A apoptose é um processo fisiológico que desempenha papel crucial no desenvolvimento, remodelagem e senescência teciduais, inclusive placentários. A placenta, enquanto órgão temporário, atravessa todas estas fases em aproximadamente 10 meses, na espécie bubalina. O crescimento da placenta e a nutrição fetal requerem altas taxas de renovação e diferenciação celulares, e a maturação placentária está relacionada à redução das células epiteliais das criptas carunculares maternas. As modificações morfológicas celulares decorrentes do processo de apoptose são fruto de eventos bioquímicos complexos promovidos por uma família de cisteína-proteases, as caspases, especialmente as caspases executoras, dentre as quais se destaca a caspase-3, capaz de degradar várias proteínas citoplasmáticas e nucleares. Durante a apoptose, ocorre a clivagem caspase-mediada da citoqueratina 18, proteína dos filamentos intermediários do citoesqueleto, e com isso a formação de um neoepítopo específico. Por meio de métodos imunoistoquímicos pode-se detectar a presença tanto deste neoepítopo, quanto da forma ativa da caspase-3, o que demonstra que a célula entrou em estágio irreversível de morte celular. Morfologicamente, algumas das principais alterações celulares observadas são condensação da cromatina, a degradação e fragmentação do DNA, a formação de ?blebs? (pregas/bolhas) na membrana plasmática, além da fragmentação celular em corpúsculos apoptóticos, os quais podem ser identificados em cortes corados pelo método de rotina hematoxilina e eosina, utilizando-se microscópio de imunofluorescência, devido à eosinofluorescência das células em apoptose. Assim como a apoptose, a proliferação celular participa no equilíbrio homeostático tissular. Neste estudo, pretende-se avaliar a ocorrência de apoptose e proliferação celular em 42 placentônios de diferentes animais em diversas fases gestacionais (2-10 meses de gestação), em tecidos fixados em 4% paraformoldeído, incluídos em paraplast e submetidos à imunoistoquímica (anticorpo monoclonal M30 CytoDeath; Caspase-3 Clivada; PCNA - antígeno de marcação nuclear), sendo também avaliada a presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes nas amostras. Utilizando-se M30 e caspase-3 clivada pudemos constatar a ocorrência de apoptose nos epitélios uterino e trofoblástico, em células gigantes placentárias e, ocasionalmente, em células mesenquimais fetais, do estroma uterino e endoteliais. Não houve diferenças significativas (p<0.05) entre os métodos adotados, mas sim entre os estágios gestacionais. Para o M30, houve um aumento significante da apoptose do primeiro grupo (2-4.5 meses) em relação ao quarto grupo (9-10 meses); no caso da Caspase-3 Clivada houve um aumento estatísticamente significante (p<0.05) entre os três primeiros grupos (2-4.5; 5-6.5; e 7-8.5 meses de gestação, respectivamente) de animais em relação ao quarto grupo. Para o PCNA, ocorreu uma diminuição no número de células em proliferação dos dois primeiros grupos de animais em relação ao quarto grupo (p<0.05). A presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes pôde ser observada em todas as amostras. Nossos resultados sugerem haver uma relação entre a ocorrência de apoptose e a maturação, senescência e liberação placentárias em ruminantes. / Apoptosis is a physiological process that plays a crucial role in the development, remodeling and aging of the placenta. The placenta is a temporary organ that undergoes growth and development, followed by senescence and death in 10 months in the buffalo species. Placental growth and fetal nutrition require high rates of cellular turnover and differentiation, and placental maturation is correlated to the reduction of the number of epithelial cells of the maternal crypts. The morphological changes of the apoptotic cells are product of complex variety of biochemical events promoted by a family of cystein-proteases, the caspases, mainly the effectors caspases, and among them the caspase-3, which is able to degrade cytoplasmic and nuclear proteins. During apoptosis, the caspase-mediated cleavage of cytokeratin 18, which is one of the first intermediate filament proteins of the cytoskeleton, leads to the formation of a specific neo-epitope. It is possible to detect the presence of this neo-epitope by immunohistochemistry, as well as the active form of caspase-3, showing that the cell has entered an irreversible stage of cell death. Morphologically, some of the main observed cellular alterations are condensation of the chromatin, degradation and spalling of the DNA, blebbing of the cell membrane and the formation of apoptotic bodies. These bodies can be identified in slides stained by hematoxilin and eosin with a fluorescent microscope, due to the eosinofluorescent property of the apoptotic cells. Like apoptosis, cellular proliferation also contributes to the tissue homeostasis. In the present study, we intend to evaluate the occurrence of apoptosis and cellular proliferation in 42 placentomes, collected from different animals in several gestacional phases (2-10 months of gestation), fixed in 4% paraformaldehyde, processed for embedding in paraplast and cut in sections, through immunohistochemistry (monoclonal antibody M30 CytoDeath; Cleaved Caspase-3; PCNA - antigen of nuclear proliferation). The presence of eosinofluorescent apoptotic bodies were also studied in the samples. M30 and Cleaved Caspase-3 allowed to show the occurrence of apoptosis in the uterine and trophoblastic ephitelium, in placental giant cells and, occasionally, in the fetal mesenquimal cells, in the uterine stroma and endothelium cells. There were no significant differences (p<0.05) between the adopted methods, although there were differences between the gestational phases studied. For M30, there was an increase of the number of apoptotic cells (p<0.05) from the first group (2-4.5 months) in relation to the fourth group of animals (9-10 months); for the Cleaved Caspase-3 there was a statistical significant increase (p<0.05) between the first three groups of animals (2-4.5; 5-6.5; and 7-8.5 months of gestation, respectively) and the last one. In relation to the PCNA, a decrease in the number of proliferative cells occurred from the first two groups of animals to the fourth group (p<0.05). The occurrence of eosinofluorescent apoptotic bodies was observed in all the samples studied . Our data suggest a relationship between apoptosis and the maturation, senescence and release of the ruminant placenta.

A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5&micro;M de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p&lt;0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p&lt;0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p&lt;0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p&lt;0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p&lt;0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido. A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5µM de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p<0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p<0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p<0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p<0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p<0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido / Melatonin (MEL) is a lipophilic indolamine with well-known antioxidant properties, by an scavenger action, producing its metabolites such as N1-acetil- N2- formil-5 metoxykinuramin (AFMK) or through a membrane receptor pathway (MT1 and MT2). Although, little is known about its stability and ideal dose on in vitro bovine embryo culture (IVC). In this work, to evaluate if there is any loss of MEL to the IVC systems, we determinate by HPLC, the real concentration of MEL in each system, with and without mineral oil, after the addition of different initial doses of MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), and then analyzed at different incubation period (0, 24, 72 e 144 hours). Then, it was evaluated the action and consumption of MEL in IVC of embryos submitted to induced oxidative stress. The IVC was done in controlled atmosphere (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). At Day 5, embryos over 16 cells were randomly divided in the treatments 0, 25, 50 and 100 ng/ml of MEL, and all received the induction with 5&microM of menadione during 24 hours. After incubation, the media was collected for HPLC analysis (MEL and AFMK) and embryos returned for culture with DM until Day8 (D8). The blastocysts (D8) were designated to Reactive oxygen species (ROS) evaluation, total number of cell (nBLAST), detection of caspase-3 and -7 activity (CASP) and gene expression (GRP78, HSP60 and SOD1). Blastocyst rate (TXBL) was also assessed. Result show that there is no loss of MEL to the oil, or degradation over incubation time. At 50ng/ml there was a consumption of melatonin in the media and formation of AFMK (p&lt;0.05), higher TXBL (45,93 vs. 33,06%, p&lt;0.05) and nBLAST (143 vs. 93,1, p&lt;0.05), lower ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p&lt;0.05) and CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p&lt;0.05), when in contrast with the group without MEL. However, there was no difference in gene expression. In conclusion, melatonin has a stable behavior in IVC system, which allows the use in system with and without oil. Also, at the dose of 50ng/ml has an antioxidant effect, improving quality and production of embryos culture in vitro at induced oxidative stress

Apoptose é uma forma de morte celular extremamente conservada que tem papel primordial no desenvolvimento animal e na homeostasia celular, agindo como mecanismo de controle de qualidade com a função de remover células danificadas, em excesso ou não-funcionais. Este processo tem papel importante no desenvolvimento embrionário pré-implantacional, pois as células embrionárias estão sujeitas aos danos no DNA que podem ativar mecanismos de reparo de DNA ou induzir apoptose, que culmina com a ativação da enzima caspase-3 responsável pela clivagem de vários substratos celulares. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivos determinar a presença da Caspase-3 ativa (+casp-3) e sua influência no desenvolvimento de embriões suínos no estágio de pré-implantação, bem como investigar a detecção de proteínas que atuam no mecanismo de lesão e reparo do DNA. Foram realizados 4 experimentos com oócitos imaturos de fêmeas pré-púberes, obtidos de ovários oriundos de abatedouro, maturados in vitro (MIV) por 44-46 horas. Oócitos em metáfase II (MII) foram ativados partenogeneticamente (AP) com ionomicina e cloreto de estrôncio e cultivados in vitro em PZM3 a 38ºC e 5% CO2 em ar e alta umidade. No primeiro experimento os embriões foram classificados em 4 grupos de acordo com o tempo de clivagem e o número de células: R4 - clivado às 24 horas e com &ge;4 células às 48 horas; R2 - clivado às 24 horas e com 2 ou 3 células às 48 horas; L4 - não clivado às 24 horas e com &ge;4 células às 48 horas; L2 - não clivado às 24 horas e com 2 ou 3 células às 48 horas. Os embriões foram então avaliados no D-6 do CIV para determinação do índice de desenvolvimento até o estágio de blastocisto. Os embriões do grupo R apresentaram maiores índices de blastocisto, R4 - 66,1 (174/263) e R2 - 59,6 (62/104) e maior número de núcleos por blastocisto, R4 - 40,1 e R2 - 37,8, quando comparados ao grupo L, L4 - 15,4 (6/39) e L2-16,8 (13/77); L4-18,5 e L2-18,3 (Qui-quadrado e Tukey-Kramer, respectivamente, P<0,05); entretanto, não houve diferença entre os grupos R4 e R2 e L4 e L2. Para o segundo experimento utilizou-se apenas embriões R e L, classificados às 24hs do início do CIV. Ambos os grupos (R e L) foram destinados à análise de imunocitoquímica para +casp-3 fixados nos D2, D4 e D6, sendo cada um destes dias considerado um sub-experimento e realizado em manipulações diferentes. Foi observada localização citoplasmática da +casp-3 do D2 ao D6 e nuclear a partir do D5 de cultivo. A quantificação relativa da +casp-3 nos grupos R e L de cultivo foi de 2,4 vs 1,4; 1,1 vs 1,0 e 1,1 vs 1,2 para o D2, D4 e D6, respectivamente. Para avaliar a influência da +casp-3 no desenvolvimento de embriões suínos foi realizado o terceiro experimento utilizando o inibidor de caspase z-DEVD-fmk (100uM) durante a MIV, no início (D0 ao D2) ou no final (D4 ao D6) do cultivo. Embriões produzidos sem inibidor foram usados como controle. A presença do inibidor durante a MIV e no final do cultivo não afetou os índices de blastocistos. No entanto, a presença do inibidor durante as primeiras 48 horas de cultivo resultou em maior índice de blastocisto do que o grupo controle, 55,1 (59/107) e 37,5 (39/104) (Qui-quadrado, P<0,05). O último experimento foi realizado para investigar a presença das proteínas de reparo de lesão de DNA, &gamma;H2AX, 53BP1, NSB1 e RAD52, em embriões desenvolvimento R e L. Não foi detectada 53BP1 em embriões suínos AP durante o desenvolvimento inicial. Embriões do grupo L apresentaram maior quantidade de &gamma;H2AX no D-5 quando comparado ao grupo R; entretanto, não houve diferença de marcação para NSB1 e RAD52. Estes dados indicam que o mecanismo de apoptose interfere no desenvolvimento embrionário inicial com efeito positivo do inibidor de caspase, na taxa de blastocisto de embriões suínos AP. Embriões de desenvolvimento L apresentaram um aumento da sinalização às injúrias do DNA, entretanto, a diferenças quanto ao potencial de reparo do DNA lesado em embriões de diferentes potenciais de desenvolvimentos, ainda precisam ser melhor investigadas. / Apoptosis is a highly conserved form of cell death that plays a major role in animal development and cellular homeostasis by acting as a quality control mechanism to remove cells that are damaged, nonfunctional, misplaced or supranumerary. This form of cell death plays a major role on preimplantation embryonic development since embryonic cells are often subject to DNA damage, triggering either DNA damage and repair mechanisms or apoptosis. Once initiated the apoptotic process leads to caspase activation and cleavage of cellular substrates. The aim of the present study was to quantify active Caspase-3 (+casp-3) and to determine the role of this pro-apoptotic enzyme on the development of preimplantation porcine embryos, as well as to investigate the presence and localization of DNA damage and repair proteins. Four experiments were conducted using slaughterhouse immature oocytes collected from pre-pubertal gilt ovaries and in vitro matured (IVM) for 44-46 h. Metaphase II (MII) oocytes were parthenogenetically activated (PA) using ionomycin and strontium chloride and cultured in PZM-3 at 38&ordm;C, 5% CO2 in air and high humidity. In the first study embryos were distributed into 4 groups according to cleavage time and cell number: R4 - cleaved at 24 h with &ge;4-cells at 48 h; R2 - cleaved at 24 h with 2-3 cells at 48 h; L4 - non-cleaved at 24 h with &ge;4-cells at 48 h; L2 - non-cleaved at 24 h with 2-3 cells at 48 h. Group R embryos showed higher blastocyst rates R4-66.1 (174/263) and R2-59.6 (62/104) and more nuclei per blastocyst, R4-40.1 and R2-38.9, when compared to group L L4-15.4 (6/39) and L2-16.8 (13/77); L4-18.5 and L2-18.3 (Chi-square and Tukey-Kramer, P<0.05); however, there were no differences between R4 and R2 or L4 and L2. The second experiment used only early-(R) and late-cleaved embryos (L), classified at 24 h of IVC, fixed at D-2, D-4 and D-6 and then stained for +casp-3 immunofluorescence. In this embryos fixed at D-2, D-4 and D-6 were considered as sub-experiments conducted in different replicates. Active Caspase-3 cytoplasmic signal was detected in cultured embryos from D2 to D6 and nuclear signal was detected from D5 to D6. The relative amount of immunofluorescence signal for +casp-3 for groups R and L at D2, D4 and D6 of culture was 2.4 vs. 1.4; 1.1 vs. 1.0 and 1.1 vs. 1.2, respectively. A third experiment was conducted to evaluate the role of +casp-3 on porcine preimplantation embryos. In this study the Caspase inhibitor Z-DEVD-fmk (100 uM) was supplemented during maturation of porcine oocytes or embryo culture (D0 to D2 or D4 to D6). Addition of the caspase inhibitor during IVM or D4 to D6 of culture did not affect blastocyst rate. However, caspase inhibition from D0 to D2 increased development of porcine embryos to the blastocyst stage [55.1 (59/107) and 37.5 (39/104) for control and Z-DEVD-fmk, respectively; Chi-square, P<0.05). The last experiment investigated the presence of DNA damage and repair proteins &gamma;H2AX, 52BP1, NSB1, and Rad52 in early- and late-cleaved embryos by immunofluorescence. There was no 53BP1 signal in PA porcine embryos at beginning of IVC. Late-cleaved embryos showed higher &gamma;H2AX signal than early-cleaved embryos; however, there was no difference between NSB1 and Rad52 staining between these embryos. In conclusion, apoptosis and DNA damage and repair mechanisms play a role on development of porcine embryos. Active caspase-3 is present in porcine embryos throughout the preimplantation period and inhibition of this enzyme at early stages of in vitro culture can increase blastocyst rate of PA embryos. Moreover, late-cleaved embryos carry higher DNA damage than early-cleaved embryos. Therefore, the relationship between DNA repair mechanism and developmental potential of porcine embryos need to be further investigated.

A barreira placentária é constituída por duas camadas de células sinciciais, uma camada de células trofoblásticas gigantes e o endotélio fetal. Apesar da importância das camadas sinciciais no transporte molecular entre mãe e feto, o exato mecanismo de formação dessa barreira não está completamente elucidado em camundongos. Em humanos, estudos sugerem que a formação do sinciciotrofoblasto ocorre por um processo de fusão celular dependente de Caspase- 8, uma proteína iniciadora da cascata de apoptose. Desta forma, este estudo teve como proposta analisar o processo de formação das camadas sinciciais do labirinto em placentas de camundongos e o possível envolvimento da caspase-8 neste processo. Sítios de implantação foram coletados de camundongos fêmeas nos dias 8,5 a 11,5 de gestação e caracterizados morfologicamente através de marcadores de células precursoras sinciciais (EpCAM) e de células sinciciais maduras (Slc16A3) por meio de reações imunohitoquímicas. A expressão gênica dos marcadores diferenciais de células sinciciais também foi analisada por RT-PCR na região labiríntica dissecada nos diferentes dias de gestação. A expressão de Caspase-8 total e clivada também foi avaliada por Western blot e a relação entre a presença de Caspase-8 clivada e a indução de apoptose, avaliada por TUNEL e pela imunolocalização da Citoqueratina 18 clivada. Tambem foram realizadas análises com células labirínticas cultivadas, isoladas nos dias 8,5 a 10,5 de gestação. As células cultivadas foram caracterizadas morfologicamente e avaliadas quanto a expressão gênica de marcadores sinciciais e proteica de Caspase-8. Nossos resultados mostraram que os primeiros sinais morfológicos de formação da barreira placentária ocorream no dia 9,5 de gestação. O marcador EpCAM foi encontrado na base da placenta nos dias 8,5 e 9,5. No dia 11,5 de gestação, o labirinto já se encontra estruturado e funcional, o que foi indicado pela expressão de Slc16A3, nos dias 10,5 e 11,5 de gestação. A expressão gênica dos fatores de transcrição associados ao desenvolvimento das camadas sinciciais mostraram expressões crescentes ao longo do período estudado. Caspase-8 total e clivada mostrou intensa expressão no dia 9,5 de gestação, e aparentemente não estava associada à morte celular por apoptose, uma vez que não se detectou reatividade pela reação de TUNEL ou imunomarcação de Citoqueratina 18 clivada nas células labirínticas em formação em nenhum dos dias estudados. Células labirínticas obtidas aos 9,5 dias de gestação e cultivadas formaram ninhos celulares ao longo das 48 horas de cultura, com indícios morfológicos de sincicialização. A imunolocalização do marcador de células progenitoras do labirinto, EpCAM foi mais intensa nas culturas de 6 horas e se limitou a áreas ao redor dos ninhos celulares após 48 horas. Inversamente, a imunolocalização do transportador sincicial Slc16A3 não foi observada após 6 horas de cultura, mas foi bastante intensa no centro dos ninhos celulares após 48 horas. As culturas de labirinto de 9,5 das de gestação, também mostraram aumento de expressão das Sincitinas A e B ao longo do tempo de cultivo. A análise da expressão proteica de Caspase-8 mostrou expressão mais alta após 6 horas de cultivo do que a observada nos demais tempos experimentais. Por outro lado, a forma ativa (clivada) da caspase aumentou gradativamente após 24 e 48 horas de cultivo. Culturas submetidas ao tratamento com o inibidor farmacológico de Caspase-8 z-IEDT-fmk, mostraram perfis morfológicos alterados com redução da formação dos ninhos celulares e diminuição da reatividade ao Slc16A3. A expressão dos marcadores de diferenciação Sincitina A e B também foi significativamente diminuída (p<0.05) nestes experimentos em que a inibição da Caspase-8 clivada foi comprovada por Western blot. Estes achados mostraram a expressão de Caspase- 8, principalmente no dia 9,5 de gestação, nas células trofoblásticas labirínticas da placenta de camundongos e sugerem sua participação na formação das camadas sinciciais do labirinto. / Two layers of syncytial cells, a layer of trophoblastic giant cells and the fetal endothelium form the placental barrier. Despite the importance of the syncytial layers in molecular transport between mother and fetus, its exact developmental mechanism is still not completely elucidated in rodents. In humans, studies suggest that the formation of the syncytiotrophoblast occurs through a cell fusion process dependent on Caspase-8, an apoptosis cascade-initiating protein. In this way, this study had the proposal to analyze the process of formation of the syncytial layers of the labyrinth in placentas of mice and the possible involvement of Caspase-8 in this process. Implantation sites were collected from female mice on days 8.5 to 11.5 of gestation and morphologically characterized by the labyrinthine precursor cell marker EpCAM, and the mature syncytial cell marker - Slc16A3, through immunohistochemical reactions. The gene expression of the differential markers of syncytial cells was analyzed by RT-PCR in the labyrinthine region dissected on the different days of gestation. Total and cleaved Caspase-8 expression was also evaluated by Western blot and the relationship between the presence of cleaved Caspase-8 and the induction of apoptosis as assessed by TUNEL and the immunolocalization of the cleaved Cytokeratin 18. Analyzes were also performed with cultured labyrinth cells, isolated on days 8.5 to 10.5 of gestation. The cultured cells were characterized morphologically and evaluated for the gene expression of syncytial markers and Caspase-8 protein. Our results showed that the first morphological signs of placental barrier formation occurred on day 9.5 of gestation. The EpCAM marker was found at the base of the placenta on days 8.5 and 9.5. At day 11.5 of gestation, the labyrinth is already structured and functional, which was indicated by the expression of Slc16A3, on days 10.5 and 11.5 of gestation. The gene expression of the transcription factors associated with the development of the syncytial layers showed increased throughout the studied period. Total and cleaved Caspase-8 showed intense expression at day 9.5 of gestation, and apparently was not associated with cell death by apoptosis, since no reactivity was detected by the TUNEL reaction or cleaved Cytokeratin 18 immunolabeling in the labyrinthine zone. Labyrinthine cells obtained at 9.5 days of gestation formed nests during the 48 hours of culture, with morphological signs of syncytialization. Immunolocalization of the progenitor cell marker EpCAM was more intense in the 6-hour cultures and was limited to areas around the cell nests after 48 hours. Conversely, immunolocalization of the syncytial transporter Slc16A3 was not observed after 6 hours of culture but was quite intense at the center of the cell nests after 48 hours. Labyrinthine cell cultures of 9.5 gestation days also showed increased expression of A and B syncytins throughout the culture time. Analysis of the protein expression of Caspase- 8 showed higher expression after 6 hours of culture than that observed in the other experimental times. On the other hand, the active (cleaved) form of Caspase gradually increased after 24 and 48 hours of culture. Cultures submitted to the pharmacological inhibitor of Caspase-8 - z-IEDT-fmk showed altered morphological 18 profiles with reduction of cell nests formation and a decrease of reactivity to Slc16A3. The expression of the differentiation markers A and B Syncytins was also significantly decreased (p <0.05) in the experiments, in which the inhibition of the cleaved Caspase-8 was confirmed by Western blot. These findings show the expression of Caspase-8, mainly on day 9.5 of gestation, in the labyrinthine cells of the mice placenta and suggest its participation in the formation of the labyrinthine syncytial layers.

O reconhecimento da flagelina é compartilhado pelo receptor transmembrânico TLR5 e citosólico NAIP5/NLRC4. Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos efetores individuais induzidos a partir do reconhecimento extra e intracelular da flagelina. Aqui, nós demonstramos que macrófagos estimulados com a flagelina citosólica (FLA-BSDot) induziu a expressão de iNOS, enzima responsável pela produção do óxido nítrico (NO). A expressão de iNOS foi dependente do eixo NAIP5/NLRC4/caspase-1 e independente de IL-1&beta;, IL-18 e MyD88, descartando a via de ativação dos TLRs. Ainda, esta via não requer a ativação do fator de transcrição IRF-1, mas envolve a ativação do NF-kB, assim como a clivagem da enzima PARP-1 (poly(ADP-ribose)polymerase-1). Por fim, avaliamos a relevância biológica desta via no controle das infecções por L. pneumophila e S. Typhimurium, dados que definem um mecanismo efetor adicional no controle de patógenos. / Recognition of flagellin is shared by transmembranic TLR5 and cytosolic NAIP5/NLRC4. However, little is known about the individual effector mechanisms induced by extra and intracellular flagellin. Here, we have demonstrated that cytosolic flagellin-stimulated macrophages (FLA-BSDot) induced iNOS expression, an enzyme responsible for the production of nitric oxide (NO). iNOS expression was dependent of the NAIP5/NLRC4/caspase-1 axis and independent of IL-1&beta;, IL-18 and MyD88, discarding TLRs signaling pathway. Still, this pathway do not require the activation of IRF-1 transcriptional factor, but involves NF-kB activation as well as the cleavage of the enzyme, PARP-1 (poly(ADP-ribose)polymerase-1). Finally, we have evaluated the biological relevance of this pathway in the control of the infections by L. pneumophila e S. Typhimurium, which define an additional effector mechanism to the control of pathogens.

Legionella pneumophila, o agente etiológico da doença dos Legionários, é conhecida por desencadear a formação de poro em membranas de macrófagos derivados de medula óssea (BMMs) por mecanismos dependentes do sistema de secreção do tipo IV conhecido como Dot/Icm. Neste trabalho, foram utillizados vários mutantes de L. pneumophila em combinação com camundongos nocautes para investigar os fatores bacterianos e do hospedeiro envolvidos na formação de poro em BMMs. Observamos que apesar da atividade do Dot/Icm, a formação de poro não ocorre em BMMs deficientes para caspase-1 e Nlrc4. A formação de poro foi temporalmente associada com a secreção de IL-1b e precedeu a lise celular e a piroptose. A formação de poro foi dependente do Dot/Icm, mas independente de várias proteínas efetoras, da multiplicação bacteriana e da síntese de novo de proteínas. A flagelina, a qual é conhecida em ativar o inflamassoma de Nlrc4, foi necessária para a formação de poro; a bactéria mutante flaA falhou em induzir a permeabilização celular. Consequentemente, a transfecção da flagelina purificada foi suficiente para desencadear a formação de poro independente da infecção. Utilizando 11 diferentes espécies de Legionella, nós observamos alta formação de poro em resposta à L. micdadei, L. bozemanii, L. gratiana, L. jordanis e L. rubrilucens, e essa resposta estava correlacionada com a expressão de flagelina por essas espécies. Além disso, verificamos que as proteínas Asc e Caspase-11 apresentam fenótipo intermediário na formação de poro, sugerindo que outras vias podem estar envolvidas no processo. Observamos também que a formação de poro desencadeada por L. pneumophila difere daquela induzida pelo ATP. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a formação de poro não é uma resposta específica de L. pneumophila nem o resultado de dano da membrana induzido pelo Dot/Icm. Ao invés disso, a formação de poro é uma resposta do hospedeiro altamente coordenada, dependente dos componentes do inflamassoma Nlrc4 e caspase-1 e é desencadeada em resposta a bactérias que expressam o sistema de secreção do tipo IV e flagelina. / Legionella pneumophila, the etiological agent of Legionnaires disease, is known to trigger pore formation in bone marrow-derived macrophages (BMMs) by mechanisms dependent on the type IVB secretion system known as Dot/Icm. Here, we used several mutants of L. pneumophila in combination with knockout mice to assess the host and bacterial factors involved in pore formation in BMMs. We found that regardless of Dot/Icm activity, pore formation does not occur in BMMs deficient in caspase-1 and Nlrc4/Ipaf. Pore formation was temporally associated with IL-1b secretion and preceded host cell lysis and pyroptosis. Pore-forming ability was dependent on bacterial Dot/Icm but independent of several effector proteins, multiplication and de novo protein synthesis. Flagellin, which is known to trigger the Nlrc4 inflammasome, was required for pore formation as flaA mutant bacteria failed to induce cell permeabilization. Accordingly, transfection of purified flagellin was sufficient to trigger pore formation independent of infection. By using 11 different Legionella species, we found robust pore formation in response to L. micdadei, L. bozemanii, L. gratiana, L. jordanis and L. rubrilucens, and this trait correlated with flagellin expression by these species. Furthermore, we found that Asc and Caspase-11 showed an intermediate phenotype in pore formation, suggesting that other pathways may be involved in this process. We also observed that the pore formation triggered by L. pneumophila differs from the pore induced by ATP. Together, the results suggest that pore formation is neither L. pneumophilaspecific nor the result of membrane damage induced by Dot/Icm activity; instead, it is a highly coordinated host cell response dependent on host Nlrc4 and caspase-1 and on bacterial flagellin and type IV secretion system.

Le récepteur à neurotrophine TRKC a initialement été montré comme induisant la mortcellulaire par apoptose en l’absence de son ligand, NT-3. Cette mort cellulaire a tout d’abordété décrite comme étant importante dans la régulation de la survie neuronale, pendant laformation du système nerveux sympathique. Plus tard, elle a été montrée comme étantimpliquée dans différents types de cancer.Au cours de ma thèse, je me suis concentré sur la caractérisation moléculaire de la cascade designalisation conduisant à l’induction de l’apoptose par TRKC. Afin d’induire l’apoptose, ledomaine intracellulaire de TRKC est clivé par les caspases en deux sites, ce qui entraine lagénération d’un fragment pro-apoptotique, TRKC KF (Killer Fragment). Plusieurs partenairespotentiels de TRKC KF ont été identifiés lors d’un crible double-hybride. Initialement, je mesuis focalisé sur l’un d’eux, COBRA1, un cofacteur de BRCA1.Je montre ici que COBRA1 est requis pour la mort cellulaire induite par TRKC, à la fois invitro et in vivo, dans des neurones primaires. COBRA1 semble stabiliser et accumuler TRKCKF à la mitochondrie, où TRKC KF entraine l’activation de BAX et ensuite le relargage ducytochrome c. En conclusion, il semblerait que la mort cellulaire induite par TRKC estdépendante de la voie apoptotique intrinsèque. J’ai aussi pris part à deux autres projets décrivant le rôle de TRKC comme un suppresseur de tumeur potentiel dans le neuroblastome et le cancer colorectal. Nous avons montré dans leneuroblastome que la fonction pro-apoptotique de TRKC est invalidée par une boucleautocrine de production de NT3, qui peut être ciblée lors d’une approche thérapeutique. Dansle cancer colorectal, nous avons décrit un second mécanisme par lequel les cellules tumoraleséchappent à l’apoptose induite par TrkC. Il s’agit d’une perte de l’expression de TrkC due àune hypermethylation du promoteur. / The neurotrophin receptor TRKC was initially shown to induce apoptosis in settings of lackof its ligand, NT-3. This cell death was described to be important in the regulation of neuronalsurvival during sympathetic nervous system formation and finally it was linked with severaltypes of cancer. During my thesis I focused on the molecular characterization of the signaling cascade leadingto TRKC-induced apoptosis. Importantly, in order to kill, TRKC is double-cleaved bycaspases in its intracellular domain releasing a pro-apoptotic fragment, named TRKC KF(Killer Fragment). Using a yeast two-hybrid screen we identified several potential interactingpartners for TRKC KF. Initially, i focused on COBRA1, a cofactor of BRCA1.I show here that COBRA1 is requisite for TRKC-induced cell death both in vitro and in vivo,on primary neurons. COBRA1 seems to stabilize and accumulate TRKC KF at themitochondria, where TRKC KF induces the activation of BAX and therefore cytochrome crelease. Therefore, it looks that TRKC-induced cell death is dependent on the intrinsicpathway of apoptosis. During my thesis, I also took part in two projects characterizing the role of TRKC as aconditional tumor suppressor in neuroblastoma and colon cancer. We showed that inneuroblastoma tumors the pro-apoptotic function of TRKC is impaired due to an autocrineproduction loop of NT-3, which can be targeted as a therapeutic strategy. In colon cancer, wedescribed another mechanism by which tumor cells evade TRKC-induced apoptosis, morespecifically a loss of TRKC expression due to promoter hypermethylation

Apoptose é uma forma de morte celular extremamente conservada que tem papel primordial no desenvolvimento animal e na homeostasia celular, agindo como mecanismo de controle de qualidade com a função de remover células danificadas, em excesso ou não-funcionais. Este processo tem papel importante no desenvolvimento embrionário pré-implantacional, pois as células embrionárias estão sujeitas aos danos no DNA que podem ativar mecanismos de reparo de DNA ou induzir apoptose, que culmina com a ativação da enzima caspase-3 responsável pela clivagem de vários substratos celulares. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivos determinar a presença da Caspase-3 ativa (+casp-3) e sua influência no desenvolvimento de embriões suínos no estágio de pré-implantação, bem como investigar a detecção de proteínas que atuam no mecanismo de lesão e reparo do DNA. Foram realizados 4 experimentos com oócitos imaturos de fêmeas pré-púberes, obtidos de ovários oriundos de abatedouro, maturados in vitro (MIV) por 44-46 horas. Oócitos em metáfase II (MII) foram ativados partenogeneticamente (AP) com ionomicina e cloreto de estrôncio e cultivados in vitro em PZM3 a 38ºC e 5% CO2 em ar e alta umidade. No primeiro experimento os embriões foram classificados em 4 grupos de acordo com o tempo de clivagem e o número de células: R4 - clivado às 24 horas e com &ge;4 células às 48 horas; R2 - clivado às 24 horas e com 2 ou 3 células às 48 horas; L4 - não clivado às 24 horas e com &ge;4 células às 48 horas; L2 - não clivado às 24 horas e com 2 ou 3 células às 48 horas. Os embriões foram então avaliados no D-6 do CIV para determinação do índice de desenvolvimento até o estágio de blastocisto. Os embriões do grupo R apresentaram maiores índices de blastocisto, R4 - 66,1 (174/263) e R2 - 59,6 (62/104) e maior número de núcleos por blastocisto, R4 - 40,1 e R2 - 37,8, quando comparados ao grupo L, L4 - 15,4 (6/39) e L2-16,8 (13/77); L4-18,5 e L2-18,3 (Qui-quadrado e Tukey-Kramer, respectivamente, P<0,05); entretanto, não houve diferença entre os grupos R4 e R2 e L4 e L2. Para o segundo experimento utilizou-se apenas embriões R e L, classificados às 24hs do início do CIV. Ambos os grupos (R e L) foram destinados à análise de imunocitoquímica para +casp-3 fixados nos D2, D4 e D6, sendo cada um destes dias considerado um sub-experimento e realizado em manipulações diferentes. Foi observada localização citoplasmática da +casp-3 do D2 ao D6 e nuclear a partir do D5 de cultivo. A quantificação relativa da +casp-3 nos grupos R e L de cultivo foi de 2,4 vs 1,4; 1,1 vs 1,0 e 1,1 vs 1,2 para o D2, D4 e D6, respectivamente. Para avaliar a influência da +casp-3 no desenvolvimento de embriões suínos foi realizado o terceiro experimento utilizando o inibidor de caspase z-DEVD-fmk (100uM) durante a MIV, no início (D0 ao D2) ou no final (D4 ao D6) do cultivo. Embriões produzidos sem inibidor foram usados como controle. A presença do inibidor durante a MIV e no final do cultivo não afetou os índices de blastocistos. No entanto, a presença do inibidor durante as primeiras 48 horas de cultivo resultou em maior índice de blastocisto do que o grupo controle, 55,1 (59/107) e 37,5 (39/104) (Qui-quadrado, P<0,05). O último experimento foi realizado para investigar a presença das proteínas de reparo de lesão de DNA, &gamma;H2AX, 53BP1, NSB1 e RAD52, em embriões desenvolvimento R e L. Não foi detectada 53BP1 em embriões suínos AP durante o desenvolvimento inicial. Embriões do grupo L apresentaram maior quantidade de &gamma;H2AX no D-5 quando comparado ao grupo R; entretanto, não houve diferença de marcação para NSB1 e RAD52. Estes dados indicam que o mecanismo de apoptose interfere no desenvolvimento embrionário inicial com efeito positivo do inibidor de caspase, na taxa de blastocisto de embriões suínos AP. Embriões de desenvolvimento L apresentaram um aumento da sinalização às injúrias do DNA, entretanto, a diferenças quanto ao potencial de reparo do DNA lesado em embriões de diferentes potenciais de desenvolvimentos, ainda precisam ser melhor investigadas. / Apoptosis is a highly conserved form of cell death that plays a major role in animal development and cellular homeostasis by acting as a quality control mechanism to remove cells that are damaged, nonfunctional, misplaced or supranumerary. This form of cell death plays a major role on preimplantation embryonic development since embryonic cells are often subject to DNA damage, triggering either DNA damage and repair mechanisms or apoptosis. Once initiated the apoptotic process leads to caspase activation and cleavage of cellular substrates. The aim of the present study was to quantify active Caspase-3 (+casp-3) and to determine the role of this pro-apoptotic enzyme on the development of preimplantation porcine embryos, as well as to investigate the presence and localization of DNA damage and repair proteins. Four experiments were conducted using slaughterhouse immature oocytes collected from pre-pubertal gilt ovaries and in vitro matured (IVM) for 44-46 h. Metaphase II (MII) oocytes were parthenogenetically activated (PA) using ionomycin and strontium chloride and cultured in PZM-3 at 38&ordm;C, 5% CO2 in air and high humidity. In the first study embryos were distributed into 4 groups according to cleavage time and cell number: R4 - cleaved at 24 h with &ge;4-cells at 48 h; R2 - cleaved at 24 h with 2-3 cells at 48 h; L4 - non-cleaved at 24 h with &ge;4-cells at 48 h; L2 - non-cleaved at 24 h with 2-3 cells at 48 h. Group R embryos showed higher blastocyst rates R4-66.1 (174/263) and R2-59.6 (62/104) and more nuclei per blastocyst, R4-40.1 and R2-38.9, when compared to group L L4-15.4 (6/39) and L2-16.8 (13/77); L4-18.5 and L2-18.3 (Chi-square and Tukey-Kramer, P<0.05); however, there were no differences between R4 and R2 or L4 and L2. The second experiment used only early-(R) and late-cleaved embryos (L), classified at 24 h of IVC, fixed at D-2, D-4 and D-6 and then stained for +casp-3 immunofluorescence. In this embryos fixed at D-2, D-4 and D-6 were considered as sub-experiments conducted in different replicates. Active Caspase-3 cytoplasmic signal was detected in cultured embryos from D2 to D6 and nuclear signal was detected from D5 to D6. The relative amount of immunofluorescence signal for +casp-3 for groups R and L at D2, D4 and D6 of culture was 2.4 vs. 1.4; 1.1 vs. 1.0 and 1.1 vs. 1.2, respectively. A third experiment was conducted to evaluate the role of +casp-3 on porcine preimplantation embryos. In this study the Caspase inhibitor Z-DEVD-fmk (100 uM) was supplemented during maturation of porcine oocytes or embryo culture (D0 to D2 or D4 to D6). Addition of the caspase inhibitor during IVM or D4 to D6 of culture did not affect blastocyst rate. However, caspase inhibition from D0 to D2 increased development of porcine embryos to the blastocyst stage [55.1 (59/107) and 37.5 (39/104) for control and Z-DEVD-fmk, respectively; Chi-square, P<0.05). The last experiment investigated the presence of DNA damage and repair proteins &gamma;H2AX, 52BP1, NSB1, and Rad52 in early- and late-cleaved embryos by immunofluorescence. There was no 53BP1 signal in PA porcine embryos at beginning of IVC. Late-cleaved embryos showed higher &gamma;H2AX signal than early-cleaved embryos; however, there was no difference between NSB1 and Rad52 staining between these embryos. In conclusion, apoptosis and DNA damage and repair mechanisms play a role on development of porcine embryos. Active caspase-3 is present in porcine embryos throughout the preimplantation period and inhibition of this enzyme at early stages of in vitro culture can increase blastocyst rate of PA embryos. Moreover, late-cleaved embryos carry higher DNA damage than early-cleaved embryos. Therefore, the relationship between DNA repair mechanism and developmental potential of porcine embryos need to be further investigated.

A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5&micro;M de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p&lt;0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p&lt;0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p&lt;0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p&lt;0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p&lt;0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido. A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5µM de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p<0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p<0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p<0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p<0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p<0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido / Melatonin (MEL) is a lipophilic indolamine with well-known antioxidant properties, by an scavenger action, producing its metabolites such as N1-acetil- N2- formil-5 metoxykinuramin (AFMK) or through a membrane receptor pathway (MT1 and MT2). Although, little is known about its stability and ideal dose on in vitro bovine embryo culture (IVC). In this work, to evaluate if there is any loss of MEL to the IVC systems, we determinate by HPLC, the real concentration of MEL in each system, with and without mineral oil, after the addition of different initial doses of MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), and then analyzed at different incubation period (0, 24, 72 e 144 hours). Then, it was evaluated the action and consumption of MEL in IVC of embryos submitted to induced oxidative stress. The IVC was done in controlled atmosphere (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). At Day 5, embryos over 16 cells were randomly divided in the treatments 0, 25, 50 and 100 ng/ml of MEL, and all received the induction with 5&microM of menadione during 24 hours. After incubation, the media was collected for HPLC analysis (MEL and AFMK) and embryos returned for culture with DM until Day8 (D8). The blastocysts (D8) were designated to Reactive oxygen species (ROS) evaluation, total number of cell (nBLAST), detection of caspase-3 and -7 activity (CASP) and gene expression (GRP78, HSP60 and SOD1). Blastocyst rate (TXBL) was also assessed. Result show that there is no loss of MEL to the oil, or degradation over incubation time. At 50ng/ml there was a consumption of melatonin in the media and formation of AFMK (p&lt;0.05), higher TXBL (45,93 vs. 33,06%, p&lt;0.05) and nBLAST (143 vs. 93,1, p&lt;0.05), lower ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p&lt;0.05) and CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p&lt;0.05), when in contrast with the group without MEL. However, there was no difference in gene expression. In conclusion, melatonin has a stable behavior in IVC system, which allows the use in system with and without oil. Also, at the dose of 50ng/ml has an antioxidant effect, improving quality and production of embryos culture in vitro at induced oxidative stress

A apoptose é um processo fisiológico que desempenha papel crucial no desenvolvimento, remodelagem e senescência teciduais, inclusive placentários. A placenta, enquanto órgão temporário, atravessa todas estas fases em aproximadamente 10 meses, na espécie bubalina. O crescimento da placenta e a nutrição fetal requerem altas taxas de renovação e diferenciação celulares, e a maturação placentária está relacionada à redução das células epiteliais das criptas carunculares maternas. As modificações morfológicas celulares decorrentes do processo de apoptose são fruto de eventos bioquímicos complexos promovidos por uma família de cisteína-proteases, as caspases, especialmente as caspases executoras, dentre as quais se destaca a caspase-3, capaz de degradar várias proteínas citoplasmáticas e nucleares. Durante a apoptose, ocorre a clivagem caspase-mediada da citoqueratina 18, proteína dos filamentos intermediários do citoesqueleto, e com isso a formação de um neoepítopo específico. Por meio de métodos imunoistoquímicos pode-se detectar a presença tanto deste neoepítopo, quanto da forma ativa da caspase-3, o que demonstra que a célula entrou em estágio irreversível de morte celular. Morfologicamente, algumas das principais alterações celulares observadas são condensação da cromatina, a degradação e fragmentação do DNA, a formação de ?blebs? (pregas/bolhas) na membrana plasmática, além da fragmentação celular em corpúsculos apoptóticos, os quais podem ser identificados em cortes corados pelo método de rotina hematoxilina e eosina, utilizando-se microscópio de imunofluorescência, devido à eosinofluorescência das células em apoptose. Assim como a apoptose, a proliferação celular participa no equilíbrio homeostático tissular. Neste estudo, pretende-se avaliar a ocorrência de apoptose e proliferação celular em 42 placentônios de diferentes animais em diversas fases gestacionais (2-10 meses de gestação), em tecidos fixados em 4% paraformoldeído, incluídos em paraplast e submetidos à imunoistoquímica (anticorpo monoclonal M30 CytoDeath; Caspase-3 Clivada; PCNA - antígeno de marcação nuclear), sendo também avaliada a presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes nas amostras. Utilizando-se M30 e caspase-3 clivada pudemos constatar a ocorrência de apoptose nos epitélios uterino e trofoblástico, em células gigantes placentárias e, ocasionalmente, em células mesenquimais fetais, do estroma uterino e endoteliais. Não houve diferenças significativas (p<0.05) entre os métodos adotados, mas sim entre os estágios gestacionais. Para o M30, houve um aumento significante da apoptose do primeiro grupo (2-4.5 meses) em relação ao quarto grupo (9-10 meses); no caso da Caspase-3 Clivada houve um aumento estatísticamente significante (p<0.05) entre os três primeiros grupos (2-4.5; 5-6.5; e 7-8.5 meses de gestação, respectivamente) de animais em relação ao quarto grupo. Para o PCNA, ocorreu uma diminuição no número de células em proliferação dos dois primeiros grupos de animais em relação ao quarto grupo (p<0.05). A presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes pôde ser observada em todas as amostras. Nossos resultados sugerem haver uma relação entre a ocorrência de apoptose e a maturação, senescência e liberação placentárias em ruminantes. / Apoptosis is a physiological process that plays a crucial role in the development, remodeling and aging of the placenta. The placenta is a temporary organ that undergoes growth and development, followed by senescence and death in 10 months in the buffalo species. Placental growth and fetal nutrition require high rates of cellular turnover and differentiation, and placental maturation is correlated to the reduction of the number of epithelial cells of the maternal crypts. The morphological changes of the apoptotic cells are product of complex variety of biochemical events promoted by a family of cystein-proteases, the caspases, mainly the effectors caspases, and among them the caspase-3, which is able to degrade cytoplasmic and nuclear proteins. During apoptosis, the caspase-mediated cleavage of cytokeratin 18, which is one of the first intermediate filament proteins of the cytoskeleton, leads to the formation of a specific neo-epitope. It is possible to detect the presence of this neo-epitope by immunohistochemistry, as well as the active form of caspase-3, showing that the cell has entered an irreversible stage of cell death. Morphologically, some of the main observed cellular alterations are condensation of the chromatin, degradation and spalling of the DNA, blebbing of the cell membrane and the formation of apoptotic bodies. These bodies can be identified in slides stained by hematoxilin and eosin with a fluorescent microscope, due to the eosinofluorescent property of the apoptotic cells. Like apoptosis, cellular proliferation also contributes to the tissue homeostasis. In the present study, we intend to evaluate the occurrence of apoptosis and cellular proliferation in 42 placentomes, collected from different animals in several gestacional phases (2-10 months of gestation), fixed in 4% paraformaldehyde, processed for embedding in paraplast and cut in sections, through immunohistochemistry (monoclonal antibody M30 CytoDeath; Cleaved Caspase-3; PCNA - antigen of nuclear proliferation). The presence of eosinofluorescent apoptotic bodies were also studied in the samples. M30 and Cleaved Caspase-3 allowed to show the occurrence of apoptosis in the uterine and trophoblastic ephitelium, in placental giant cells and, occasionally, in the fetal mesenquimal cells, in the uterine stroma and endothelium cells. There were no significant differences (p<0.05) between the adopted methods, although there were differences between the gestational phases studied. For M30, there was an increase of the number of apoptotic cells (p<0.05) from the first group (2-4.5 months) in relation to the fourth group of animals (9-10 months); for the Cleaved Caspase-3 there was a statistical significant increase (p<0.05) between the first three groups of animals (2-4.5; 5-6.5; and 7-8.5 months of gestation, respectively) and the last one. In relation to the PCNA, a decrease in the number of proliferative cells occurred from the first two groups of animals to the fourth group (p<0.05). The occurrence of eosinofluorescent apoptotic bodies was observed in all the samples studied . Our data suggest a relationship between apoptosis and the maturation, senescence and release of the ruminant placenta.