importée dans le noyau pour libérer le génome viral. L’import est facilité au travers du complexe du pore nucléaire (NPC) en utilisant des récepteurs de transport nucléaire. Des biopsies réalisées sur des patients infectés par le VHB ont montrées que les capsides nucléaires sont issues de l’entrée nucléaire mais aussi de protéines Core nouvellement traduites.Ce travail analyse l’import nucléaire de la capside du VHB et la libération du génome viral. Nous avons montré que les imports des protéines Core et de la capside suivent des systèmes d’import différents. Il a été démontré à partir de tests d’import nucléaire basés sur des cellules perméabilisées par la digitonine que les capsides utilisent l’hétérodimère des importines α et β. Cette découverte est en accord avec de précédentes observations qui ont également démontrées l’exposition de NLS à la surface de la capside, sur lequel s’attache l’importine α. Des expériences de contrôle utilisant le GST-NLS ont permis de démontrer que la fixation du NLS sur l’importine nécessite une interaction avec l’importine  pour la stabilisation du complex de l’import. En analysant l’import nucléaire de la protéine Core non assemblée, nous avons pu observer un import basé uniquement sur l’interaction avec l’importine β, ce qui implique que la protéine Core présente un domaine IBB et non un NLS. Le transport a travers le NPC se termine par l’arrivée des capsides dans le panier nucléaire, qui est une structure en cage, du côté nucléaire. En accord avec la littérature, nous avons observé une liaison de l’importine β sur le domaine C-terminal de la Nup153. L’ajout de RanGTP, qui dissocie les complexes d’import, ne dissocie pas l’importine β de ce domaine, ce qui permet d’émettre l’hypothèse qu’un autre domaine de la Nup153 est impliqué. Contrairement aux autres cargos, la capside du VHB est stoppée dans le panier nucléaire par sont interaction avec la Nup153. Puisque le domaine de liaison de l’importine β chevauche celui de la capside, l’importine β doit se dissocier de la Nup153. L’interaction capside-Nup153 est supposée déstabiliser la capside et permettre la libération du génome viral dans le noyau et la diffusion des protéines Core en supériorité numérique par rapport à la Nup153.En conséquence, les capsides montrent une instabilité, comme nous l’avons démontré par chromatographie d’exclusion de taille, révélant non seulement la capside mais aussi ses intermédiaires d’association/dissociation. Ces expériences sont limitées aux capsides recombinantes car elles nécessitent une grande quantité d’échantillons. Dans le but de confirmer l’instabilité des autres capsides (matures et immatures), nous avons analysé l’accessibilité des acides nucléiques encapsidés pour la nucléase S7. Les résultats ont confirmé une dissociation in vitro partielle pour toutes les capsides, mais avec une cinétique lente, ce qui n’est pas cohérent avec la réaction in vivo. En analysant l’impact de la Nup153 sur cette accessibilité, nous observons qu’un facteur nucléaire supplémentaire, présent du moins dans les cellules hépatiques, accélère la cinétique de dissociation. / The hepatitis B virus (HBV) is a hepatotropic virus which causes 1 to 2 million of death every year. Approximately 400 million individuals are chronically infected. HBV is enveloped and comprises a DNA genome of ~3.2 kbp within an icosaedral capsid. The capsid is formed by 240 copies of one single protein species termed core or capsid protein. During the infection, the capsid is imported to the nucleus in order to release the viral genome. The import is facilitated through the nuclear pore complex (NPC) using nuclear transport receptors. Biopsies of HBV-infected patients show nuclear capsids, which are derived from nuclear entry of the capsid but also from nuclear import of progeny core proteins.This work investigates the nuclear import of the HBV capsid and the release of the viral genome. We showed that the imports of core protein and capsid follow different pathways. Capsids were shown to use the heterodimer of importin α and β for nuclear import as it was demonstrated by nuclear import essay, based on digitonin-permeabilised cells. This finding is consistent with earlier observations, which also demonstrated the exposure of NLS on the capsid surface, to which importin  attaches. Control experiments using GST-NLS demonstrated that binding of the NLS to importin  required interaction with importin  for stabilization of the import complex. Analysing the nuclear import of the unassembled core protein we observed an import based on interaction with only importin β implying that the core protein expose an importin -binding domain rather than an NLS.The transport through the NPC is terminated with the arrival of a cargo capsid in the nuclear basket, which is a cage like structure at the nuclear side of the NPC. Consistent with the literature we observed an attachment of importin  to the C terminal domain of Nup153. Addition of RanGTP, which dissociates import complexes, did not dissociate importin  from this domain, which led to the hypothesis that other Nup153 domains are involved. In contrast to other karyophilic cargos HBV capsids become arrested within the nuclear basket by capsid-Nup153 interaction. As the binding site of importin overlaps with the binding site of the capsid such importin -Nup153 interaction has to be dissociated. The subsequent capsid-Nup153 interaction was thought to destabilize the capsid allowing liberation of the viral genome into the nuclear and the diffusion of core proteins, supernumerous with regard to the Nup153 molecules, deeper into the nucleus. Accordingly, capsids show an imminent instability as we demonstrated by separation of capsids using size exclusion chromatography revealing not only capsids but assembly/disassembly intermediates. These experiments were limited to recombinant, E. coli-expressed due to the high amounts needed. To confirm the instability of other capsids e.g. genome-containing ones, we analyzed the accessibility of the capsid enclosed nucleic acids to the S7 nuclease. The results confirmed partial dissociation in vitro similar for all capsids but with a slow kinetic, which is not coherent with the in vivo reaction. Investigating the impact of Nup153 we observed that an additional nuclear factor, present in at least hepatoma cells accelerates the dissociation kinetic.

Le bactériophage T5, qui infecte la bactérie Escherichia coli, est constitué d’une capside icosaédrique renfermant un ADN double brin et d’une queue permettant le transfert de son ADN dans le cytoplasme de la cellule hôte. Au cours de la morphogénèse, la capside et la queue sont assemblées séparément puis connectées pour former les particules infectieuses. La capside de T5 est d'abord assemblée sous forme d'une procapside vide constituée de 775 copies d’une protéine unique qui s'organise en hexamères et pentamères pour former respectivement les faces et les sommets de l’icosaèdre. Un des sommets est occupé par la protéine portale qui constitue un pore d’entrée pour l’ADN. L’encapsidation du génome à travers le canal portal, assurée par un moteur moléculaire, provoque l’expansion de la procapside. La capside pleine d'ADN est ensuite décorée par la protéine pb10 qui se fixe sur sa surface externe, au centre des 120 hexamères, et elle est fermée par la protéine p144 qui constitue le point d'ancrage pour la queue.Les objectifs de ma thèse étaient de déterminer la structure, la fonction et le mécanisme de fixation à la capside des deux protéines pb10 et p144. J’ai produit et purifié la protéine de fermeture p144 dont la structure et les caractéristiques de fixation sur la capside seront prochainement étudiées. J’ai résolu la structure de la protéine de décoration pb10 en solution par résonance magnétique nucléaire (RMN), ce qui a révélé une protéine formée de deux domaines. Le domaine N-terminal structuré en hélices alpha se fixe à la capside, alors que le domaine C-terminal, de type immunoglobuline, est exposé au solvant. La détermination des constantes cinétiques d'association et de dissociation par résonance plasmonique de surface (SPR) a permis de montrer que pb10 se fixe sur la capside de T5 de manière quasi-irréversible, avec une affinité de l’ordre du picomolaire. Des expériences de mutagenèse dirigée sur le domaine de fixation de pb10 indiquent que cette forte affinité repose sur un réseau d’interactions électrostatiques et hydrophobes. J’ai démontré que pb10 participe à la stabilisation de la capside de T5 par des techniques de calorimétrie différentielle à balayage (DSC) et thermo-fluorescence (FTSA). Par ailleurs, j'ai démontré qu’il était possible de fusionner des protéines de grande taille au domaine C-terminal de pb10 sans affecter sa haute affinité pour la capside. J’ai ainsi pu fonctionnaliser des capsides avec une protéine d’intérêt fusionnée à pb10. Ces résultats ouvrent la voie vers diverses applications, dont la présentation d’antigènes en vue de créer de nouveaux vaccins. / Bacteriophage T5, a lytic phage which infects the bacterium Escherichia coli, is composed of an icosahedral capsid containing a double stranded DNA and a tail responsible for DNA transfer into the host cell cytoplasm. The capsid and the tail are assembled separately and then connected to form infectious viruses. The T5 capsid is first assembled as an empty procapsid composed of 775 copies of the major head protein organized in hexamers on the faces and pentamers on the vertices of the icosahedron. A single vertex is occupied by the portal protein which forms an entry channel for DNA. DNA is packaged through the portal channel by a molecular motor thus triggering procapsid expansion. The DNA-filled capsid is then decorated by the protein pb10 which binds on the outer surface in the center of each hexamer, and closed by the connector protein p144 needed for tail attachment.The goals of my PhD were to characterize the structure, function and mechanisms of capsid binding of both pb10 and p144 proteins. I have produced and purified the head completion protein p144 for future exploration of its structure and capsid binding properties. I have solved the solution structure of the decoration protein pb10 by nuclear magnetic resonance (NMR), thus unravelling that pb10 has two domains. The alpha-helical N-terminal domain binds to the capsid and the immunoglobulin-like C-terminal domain is exposed to the environment. Surface plasmon resonance (SPR) showed that that pb10 attachment to the T5 capsid is quasi-irreversible with a picomolar affinity. Site-directed mutagenesis of the binding domain of pb10 suggested that the decoration mechanism is driven by both hydrophobic and electrostatic interactions. Differential scanning calorimetry (DSC) and fluorescence thermal shift assays (FTSA) demonstrated the role of the decoration protein in capsid stabilization. I have also demonstrated that a large protein can be fused to the C-terminal end of pb10 without affecting its high affinity for the T5 capsid. Capsids can thus be functionalized with a protein of interest fused to pb10. Possible applications of this work include antigen presentation for new vaccines.

Le Virus de la Mosaïque de la Papaye est un virus végétal filamenteux flexible. Son unique protéine structurale, la protéine de capside, est composée de 215 acides aminés. Le but de ce présent projet de recherche est de déterminer l'importance de l'extrémité N-terminale de la CP dans l'assemblage du PapMV. Des études antérieures à ce projet ont démontré que la délétion des cinq premiers acides aminés de la CP (CP6-215) n'affectait pas la capacité de la CP à se multimériser, alors qu'une délétion des vingt-six premiers acides aminés (CP27.215) conduisait à une incapacité de la CP à se multimériser. L'élaboration de mutants de délétion à l'extrémité N-terminale ainsi que leur expression dans la bactérie E. coli a permis de mettre en évidence l'importance de la phénylalanine retrouvée à la position 13 de la CP. Des mutations ponctuelles pour cet acide aminé ont permis de révéler le rôle que jouait l'hydrophobicité à l'extrémité N-terminale dans la multimérisation de la protéine de capside.

Le virus de la mosaïque de la papaye (PapMV) est un virus filamenteux flexible dont son unique protéine structurale est la protéine de capside (CP), composée de 215 acides aminés. La structure tertiaire de cette protéine, tout comme celle de ses homologues, n'est pas connue. Le but de ce projet est de caractériser la structure et la dynamique de la PapMV CP par RMN multidimensionnelle. Afin d'y arriver, une forme de protéine utilisable pour la RMN, d'un poids moléculaire évitant d'outrepasser les 30 kDa, a d'abord été identifiée : la PapMV CP27-215. Un protocole d'expression à haut rendement a été développé et nous avons marqué cette protéine avec le 15N et le 13C, ce qui impliquent une expression en milieu minimum. La RMN est aussi une méthode qui exige une très grande pureté de la protéine. Par conséquent, une approche de purification efficace a été développée. En plus d'une protéine pure et marquée, la RMN exige que celle-ci soit soluble, concentrée et stable. Ces exigences ont été répondues afin de répondre à l'objectif premier de ce projet.

Si la découverte récente de la souche virale JFH1, capable de réaliser un cycle viral complet en culture cellulaire, a permis de mieux caractériser le déroulement de l’infection du virus de l’hépatite C VHC, de nombreux aspects de la biologie du virus demeurent méconnus. Parmi ceux-ci, les mécanismes gouvernant l’encapsidation de l’ARN génomique viral au sein des particules restent à élucider. Cette thèse décrit la mise point d’un système de mobilisation hétérologue permettant l’analyse de l’interaction de la protéine de capside Core avec l’ARN viral. Ce système nous a permis d’identifier les régions de la protéine impliquées dans la liaison au génome viral, tout en autorisant son transfert dans des cellules naïves. Cette approche de mobilisation dépendante de la Core est complétée d’une étude de recrutement hétérologue basée sur la reconnaissance de l’ARN du phage MS2 avec la protéine de manteau Coat. Cette stratégie novatrice permet le recrutement efficace des ARNs marqués tout en autorisant leur localisation cellulaire. / The advent of infectious molecular clones of Hepatitis C virus (HCV) has unlocked the understanding of HCV life cycle. However, packaging of the genomic RNA, which is crucial to generate infectious viral particles, remains poorly understood. To study packaging in vivo, we developed a novel heterologous system to evaluate the interactions of HCV Core capside with viral RNA. This system allowed us to pinpoint Core domains involved in RNA binding, and package and transfer HCV RNA into a lentiviral vector. Aside from this Core dependent recruitment, we engineered retoviral vectors to trans-package MS2-tagged RNAs using MS2 Coat protein interaction. This system allowed us to efficiently recruit MS2-tagged replicons into naive cells and offers the opportunity to visualize HCV RNAs in Huh7.5 cells.