Orientador: Valdemiro Carlos Sgarbieri / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T14:32:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ziegler_FabianeLaFlor_D.pdf: 4176640 bytes, checksum: fccef651838684499cf4cf698073b39e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O objetivo geral da presente pesquisa foi avaliar o efeito de um concentrado de proteínas do soro do leite bovino (WPC) enriquecido com o fator de crescimento e transformação beta (TGF-?) e lactoferrina, em pacientes pediátricos com Leucemia Mieloide Aguda - LMA (Capítulo 2); desenvolver um modelo de mucosite gastrointestinal induzida por quimioterápicos, em ratos Wistar, para posterior avaliação da eficácia das proteínas lácteas na proteção da mucosa (Capítulo 3); avaliar os efeitos pelo WPC e por uma caseína comercial, in vivo e in vitro sobre células leucêmicas humanas transplantadas em camundongos imunodeficientes (NOD/SCID) e em cultura de células (Capítulo 4). Para todos os estudos foi utilizado WPC enriquecido com TGF-??e lactoferrina doado pela empresa Hilmar Cheese Company (Cal, USA). No capítulo 2 realizou-se estudo de intervenção nutricional, prospectivo, duplo cego com placebo controlado, onde foram avaliados 21 pacientes, entre 0 a 19 anos, virgens de terapia, admitidos no Centro Infantil Boldrini, Campinas - SP. Foram avaliados quanto à adequação da ingestão alimentar, estado nutricional (EN), dosagem de glutationa (GSH) eritrocitária, hemograma, produção de citocinas no plasma e em cultura de células, imunoglobulina A salivar e evolução da mucosite. Foram comparados os resultados bioquímicos dos pacientes com um grupo controle de indivíduos saudáveis da mesma faixa etária. Utilizou-se o software SPSS para as análises estatísticas (p<0,05). O protocolo de pesquisa foi aprovado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) com registro 14097. Tomados em conjunto os resultados indicaram que o WPC apresentou efeito positivo sobre o EN dos pacientes, porém não influenciou na composição corporal. A distribuição % dos macronutrientes estava adequada em todos os tempos para os grupos WPC e maltodextrina (placebo), mas o % de adequação dos micronutrientes não atendia às recomendações em sua maioria. As análises bioquímicas não evidenciaram superioridade do WPC em relação ao placebo. Não houve diferença significativa entre os grupos sobre a avaliação clínica da mucosite oral. Na comparação dos pacientes com LMA e indivíduos saudáveis (controle) pode-se constatar níveis estatisticamente superiores do controle nos parâmetros bioquímicos de albumina, pré-albumina, eritrócitos, hematócrito, hemoglobina, plaquetas, produção de fator de necrose tumoral alfa (TNF-?), interleucina 6 (IL-6), interleucina 10 (IL-10) e interferon gama (IFN-?) quando estimuladas pela vacina BCG liofilizada e produção de IL-6 quando estimulada por fitohemaglutinina (PHA). No entanto, para a concentração de GSH eritrocitária e produção espontânea das citocinas TNF-??e IFN-??verificou-se que os pacientes com LMA apresentaram níveis estatisticamente superiores em relação ao controle saudável. No capítulo 3 foi elaborado um protocolo de indução de mucosite em ratos Wistar testando-se os quimioterápicos 5-Fluoruracila (5-FU) e sulfato de vincristina (SV), em administrações de diferentes concentrações e número de doses. Através desse experimento concluiu-se que o SV não foi um bom agente indutor de mucosite, ao contrário do 5-FU. A partir desses resultados foram realizados experimentos com 5-FU visando ajuste das condições dos experimentos inclusive do número, periodicidade e concentração das doses do quimioterápico. O melhor modelo de indução de mucosite gastrointestinal foi obtido através da administração de 3 doses de 5-FU com intervalo de 3 dias entre cada dose, nas concentrações entre 50 e 70 mg/Kg/dose. Os índices bioquímicos não foram influenciados pelo efeito da peletização da dieta e, de modo geral não houve diferença significativa entre os grupos tratados com WPC e com caseína. Independente da natureza da proteína (WPC ou caseína) observou-se maior proteção contra o 5-FU quando os animais receberam as dietas previamente à administração do quimioterápico. Ao contrário do esperado, o estímulo imunológico com hemáceas de carneiro não promoveu aumento nos níveis de GSH nos eritrócitos. As proteínas do soro do leite protegeram a mucosa, em termos de promover menor intensidade de mucosite, nos períodos mais críticos (72h após a 2ª e a 3ª dose de 5-FU) nas regiões de maior prevalência, duodeno e jejuno, quando se comparou com os resultados obtidos para os grupos tratados com caseína. Para os experimentos in vivo, do capítulo 4, utilizaram-se células de leucemia linfóide aguda (LLA) pediátrica humana, isoladas de pacientes do Centro Infantil Boldrini, as quais foram inoculadas em camundongos NOD/SCID. Nesses experimentos, utilizou-se dieta AIN-93G com WPC ou caseína e dieta comercial e o quimioterápico SV. Avaliou- se: peso corporal, consumo de dieta, razão entre peso dos órgãos (rim, baço e fígado) e peso corporal, evolução da leucemia, tempo de sobrevida, hemograma e níveis de glutationa em eritrócitos do sangue periférico. Nos experimentos in vitro foram usadas 6 linhagens celulares: K562 (Leucemia Mieloide Crônica), Nalm-6 (Leucemia Linfóide Aguda do tipo B), Jurkat (Leucemia Linfóide Aguda do tipo T), CEM (Leucemia Linfóide Aguda do tipo T), RAMOS (Linfoma Burkitt) e HL-60 (Leucemia Mieloide Aguda). Foram testadas a citotoxicidade (IC50) do WPC, a viabilidade celular e os níveis de glutationa total nas células leucêmicas estudadas em 4 tempos (0, 24, 48 e 72h) e 4 condições diferenciadas (células; células + WPC; células + WPC + ARAC-C; células + ARA-C). Todos os resultados, tanto do capítulo 3 como do 4, foram analisados através do software ¿Statística: Basic Statistics and Tables¿. Não houve diferença entre o WPC e a caseína em relação aos parâmetros avaliados nos experimentos in vivo, exceto na análise de Doença Residual Mínima (DRM), na qual a caseína se mostrou mais efetiva que o WPC. Constatou-se superioridade do WPC sobre os resultados de peso corporal, razão dos rins e baço pelo peso e evolução da leucemia em relação aos animais tratados com dieta comercial. Não foi possível verificar um efeito sinergístico entre o WPC e o quimioterápico sulfato de vincristina. No que se refere aos experimentos in vitro, o WPC apresentou IC50 para Nalm-6 de 6,72 mg/mL e para a linhagem CEM de 11,84 mg/mL. Verificou-se que as linhagens K562, Nalm-6 e HL-60 apresentaram perfis semelhantes em relação à viabilidade celular. No entanto, em relação à produção de glutationa total, cada linhagem comportou-se de maneira diferenciada, sendo que a maior produção em todas as condições e tempos estudados, foi para a linhagem HL-60 seguida pela K562 / Abstract: The objective of this research was to evaluate the effect of a bovine milk whey protein concentrate (WPC), enriched with transforming growth factor beta (TGF-ß) and lactoferrin in pediatric patients with Acute Myeloide Leukemia (AML) (Chapter 2); in a chemotherapic-induced gastrointestinal mucositis model in Wistar rats (Chapter 3); evaluate in human leukemic cells in culture or transplanted into immune-deficient mouse NOD/SCID (Chapter 4). WPC enriched with TGF-ß and lactoferrin was donated by Hilmar Cheese Company (Cal, USA). Chapter 2 describes a randomized, double-blind, placebo controlled, prospective clinical trial of nutritional intervention with participation of 21 therapy-naïve patients with AML aged 0-19 years from Centro Infantil Boldrini, Campinas, SP. Food intake, nutritional status, red blood cell glutathione (GSH) concentration, haemogram, cytokine concentration in plasma and cell cultures, salivary immunoglobulin A (IgA) and evolution of mucositis were studied. Health individuals at the same age range were used as a control group. The statistical analysis was done using SPSS software (p < 0.05). The research protocol was approved by the National Committee of Ethics in Research (CONEP), resgistered by the number 14097. WPC showed a positive effect in the nutritional status of the patients, but it did not influence their body composition. Percentual distribution of macronutrients was adequate in all times of analyses for both WPC and maltodextrin (placebo) groups, but the percentage of adequacy of the majority of micronutrients did not reach recommendation. Other laboratorial analyses and evolution of mucositis did not show any difference between WPC and placebo groups. Comparison of AML patients with a group of healthy control showed higher concentrations of albumin, prealbumin, haematocrit, hemoglobin, platelets, Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccine-stimulated tumor necrosis factor alpha (TNF-a), interleukin 6 (IL-6), interleukin 10 (IL-10) and interferon gamma (IFN-?) and phytohemaglutinin (PHA)- stimulated IL-6 in controls. On the other hand, patients with AML had higher red blood cell glutathione concentration and spontaneous TNF-a and IFN-??production in comparison to controls. Chapter 3 describes the experiments envolved in the development of a chemotherapic-induced model of mucosites, in Wistar rats, in which 5-Fluoruracila (5-FU) and Vincristine Sulfate (VS) were used, in various concentrations and number of doses. Through this experiment it was concluded that the VS was not a good promoter of mucositis in rats, unlike 5-FU. From these results, experiments were performed with 5-FU considering conditions of the experiments including the number, frequency and concentration of the doses of chemotherapic. The best model was obtained by the administration of 3 doses of 5-FU, each with a 3-days interval and concentrations in the range of 50 to 70 mg/Kg/dose. Haematological parameters and erythrocyte glutathione (GSH) were not influenced by pelletization of the diet and no difference was found between WPC and casein groups. Independent of the protein type (casein or WPC) the effect of 5-Fluoruracila was less deleterious when the diets were offered prior to the chemotherapic treatment. Contrary to expected, sheep red blood cells did not stimulate higher production of erythrocyte GSH by the WPC. WPC decreased mucosites intensity better than casein protecting the mucosa during the most critical periods (72h after 2nd and 3rd doses of 5-FU) in the intestinal regions of major prevalence of mucositis (duodenum and jejunum). More studies are required to support the WPC benefit in the protection and recovery of the mucosa GIT in experimental animal models, and possibly in humans. In chapter 4, cells originated from patients with Acute Lymphoid Leukemia (ALL) from Centro Infantil Boldrini were inoculated in NOD/SCID mice. The animals were fed with commercial diet or AIN-93G diet with WPC or casein as the only protein source and used the chemotherapic vincristine sulfate. Body weight, diet ingestion, ratio between organs (kidney, spleen and liver) and body weight, leukemia evolution, survival time, haemogram and glutathione levels were evaluated. The cell lineages K562 (Chronic Myeloid Leukemia), Nalm-6 (B cell, ALL), Jurkat (T cell, ALL), CEM (T cell, ALL), RAMOS (Burkitt¿s Lymphoma) and HL-60 (AML) were used for the in vitro assays, in which WPC cytotoxicity (IC50), cell viability and glutathione levels were accessed in four different times (0, 24, 48 and 72h) and conditions (cells; cells + WPC; cells + WPC + ARA-C; cells + ARA-C). Data were submitted to statistic analysis by using the: Basic Statistics and Tables software. There was no differences between WPC and casein in relation to the parameters evaluated in vivo, with the exception of the analysis of Minimal Residual Disease (MRD), in which casein seemed to be more effective than WPC. Results on body weight, ratio between organs and body weight and evalution of leukemia were better for the WPC group when compared with animals fed commercial diet. No synergistic effect between the WPC and vincristine sulfate could be observed. In the in vitro experiments, WPC IC50 was 6,72 mg/mL for Nalm-6 and 11,84 mg/mL for CEM cells. K562, Nalm-6 and HL-60 cell lineages showed similar viability profiles. However, each lineage produced different total glutathione concentration in the culture medium, with a higher production achieved by HL-60 cells, followed by K562 cells / Doutorado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Doutor em Alimentos e Nutrição

Estudos recentes indicam que os peptídeos obtidos pela hidrolise enzimática da caseína podem apresentar atividades antioxidantes. Neste trabalho, previamente obteve-se os peptídeos através de hidrolise da caseína utilizando as enzimas Alcalase e Flavourzyme (4h, a 50ºC e pH 8), selecionando os que apresentaram as melhores características, in vitro, relativas à atividade antioxidante. A hidrolise enzimática utilizando a enzima Flavourzyme mostrou melhores resultados, com alto valor de proteína solúvel e conteúdo de aminoácidos livres, além de peptídeos de menor peso molecular do que com a Alcalase, como observado nas análises de cromatografia de permeação em gel e eletroforese em gel de poliacrilamida. Os peptídeos de caseína obtidos com a Flavourzyme também apresentaram melhores resultados utilizando o método ABTS na determinação da capacidade antioxidante. O hidrolisado obtido a partir da enzima Flavourzyme foi aplicado em produtos cárneos e em chocolate branco. Em produtos cárneos, os peptídeos de caseína (2.0%) inibiram, efetivamente, a peroxidação lipídica em carne moída (100%) e em carne mecanicamente separada de ave (CMS) (cerca de 20%) indicando que estes peptídeos podem ser utilizados nestes produtos, auxiliando na prevenção da formação de flavor desagradável e aumentando sua vida útil. Relativamente a sua aplicação em chocolate branco, esta adição teve o intuito de inibir escurecimento deste produto, fator considerado como limitante na sua vida-útil sendo conseqüência tanto de reações de escurecimento não enzimático quanto da oxidação de lipídeos. Os parâmetros que indicaram alteração lipidica e reações não enzimáticas foram mensurados em três diferentes amostras de chocolate branco: uma amostra com 0,2%, de manteiga de cacau, de antioxidante sintético Grindox 562, outra com 0,2%, de manteiga de cacau, dos peptídeos de caseína e a terceira amostra sem qualquer tipo de antioxidante. As amostras foram expostas a duas temperaturas diferentes: 20 ± 2 e 28 ± 2ºC. Os resultados das análises realizadas indicaram que as amostras armazenadas à temperatura de 20ºC apresentaram resultados significativamente melhores àqueles das amostras armazenadas à temperatura de 28ºC, relativos ao índice de acidez, à atividade de água, ao índice de peróxido, à cor e às substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), indicando melhor conservação deste produto. Também foi observado que a adição de quaisquer dos antioxidantes empregados não influenciou de forma significativa os resultados obtidos, evidenciandose assim, que o principal parâmetro responsável pelas alterações do chocolate branco em sua vida útil refere-se à temperatura de armazenamento a qual as amostras foram submetidas. / Recent studies indicate that peptides obtained by casein hydrolysis may have antioxidant activity. In this work, previous casein peptides were obtained by enzymatic hydrolysis using Alcalase and Flavourzyme (4h, at 50ºC and pH 8), selecting the ones that showed the best characteristics in vitro, related to the antioxidant activity. The enzymatic hydrolysis using Flavourzyme showed the best results, with higher soluble protein and free amino acid content and producing lower molecular weight peptides than Alcalase, as observed by gel permeation chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis. Related to its application in meat products, casein peptides obtained with Flavourzyme also exhibited greater antioxidant capacity using the ABTS method. The casein hydrolyzed from Flavourzyme enzyme was applicated in ground beef homogenates, mechanically deboned meat (MDM) of poultry and white chocolate. In meat products, casein peptides (2.0%) effectively inhibited lipid peroxidation in ground beef homogenates (100%) and mechanically deboned meat (about 20%) of poultry. Casein peptides may be useful in meat processing as another naturally occurring antioxidant, helping to prevent off-flavor formation in meat products and increasing shelf life. In the use for white chocolate, the goal was to inhibit its browning, the main problems that limit the white chocolate’s shelf-life. Non-enzymatic browning reaction and lipid oxidation were involved directly in the browning of white chocolate. Thus, parameters which indicated fat alteration and non-enzymatic reactions were measured in three different samples of white chocolate. One sample with 0,2% of cocoa butter, with the synthetic antioxidant Grindox 562, other with 0,2% of cocoa butter, with the natural antioxidant and the third sample without any kind of antioxidant. The samples were exposed to two different temperatures: 20 ± 2 and 28 ± 2ºC. The results of the analysis made indicated that the samples stored at the temperature of 20ºC showed results significantly better to those samples stored at the temperature of 28ºC, related to the conservation of the white chocolate. Besides, the results indicated that the addition of any antioxidants employees has not influenced in a significant way the results obtained. Thus, it was evidenced that the main responsible parameter for the alterations of the white chocolate’s shelf-life is related to the storage temperature to which the samples were submitted.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-23Bitstream added on 2014-11-10T11:58:01Z : No. of bitstreams: 1 000786749_20150920.pdf: 227688 bytes, checksum: c800c0192a1f81b1c24ac20d93cf4f4c (MD5) Bitstreams deleted on 2015-09-21T13:18:45Z: 000786749_20150920.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-21T13:19:48Z : No. of bitstreams: 1 000786749.pdf: 1032630 bytes, checksum: 9ff7c0ae2515a60572247ae468fd531f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Peptidases são enzimas responsáveis por realizar a clivagem de ligações peptídicas de outras proteínas e peptídeos. Essas enzimas apresentam grande importância, pois são utilizadas em vários segmentos industriais, desde a indústria alimentícia até mesmo no processamento de couro e pele e formulações de medicamentos. Uma das principais aplicações das peptidases é nos laticínios, na produção de queijo, que inicialmente envolve a coagulação das caseínas do leite pela ação de enzimas proteolíticas coagulantes, sendo a renina a principal delas. Enzimas microbianas coagulantes de leite são peptidases aspárticas que catalisam a coagulação do leite, substituindo o coalho de vitelo. Em trabalhos anteriores foi isolado o fungo termofílico Thermomucor indicae-seudaticae N31 que produziu em fermentação em estado sólido (FES), uma peptidase com capacidade de hidrolisar a κ-caseína do leite e produzir coágulo de boa qualidade. Entretanto, sua caracterização funcional e especificidade de ação ainda não estão claras. Assim, neste estudo, deu-se continuidade à investigação de estrutura e ação desta enzima coagulante. Foi realizado o monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência, foi feita análise da especificidade primária da peptidase utilizando substrato de fluorescência da série Abz-LSFMAIQ-EDDnp e foi determinada a sequência primária da proteína por espectrometria de massas. O monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência mostrou que o perfil do extrato bruto de Thermomucor indicae-seudaticae N31 apresenta alta similaridade com as enzimas comerciais das marcas Bela-Vista e Chr-Hansen obtidas dos fungos Rhizomucor miehei e Aspergillus niger, respectivamente. A análise de especificidade primária da peptidase demonstrou alta especificidade e afinidade pelo substrato sintético. A determinação do ... / Peptidase enzymes are responsible for catalyze the cleavage of peptide bonds of other proteins. These enzymes present great importance, therefore, are used in several industrial segments, since the food industry even in the processing of leather and formulations of medicinal products. One major application of peptidases is in the dairy industry for cheese production, which initially involves clotting of milk caseins by the action of coagulant proteolytic enzymes being rennin the main one. Microbial rennet-like milk-clotting enzymes are aspartic proteinases that catalyze milk coagulation, substituting calf rennet. In previous study it was isolated a thermophilic fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31 that produced on Solid State Fermentation (SSF), a peptidase with capacity to hydrolyses the k-casein of milk and produce good quality curd. However its functional characterization and specificity of action is not clear yet. Thus, in this study we continued the investigation of structure and action of this enzyme coagulant. Was carried out the monitoring of enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase, was analyzed the specificity of primary peptidase using substrate of fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide series Abz-LSFMAIQ-EDDnp and determined the primary sequence of the protein by mass spectrometry. Monitoring the enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase showed that the crude extract Thermomucor indicae-seudaticae N31 shows high similarity with commercial enzymes brands Bela-Vista and Chr-Hansen obtained from fungi Rhizomucor miehei and Aspergillus niger, respectively. The analysis of primary peptidase specificity demonstrated high specificity and affinity for the synthetic substrate. The determination of the cleavage site showed 46% hydrolysis of the bond between the amino acids phenylalanine and methionine and 54% between alanine ...

Estudos recentes indicam que os peptídeos obtidos pela hidrolise enzimática da caseína podem apresentar atividades antioxidantes. Neste trabalho, previamente obteve-se os peptídeos através de hidrolise da caseína utilizando as enzimas Alcalase e Flavourzyme (4h, a 50ºC e pH 8), selecionando os que apresentaram as melhores características, in vitro, relativas à atividade antioxidante. A hidrolise enzimática utilizando a enzima Flavourzyme mostrou melhores resultados, com alto valor de proteína solúvel e conteúdo de aminoácidos livres, além de peptídeos de menor peso molecular do que com a Alcalase, como observado nas análises de cromatografia de permeação em gel e eletroforese em gel de poliacrilamida. Os peptídeos de caseína obtidos com a Flavourzyme também apresentaram melhores resultados utilizando o método ABTS na determinação da capacidade antioxidante. O hidrolisado obtido a partir da enzima Flavourzyme foi aplicado em produtos cárneos e em chocolate branco. Em produtos cárneos, os peptídeos de caseína (2.0%) inibiram, efetivamente, a peroxidação lipídica em carne moída (100%) e em carne mecanicamente separada de ave (CMS) (cerca de 20%) indicando que estes peptídeos podem ser utilizados nestes produtos, auxiliando na prevenção da formação de flavor desagradável e aumentando sua vida útil. Relativamente a sua aplicação em chocolate branco, esta adição teve o intuito de inibir escurecimento deste produto, fator considerado como limitante na sua vida-útil sendo conseqüência tanto de reações de escurecimento não enzimático quanto da oxidação de lipídeos. Os parâmetros que indicaram alteração lipidica e reações não enzimáticas foram mensurados em três diferentes amostras de chocolate branco: uma amostra com 0,2%, de manteiga de cacau, de antioxidante sintético Grindox 562, outra com 0,2%, de manteiga de cacau, dos peptídeos de caseína e a terceira amostra sem qualquer tipo de antioxidante. As amostras foram expostas a duas temperaturas diferentes: 20 ± 2 e 28 ± 2ºC. Os resultados das análises realizadas indicaram que as amostras armazenadas à temperatura de 20ºC apresentaram resultados significativamente melhores àqueles das amostras armazenadas à temperatura de 28ºC, relativos ao índice de acidez, à atividade de água, ao índice de peróxido, à cor e às substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), indicando melhor conservação deste produto. Também foi observado que a adição de quaisquer dos antioxidantes empregados não influenciou de forma significativa os resultados obtidos, evidenciandose assim, que o principal parâmetro responsável pelas alterações do chocolate branco em sua vida útil refere-se à temperatura de armazenamento a qual as amostras foram submetidas. / Recent studies indicate that peptides obtained by casein hydrolysis may have antioxidant activity. In this work, previous casein peptides were obtained by enzymatic hydrolysis using Alcalase and Flavourzyme (4h, at 50ºC and pH 8), selecting the ones that showed the best characteristics in vitro, related to the antioxidant activity. The enzymatic hydrolysis using Flavourzyme showed the best results, with higher soluble protein and free amino acid content and producing lower molecular weight peptides than Alcalase, as observed by gel permeation chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis. Related to its application in meat products, casein peptides obtained with Flavourzyme also exhibited greater antioxidant capacity using the ABTS method. The casein hydrolyzed from Flavourzyme enzyme was applicated in ground beef homogenates, mechanically deboned meat (MDM) of poultry and white chocolate. In meat products, casein peptides (2.0%) effectively inhibited lipid peroxidation in ground beef homogenates (100%) and mechanically deboned meat (about 20%) of poultry. Casein peptides may be useful in meat processing as another naturally occurring antioxidant, helping to prevent off-flavor formation in meat products and increasing shelf life. In the use for white chocolate, the goal was to inhibit its browning, the main problems that limit the white chocolate’s shelf-life. Non-enzymatic browning reaction and lipid oxidation were involved directly in the browning of white chocolate. Thus, parameters which indicated fat alteration and non-enzymatic reactions were measured in three different samples of white chocolate. One sample with 0,2% of cocoa butter, with the synthetic antioxidant Grindox 562, other with 0,2% of cocoa butter, with the natural antioxidant and the third sample without any kind of antioxidant. The samples were exposed to two different temperatures: 20 ± 2 and 28 ± 2ºC. The results of the analysis made indicated that the samples stored at the temperature of 20ºC showed results significantly better to those samples stored at the temperature of 28ºC, related to the conservation of the white chocolate. Besides, the results indicated that the addition of any antioxidants employees has not influenced in a significant way the results obtained. Thus, it was evidenced that the main responsible parameter for the alterations of the white chocolate’s shelf-life is related to the storage temperature to which the samples were submitted.

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodríguez / Resumo: Peptidases são enzimas responsáveis por realizar a clivagem de ligações peptídicas de outras proteínas e peptídeos. Essas enzimas apresentam grande importância, pois são utilizadas em vários segmentos industriais, desde a indústria alimentícia até mesmo no processamento de couro e pele e formulações de medicamentos. Uma das principais aplicações das peptidases é nos laticínios, na produção de queijo, que inicialmente envolve a coagulação das caseínas do leite pela ação de enzimas proteolíticas coagulantes, sendo a renina a principal delas. Enzimas microbianas coagulantes de leite são peptidases aspárticas que catalisam a coagulação do leite, substituindo o coalho de vitelo. Em trabalhos anteriores foi isolado o fungo termofílico Thermomucor indicae-seudaticae N31 que produziu em fermentação em estado sólido (FES), uma peptidase com capacidade de hidrolisar a κ-caseína do leite e produzir coágulo de boa qualidade. Entretanto, sua caracterização funcional e especificidade de ação ainda não estão claras. Assim, neste estudo, deu-se continuidade à investigação de estrutura e ação desta enzima coagulante. Foi realizado o monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência, foi feita análise da especificidade primária da peptidase utilizando substrato de fluorescência da série Abz-LSFMAIQ-EDDnp e foi determinada a sequência primária da proteína por espectrometria de massas. O monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência mostrou que o perfil do extrato bruto de Thermomucor indicae-seudaticae N31 apresenta alta similaridade com as enzimas comerciais das marcas Bela-Vista e Chr-Hansen obtidas dos fungos Rhizomucor miehei e Aspergillus niger, respectivamente. A análise de especificidade primária da peptidase demonstrou alta especificidade e afinidade pelo substrato sintético. A determinação do ... / Abstract: Peptidase enzymes are responsible for catalyze the cleavage of peptide bonds of other proteins. These enzymes present great importance, therefore, are used in several industrial segments, since the food industry even in the processing of leather and formulations of medicinal products. One major application of peptidases is in the dairy industry for cheese production, which initially involves clotting of milk caseins by the action of coagulant proteolytic enzymes being rennin the main one. Microbial rennet-like milk-clotting enzymes are aspartic proteinases that catalyze milk coagulation, substituting calf rennet. In previous study it was isolated a thermophilic fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31 that produced on Solid State Fermentation (SSF), a peptidase with capacity to hydrolyses the k-casein of milk and produce good quality curd. However its functional characterization and specificity of action is not clear yet. Thus, in this study we continued the investigation of structure and action of this enzyme coagulant. Was carried out the monitoring of enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase, was analyzed the specificity of primary peptidase using substrate of fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide series Abz-LSFMAIQ-EDDnp and determined the primary sequence of the protein by mass spectrometry. Monitoring the enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase showed that the crude extract Thermomucor indicae-seudaticae N31 shows high similarity with commercial enzymes brands Bela-Vista and Chr-Hansen obtained from fungi Rhizomucor miehei and Aspergillus niger, respectively. The analysis of primary peptidase specificity demonstrated high specificity and affinity for the synthetic substrate. The determination of the cleavage site showed 46% hydrolysis of the bond between the amino acids phenylalanine and methionine and 54% between alanine ... / Mestre

Estudos recentes indicam que os peptídeos obtidos pela hidrolise enzimática da caseína podem apresentar atividades antioxidantes. Neste trabalho, previamente obteve-se os peptídeos através de hidrolise da caseína utilizando as enzimas Alcalase e Flavourzyme (4h, a 50ºC e pH 8), selecionando os que apresentaram as melhores características, in vitro, relativas à atividade antioxidante. A hidrolise enzimática utilizando a enzima Flavourzyme mostrou melhores resultados, com alto valor de proteína solúvel e conteúdo de aminoácidos livres, além de peptídeos de menor peso molecular do que com a Alcalase, como observado nas análises de cromatografia de permeação em gel e eletroforese em gel de poliacrilamida. Os peptídeos de caseína obtidos com a Flavourzyme também apresentaram melhores resultados utilizando o método ABTS na determinação da capacidade antioxidante. O hidrolisado obtido a partir da enzima Flavourzyme foi aplicado em produtos cárneos e em chocolate branco. Em produtos cárneos, os peptídeos de caseína (2.0%) inibiram, efetivamente, a peroxidação lipídica em carne moída (100%) e em carne mecanicamente separada de ave (CMS) (cerca de 20%) indicando que estes peptídeos podem ser utilizados nestes produtos, auxiliando na prevenção da formação de flavor desagradável e aumentando sua vida útil. Relativamente a sua aplicação em chocolate branco, esta adição teve o intuito de inibir escurecimento deste produto, fator considerado como limitante na sua vida-útil sendo conseqüência tanto de reações de escurecimento não enzimático quanto da oxidação de lipídeos. Os parâmetros que indicaram alteração lipidica e reações não enzimáticas foram mensurados em três diferentes amostras de chocolate branco: uma amostra com 0,2%, de manteiga de cacau, de antioxidante sintético Grindox 562, outra com 0,2%, de manteiga de cacau, dos peptídeos de caseína e a terceira amostra sem qualquer tipo de antioxidante. As amostras foram expostas a duas temperaturas diferentes: 20 ± 2 e 28 ± 2ºC. Os resultados das análises realizadas indicaram que as amostras armazenadas à temperatura de 20ºC apresentaram resultados significativamente melhores àqueles das amostras armazenadas à temperatura de 28ºC, relativos ao índice de acidez, à atividade de água, ao índice de peróxido, à cor e às substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), indicando melhor conservação deste produto. Também foi observado que a adição de quaisquer dos antioxidantes empregados não influenciou de forma significativa os resultados obtidos, evidenciandose assim, que o principal parâmetro responsável pelas alterações do chocolate branco em sua vida útil refere-se à temperatura de armazenamento a qual as amostras foram submetidas. / Recent studies indicate that peptides obtained by casein hydrolysis may have antioxidant activity. In this work, previous casein peptides were obtained by enzymatic hydrolysis using Alcalase and Flavourzyme (4h, at 50ºC and pH 8), selecting the ones that showed the best characteristics in vitro, related to the antioxidant activity. The enzymatic hydrolysis using Flavourzyme showed the best results, with higher soluble protein and free amino acid content and producing lower molecular weight peptides than Alcalase, as observed by gel permeation chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis. Related to its application in meat products, casein peptides obtained with Flavourzyme also exhibited greater antioxidant capacity using the ABTS method. The casein hydrolyzed from Flavourzyme enzyme was applicated in ground beef homogenates, mechanically deboned meat (MDM) of poultry and white chocolate. In meat products, casein peptides (2.0%) effectively inhibited lipid peroxidation in ground beef homogenates (100%) and mechanically deboned meat (about 20%) of poultry. Casein peptides may be useful in meat processing as another naturally occurring antioxidant, helping to prevent off-flavor formation in meat products and increasing shelf life. In the use for white chocolate, the goal was to inhibit its browning, the main problems that limit the white chocolate’s shelf-life. Non-enzymatic browning reaction and lipid oxidation were involved directly in the browning of white chocolate. Thus, parameters which indicated fat alteration and non-enzymatic reactions were measured in three different samples of white chocolate. One sample with 0,2% of cocoa butter, with the synthetic antioxidant Grindox 562, other with 0,2% of cocoa butter, with the natural antioxidant and the third sample without any kind of antioxidant. The samples were exposed to two different temperatures: 20 ± 2 and 28 ± 2ºC. The results of the analysis made indicated that the samples stored at the temperature of 20ºC showed results significantly better to those samples stored at the temperature of 28ºC, related to the conservation of the white chocolate. Besides, the results indicated that the addition of any antioxidants employees has not influenced in a significant way the results obtained. Thus, it was evidenced that the main responsible parameter for the alterations of the white chocolate’s shelf-life is related to the storage temperature to which the samples were submitted.