Muito se tem investido em pesquisa na compreensão dos processos e fenômenos envolvidos nas diversas fases da reparação tissular e, principalmente, no desenvolvimento de recursos e tecnologias com o objetivo de favorecer os avanços no tratamento de feridas. Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar os efeitos biológicos da associação células-tronco mesenquimais (CTMs) e plasma rico em plaquetas (PRP) como adjuvantes da cicatrização cutânea de feridas padronizadas em coelhos. Foram utilizados 37 coelhos Nova Zelândia, dentre os quais, 36 foram distribuídos em seis grupos: grupo controle (GC), grupo células-tronco mesenquimais (GCTM), grupo plasma rico em plaquetas na forma líquida (GPRPLIQ), grupo plasma rico em plaquetas na forma de gel (GPRPGEL), grupo associação células-tronco mesenquimais e plasma rico em plaquetas na forma liquida (GCTM+PRPLIQ), grupo associação células-tronco mesenquimais e plasma rico em plaquetas na forma de gel (GCTM+PRPGEL). Após indução de lesões cutâneas agudas e padronizadas, os animais receberam o tratamento de acordo com o grupo que compunham. Macroscopicamente, a cada dois dias, foram analisadas as medidas das lesões e calculadas a área e a taxa de cicatrização das mesmas. Amostras para análise microscópica foram coletadas em sete e 14 dias e avaliadas quanto à presença de células inflamatórias, angiogênese, formação de fibrose colagênica, proliferação epitelial e fibroblástica. Com base nos resultados obtidos foi possível concluir que: 1) a associação CTM e PRP em suas frações terapêuticas (CTM+PRPGEL e CTM+PRPLIQ) não acelerou o processo de cicatrização de feridas cutâneas agudas, na avaliação morfométrica aos 14 dias de pós-operatório; 2) a aplicação local da CTM e das frações de PRP quando utilizadas de maneira isolada não conseguiram acelerar o tempo necessário ao processo cicatricial na avaliação morfométrica aos 14 dias de pósoperatório; 3) a utilização do PRP na sua forma líquida obteve índices de epitelização menores em relação ao controle em avaliações histopatológicas aos 14 dias de pósoperatório; 4) à exceção do ocorrido com o grupo PRP líquido, os demais tratamentos não alteraram significativamente as fases inflamatória, proliferativa e inicial do remodelamento, segundo dados histopatológicos; 5) a terapia com as células-tronco mesenquimais promoveu cicatrizes esteticamente melhores na avaliação clínica, especialmente aos 14 dias de observação. Sugere-se a necessidade de novos estudos e a utilização de outras ferramentas diagnósticas para melhores subsídios de interpretação sobre os resultados encontrados. / Much has been invested on research regarding comprehension of the processes and phenomena that are involved in several stages of tissue repairing and mainly on resources and technologies development in order to support advances on wound healing. This study has been performed in order to evaluate the biological effects of mesenchymal stem cells (CTM) and platelet rich plasma (PRP) association as adjuvants on skin healing of standardized wounds in rabbits. Thirty-seven New Zealand rabbits have been used and, among these animals, 36 were allocated into six groups: control group (GC), mesenchymal stem cells group (GCTM), liquid platelet rich plasma group (GPRPLIQ), gel platelet rich plasma group (GPRPGEL), mesenchymal stem cells associated with liquid platelet rich plasma group (GCTM+PRPLIQ) and mesenchymal stem cells associated with gel platelet rich plasma group (GCTM+PRPGEL). After the induction of acute and standardized skin wounds, animals received the treatment according to the group they belonged to. Macroscopically, every two days, wounds measures were taken to calculate their area and healing rate. Samples for microscopically analysis were collected on day 7 and on day 14 and were evaluated for the presence of inflammatory cells, angiogenesis, collagen fibrosis formation, epithelial and fibroblastical proliferation. Basing on the results it was concluded that: 1) CTM and PRP in its two therapeutic fractions association (GCTM+PRPLIQ and GCTM+PRPGEL) did not accelerate the healing process of acute skin wounds, on morphometric assessment at 14 days after surgery; 2) local injection of CTM and PRP fractions when isolated did not accelerate the time required for wound healing on morphometric assessment at 14 days after surgery; 3) PRP application on its liquid fraction showed lower levels of epithelization related to control on histopathological evaluation at 14 days after surgery; 4) except GPRPLIQ, other treatments did not alter significantly inflammatory, proliferative nor initial remodeling phases, based on histopathological data; 5) CTM therapy promoted aesthetically better scars on clinical evaluation, especially at 14 days of observation. It is suggested the requirement of further studies and use of different diagnostic tools to obtain better interpretation of the achieved results.

Muito se tem investido em pesquisa na compreensão dos processos e fenômenos envolvidos nas diversas fases da reparação tissular e, principalmente, no desenvolvimento de recursos e tecnologias com o objetivo de favorecer os avanços no tratamento de feridas. Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar os efeitos biológicos da associação células-tronco mesenquimais (CTMs) e plasma rico em plaquetas (PRP) como adjuvantes da cicatrização cutânea de feridas padronizadas em coelhos. Foram utilizados 37 coelhos Nova Zelândia, dentre os quais, 36 foram distribuídos em seis grupos: grupo controle (GC), grupo células-tronco mesenquimais (GCTM), grupo plasma rico em plaquetas na forma líquida (GPRPLIQ), grupo plasma rico em plaquetas na forma de gel (GPRPGEL), grupo associação células-tronco mesenquimais e plasma rico em plaquetas na forma liquida (GCTM+PRPLIQ), grupo associação células-tronco mesenquimais e plasma rico em plaquetas na forma de gel (GCTM+PRPGEL). Após indução de lesões cutâneas agudas e padronizadas, os animais receberam o tratamento de acordo com o grupo que compunham. Macroscopicamente, a cada dois dias, foram analisadas as medidas das lesões e calculadas a área e a taxa de cicatrização das mesmas. Amostras para análise microscópica foram coletadas em sete e 14 dias e avaliadas quanto à presença de células inflamatórias, angiogênese, formação de fibrose colagênica, proliferação epitelial e fibroblástica. Com base nos resultados obtidos foi possível concluir que: 1) a associação CTM e PRP em suas frações terapêuticas (CTM+PRPGEL e CTM+PRPLIQ) não acelerou o processo de cicatrização de feridas cutâneas agudas, na avaliação morfométrica aos 14 dias de pós-operatório; 2) a aplicação local da CTM e das frações de PRP quando utilizadas de maneira isolada não conseguiram acelerar o tempo necessário ao processo cicatricial na avaliação morfométrica aos 14 dias de pósoperatório; 3) a utilização do PRP na sua forma líquida obteve índices de epitelização menores em relação ao controle em avaliações histopatológicas aos 14 dias de pósoperatório; 4) à exceção do ocorrido com o grupo PRP líquido, os demais tratamentos não alteraram significativamente as fases inflamatória, proliferativa e inicial do remodelamento, segundo dados histopatológicos; 5) a terapia com as células-tronco mesenquimais promoveu cicatrizes esteticamente melhores na avaliação clínica, especialmente aos 14 dias de observação. Sugere-se a necessidade de novos estudos e a utilização de outras ferramentas diagnósticas para melhores subsídios de interpretação sobre os resultados encontrados. / Much has been invested on research regarding comprehension of the processes and phenomena that are involved in several stages of tissue repairing and mainly on resources and technologies development in order to support advances on wound healing. This study has been performed in order to evaluate the biological effects of mesenchymal stem cells (CTM) and platelet rich plasma (PRP) association as adjuvants on skin healing of standardized wounds in rabbits. Thirty-seven New Zealand rabbits have been used and, among these animals, 36 were allocated into six groups: control group (GC), mesenchymal stem cells group (GCTM), liquid platelet rich plasma group (GPRPLIQ), gel platelet rich plasma group (GPRPGEL), mesenchymal stem cells associated with liquid platelet rich plasma group (GCTM+PRPLIQ) and mesenchymal stem cells associated with gel platelet rich plasma group (GCTM+PRPGEL). After the induction of acute and standardized skin wounds, animals received the treatment according to the group they belonged to. Macroscopically, every two days, wounds measures were taken to calculate their area and healing rate. Samples for microscopically analysis were collected on day 7 and on day 14 and were evaluated for the presence of inflammatory cells, angiogenesis, collagen fibrosis formation, epithelial and fibroblastical proliferation. Basing on the results it was concluded that: 1) CTM and PRP in its two therapeutic fractions association (GCTM+PRPLIQ and GCTM+PRPGEL) did not accelerate the healing process of acute skin wounds, on morphometric assessment at 14 days after surgery; 2) local injection of CTM and PRP fractions when isolated did not accelerate the time required for wound healing on morphometric assessment at 14 days after surgery; 3) PRP application on its liquid fraction showed lower levels of epithelization related to control on histopathological evaluation at 14 days after surgery; 4) except GPRPLIQ, other treatments did not alter significantly inflammatory, proliferative nor initial remodeling phases, based on histopathological data; 5) CTM therapy promoted aesthetically better scars on clinical evaluation, especially at 14 days of observation. It is suggested the requirement of further studies and use of different diagnostic tools to obtain better interpretation of the achieved results.

Submitted by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-12-12T19:36:47Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação-Adriana Sebba Barroso de Souza Marques.pdf: 867953 bytes, checksum: 6484d53b38c78accaea85498548eb55f (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-12-16T09:23:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação-Adriana Sebba Barroso de Souza Marques.pdf: 867953 bytes, checksum: 6484d53b38c78accaea85498548eb55f (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-16T09:23:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação-Adriana Sebba Barroso de Souza Marques.pdf: 867953 bytes, checksum: 6484d53b38c78accaea85498548eb55f (MD5) Previous issue date: 2013-12-20 / Background: Treatment with stem cells in various cardiomyopathies may be related to the increase in arrhythmias. Objective: To determine whether intracoronary injection of stem cells in patients with Chagas cardiomyopathy is associated with increased frequency of ventricular arrhythmias, compared to the control group. Methods: A retrospective cohort study that evaluatedt he medical records of 60 patients Who participated previously on sectional study.The following data was collected : age, sex , and drugs used and Holter variables that demonstrated the presence of arrhythmias.Holter was performed in four stages: randomization , 2 , 6 and 12 months segments. The control group (CG) received medical treatment and intracoronary injection of placebo and the study group (SG) drug treatment and autologous stem cell implant. Results: There was no difference between EG and CG analyzing the criteria of arrhythmia. In the intra-group analysis, significant difference was found between the Holter tests study group in the variable of total ventricular ectopic compared with baseline, being between H1 and H2 p=0.014, between H1 and H3 p=0.004, between H1and H4 p=0.014. The variable non-sustained ventricular tachycardia between H1 and H3 with p = 0.036. Conclusion: The intracoronary injection of stem cells did not increase the incidence of ventricular arrhythmias in patients with Chagas cardiomopatia compared to the control group. / Fundamento: O tratamento com células-tronco nas diversas cardiomiopatias pode estar relacionado ao aumento nas arritmias. Objetivo: Determinar se a injeção intracoronária de células-tronco em portadores de cardiomiopatia chagásica está associada ao aumento da frequência de arritmias ventriculares, comparado ao grupo controle. Método: Estudo de coorte retrospectivo que avaliou o prontuário de 60 pacientes que participaram de estudo transversal anterior. Foram coletados os seguintes dados: idade, sexo, medicamentos utilizados e variáveis do Holter que demonstraram presença de arritmia. O Holter foi realizado em quatro momentos: randomização, 2, 6 e 12 meses de seguimento. O grupo controle (GC) recebeu tratamento medicamentoso e injeção intracoronária de placebo e o grupo estudo (GE) tratamento medicamentoso e implante autólogo de células tronco. Resultados: Não houve diferença entre o GE e o GC nos critérios de arritmia analisados. Na analise intra-grupo foi encontrado diferença com significância entre os exames de HOLTER do grupo estudo na variável total de extrassístoles ventriculares comparado com o basal, sendo entre H1 e H2 p=0.014, entre H1 e o H3 p=0.004, entre H1 e H4 p=0.014. A variável taquicardia ventricular não sustentada entre H1 e H3 com p=0.036. Conclusão: A injeção intracoronária de células-tronco não aumentou a incidência de arritmias ventriculares em pacientes com cardiomopatia chagásica comparada ao grupo controle.

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-30T11:13:52Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Antônio Dionísio Feitosa Noronha Filho - 2013.pdf: 1195605 bytes, checksum: 6407e61f5c39652f43701aff78788bfd (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-30T12:42:48Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Antônio Dionísio Feitosa Noronha Filho - 2013.pdf: 1195605 bytes, checksum: 6407e61f5c39652f43701aff78788bfd (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-30T12:42:48Z (GMT). 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Innovative treatments have been discussed, but are not always economically viable, however, in last years in Veterinary Medicine has increased the interest on the possibility of applying cell therapy in the treatment of diseases related to the locomotor systems, including digital diseases. In the equine, it has been studied its use in the repair of tendineous, articular and osseous lesions, and the perspective of application in other important diseases like laminitis. Considering the importance of digital diseases, especially laminitis, for cattle, cell therapy can represent an additional option for treatment. This study evaluated the development of digital lesions in cattle intensively managed and its response to the treatment with bone marrow mononuclear cells. Were used 15 animals, male, cross-bred (Bos taurus X Bos indicus), healthy, aging about 12 months and with average weight of151,6 ± 24,65 kg, divided in two groups (GT, n=7, GC, n=8). The study was developed in three stages divided in evaluation moments. On first stage, on second month of confinement, after adjustment of management over concrete floor and feeding of corn silage and concentrate, hooves were trimmed and started evaluation of digital disease wich extended to the tenth month. At this time, were observed digital lesions that developed in the period, their influence over behavior and was conducted radiographic examinations trying to establish relationship between external and internal lesions of digits. After ten months of study all animals had its hooves trimmed and all digital lesions, in decorrence of management, were surgically treated. At this time, started last stage in wich animals received cell therapy. To obtain material needed for the protocol, were harvested samples of bone marrow from animals belonging to treatment group (GT). After this, mononuclear cells were isolated and samples were injected at jugular vein. In the protocol for bone marrow harvest and isolation of mononuclear cells was used Ficoll-Paque. On animals from control group (GC), their lesions were treated during hoof trimming, but all anials were evaluated at twelfth month. To certify the effect of cell therapy, besides clinical examination, identification of possible recidivance or new lesions, were done histological examination for occurrence of hyperemia, hemorrhages or edema on dermis, presence of white blood cells inside or outside vessels and necrosis of basal cells from epidermis, and radiographic examination. On direct inspection were observed expressive occurrence of digital lesions like heel horn erosion, haematoma and erosions of sole and white line disease, however with no difference between groups. Major changes in behavior observed along time were decrease in eating time and increase in times lying down and in leisure. Radiographic evaluation didn´t show signs of distal phalanx rotation suggesting external alterations may not be related to internal alterations. Protocols for bone marrow aspiration and for cell isolation using Ficoll-Paque were effective, resulting in obtainance of mononuclear cells with satisfatory viability. But, since it wasn´t observed significative differences between groups related to digital lesions, histological and radiographical examinations, the reoccurrence and appearance of new lesions after cell therapy cannot be related to this treatment, because seem to be more related to management conditions. It can be concluded that applying of bone marrow derived mononuclear cells at jugular vein didn´t show benefits as auxiliary treatment of digital lesions in cattle. The control of risk factors and site of cell application seem to explain the apparent failure of the therapeutic protocol used. / As doenças digitais causam preocupação ao setor produtivo e despertam grande interesse nos técnicos ligados à bovinocultura em função do impacto econômico e do difícil controle. Os prejuízos decorrem de queda no desempenho produtivo, reprodutivo, tratamento oneroso e em alguns casos descarte prematuro de animais de alto mérito genético. Além disso, ameaçam seriamente o bem estar animal. Essas doenças assumem características distintas nos diversos sistemas de produção, o que em alguns casos demandam soluções específicas e tratamentos que atendam a realidade do criatório. Tratamentos inovadores têm sido discutidos, mas nem sempre são viáveis economicamente. Contudo, nos últimos anos, na Medicina Veterinária cresce o interesse na possibilidade de se empregar a terapia celular, que poderia ser aplicada como auxiliar no tratamento de várias enfermidades do aparelho locomotor, incluindo as enfermidades digitais. Em equinos, já se tem investigado seu emprego no reparo de lesões tendíneas, articulares e ósseas, havendo ainda a perspectiva de aplicação em outras doenças importantes como a laminite. Portanto, considerando a importância que as doenças digitais, em especial a laminite, assumem na espécie bovina, a terapia celular pode representar uma ferramenta adicional no tratamento. Esta pesquisa objetivou avaliar o desenvolvimento de lesões digitais em bovinos manejados intensivamente e sua resposta ao tratamento com células mononucleares da medula óssea. Foram empregados 15 bovinos machos, mestiços (Bos taurus X Bos indicus), hígidos com idade inicial aproximada de 12 meses e peso corporal médio de 151,6 ± 24,65 kg, alocados em dois grupos (Grupo tratamento, GT, n=7; Grupo controle, GC, n=8). O estudo foi desenvolvido em três etapas divididos em momentos de avaliação. Na primeira etapa, no 2o mês de confinamento após ajustar o manejo em piso de concreto e a alimentação a base de silagem de milho e concentrado, realizou-se ajuste nas medidas digitais dos animais e iniciou-se o acompanhamento para avaliar a ocorrência de doenças digitais, que se estendeu até o décimo mês. Nesse período, foram realizadas avaliações para diagnosticar as enfermidades que eventualmente surgissem. Estudou-se a influência delas sobre o comportamento diário dos bovinos e procedeu-se a análise macroscópica das lesões digitais e a avaliação radiográfica para se tentar estabelecer uma relação entre as lesões externas e internas dos dígitos. Após dez meses de confinamento, todos os animais tiveram as medidas digitais novamente ajustadas e as enfermidades digitais que surgiram na etapa anterior, em decorrência do manejo, foram tratadas cirurgicamente. Nesse momento iniciou-se a ultima etapa na qual os animais receberam a terapia celular. Para se obter o material necessário que o protocolo exigia colheu-se medula óssea dos bovinos pertencentes ao grupo tratamento (GT), na sequência, as células mononucleares foram isoladas e uma amostra destas foram aplicadas pela veia jugular em cada animal. No protocolo de colheita da medula óssea e isolamento celular empregou-se o Ficoll-Paque®. O grupo controle (GC) foi apenas submetido ao tratamento das lesões e tiveram as medidas dos cascos ajustadas, mas os bovinos de ambos os grupos foram reavaliados ao final do 12o mês do estudo. Para certificar o efeito da terapia celular, além do exame clínico, identificação de possível recrudescimento ou surgimento de novas lesões, realizou-se exame radiográfico, avaliação histológica da região coronária para avaliar presença de hiperemia, hemorragia ou edema da derme, presença de células brancas dentro ou fora dos vasos e necrose de células basais da epiderme. Na avaliação macroscópica foi observada ocorrência expressiva de lesões digitais como erosão de talão, hematoma e erosão de sola e lesão de linha branca, porém, sem diferenças entre grupos. As principais alterações de comportamento observadas ao longo das avaliações foram a redução no tempo de alimentação e aumento nos tempos em ócio e em decúbito, mas, sem diferenças entre grupos tratamento e controle. A avaliação radiográfica não mostrou ter ocorrido a rotação da falange distal indicando que as lesões externas podem não ter relação com as alterações internas. Os resultados obtidos indicam que o protocolo de aspiração de medula óssea e de isolamento celular usando Ficoll-Paque® foi eficaz, resultando na obtenção de células mononucleares com rendimento e viabilidade satisfatórios. Mas, como não foram observadas diferenças significativas entre grupos, tanto com relação as enfermidades como em relação aos resultados histológicos e radiográficos as recidivas ou o aparecimento de novas lesões após a terapia celular não podem ser imputadas a esse tratamento, pois parecem ter relação com o manejo. Conclui-se que a aplicação de células mononucleares da medula óssea pela veia jugular não apresentou benefícios no tratamento auxiliar de lesões digitais em bovinos, sendo que aspectos relacionados ao controle dos fatores de risco e local de aplicação das células parecem explicar a aparente falta de sucesso do protocolo terapêutico empregado.

Introdução:O papel das biopsias do miocárdio, tem tido relativa importância em cardiologia, sendo método diagnóstico fundamental em um pequeno número de patologias do coração como na doença por depósito de glicogênio, amiloidose, hemocromatose e nas miocardites. Ao longo dos anos, o desenvolvimento de diferentes procedimentos que possibilitam a obtenção de fragmentos do tecido cardíaco passou por diversos estágios e evoluída miocardiectomia a céu-aberto aos cateteres endovasculares, passando por procedimentos com agulhas de punção. Estes apesar de estar em desuso atualmente, têm particular importância por proporcional acesso ao miocárdio e a cavidade ventricular esquerda. Paralelamente, a terapia celular tem sido utilizada na recuperação e preservação da função cardíaca em coronariopatia crônica e na doença de chagas. As punções biópsias do coração ressurgem como possível método alternativo de acesso ao miocárdio e implante de material biológico para terapia celular. Objetivos:apresentar instrumento de punção, biopsia e injeção intramiocárdica de material biológico, padronizar a técnica e atestar a segurança do método.A adaptação consiste em um sistema de escarificação do miocárdio para permitir melhor fixação de células-tronco. O objetivo do presente trabalho visa apenas o desenvolvimento da agulha e testar histologicamente a qualidade das biópsias. Método: O instrumento para punção e injeção de material biológico é composto por uma agulha exterior (1), chamado de acoplamento de infusão, o qual contém na sua extremidade uma ponta romba (2) e vários orifícios de 0,5 mm de diâmetro (3). Internamente, está equipado com uma agulha com um mandril fechado, que quando introduzidas no exterior, pode ser mobilizada para dentro para encher os orifícios laterais ocluindo ou soltá-los. O procedimento para a produção de microlesões micro é feito através da troca do mandril de ponta romba (durante o procedimento) por um mandril escova (4), provido de microcerdas que são estruturalmente concebidas para preencher os orifícios com a exteriorização das pequenas cerdas (5). O instrumento está equipado com um mecanismo de bloqueio, que permite a sua mobilização perfeita como uma única unidade de microlesões ou, ainda pode ser utilizado somente como uma agulha externa, de modo que pode tornar-se um instrumento de injeção biológica. Resultado: A técnica já foi testada em modelo suíno vivo mostrando sua viabilidade e segurança. Como resultados são apresentados aspectos macroscópicos e microscópicos do coração (Corantes Hematoxilina eosina, Tricrômico Masson e Azul de Evans).Conclusão: No tocante a sua função o novo Instrumento de punção/infusão tem por característica principal o fato de ser multifuncional. Permite ao operador acessar a cavidade ventricular esquerda por via transtorácica sem risco de lesão (perfuração), das artérias coronárias. Permite penetrar o miocárdio sem laceração das fibras musculares pela divulsionamento das mesmas e escarificar o miocárdio. gerando micro-lesões musculares por intermédio de seu mandril com cerdas, promovendo a \"inflamação benéfica ao processo de transplante celular. / Introduction: The role of myocardial biopsy has had relative importance in cardiology, being fundamental diagnostic method in a small number of diseases of the heart as in glycogen deposit disease, amyloidosis, hemochromatosis and in miocardites. Over the years, the development of different procedures that allow obtaining cardiac tissue fragments went through several stages and evolved from open miocardiectomy to endovascular catheters, going through procedures with puncture needles. These despite being in disuse today, have particular importance for offering access to myocardium and left ventricular cavity. At the same time, the Cellular therapy has been used in the recovery and preservation of cardiac function in chronic coronary artery disease and Chagas disease. The puncture-heart biopsies to re-emerge as a possible alternative method of access to the myocardium and implantable biomaterial for cell therapy. Objectives: Objectives: to present puncture tool, biopsy and intramyocardial injection of biological material, standardizing the technical and certify the safety of the method. The adaptation allows in a myocardial scarification system for making possible a better stem cells fixation. The objective of this study covers only the development of needle and test, macroscopically and histologically the quality of biopsies. Methods: The instrument for puncturing and injection of biological material is composed of an external needle (1), called coupling infusion, which contains at its end a blunt tip (2) and multiple 0.5 mm diameter holes (3). Internally it is fitted with a blunt mandrill needle, which when introduced into the external, can be mobilized inside to fill the lateral holes occluding or releasing them. The procedure for producing micro lesions is done by exchanging the blunt mandrill (during the procedure) for a brush-mandrill (4), provided with micro bristles that are structurally designed to fill the holes with small exteriorization of bristles (5). The instrument is equipped with a locking mechanism, which allows its perfect mobilization as one single unit for micro lesions or it can be used only as an external needle so it can become a biological injection instrument.Result: The technique has been tested in vivo pig model showing its feasibility and safety. The results are presented through macroscopic and microscopic aspects of the heart (dyes hematoxylin eosin, Masson Masson and Evans blue).Conclusion: Regarding its function the new instrument is to be multifunctional main feature. It allows the operator to access the left ventricular cavity through transthoracic without risk of injury (perforation) of the coronary arteries. It allows penetrate the myocardial laceration of the muscle fibers by divulsionamento of them and rip the myocardium. generating muscle micro-injuries through its arbor with bristles, promoting \"inflammation beneficial to the cell transplant process.Key words: heart biopsy puncture, infusion of stem cells in the heart.

A terapia celular com células-tronco (CT) surgiu nos últimos anos como uma esperança para o tratamento de doenças, sem tratamento efetivo, como a osteoartrite (OA) em joelho. Nesse trabalho utilizamos células-tronco imaturas de polpa dentária humana (CTPD) cultivadas ou não em associação com biomateriais para o tratamento de lesões osteoarticulares em joelhos de ovinos. As CTPD humanas foram transduzidas com o gene repórter, EGFP, facilitando o monitoramento das mesmas in vitro e in vivo, após o implante na articulação femorotibiopatelar de ovinos. A capacidade de adesão e acomodação das células de polpa dentária no biomaterial foi observada in vitro 24 horas e um mês após sua aplicação no mesmo, sendo a viabilidade celular semelhante em ambos os períodos, porém com uma maior dispersão celular no período mais longo, segundo as análises realizadas por técnicas de microscopia eletrônica de varredura e histologia. Ainda para a realização das análises histológicas, foram realizadas técnicas para padronizar os métodos de descalcificação e inclusão do tecido ósseo-articular, prévio aos cortes. Exames radiográficos, ultrassonográficos e artroscópicos foram feitos para acompanhar a evolução dos tratamentos. Os resultados revelaram que as CTPD humanas aderem bem ao biomaterial e que em associação possuem uma excelente capacidade aparente de reconstituição do tecido lesado. Com a realização deste trabalho, concluímos que o protocolo de terapia utilizado é um bom modelo para o estudo de OA e serve para futuras aplicações clínicas. / Cell therapy with stem cells (CT) has emerged in recent years as a hope for the treatment of diseases without effective treatment, such as osteoarthritis (OA) in knee. In this work we use stem cells from immature human dental pulp (hSCIDP) in association or not with biomaterials for the treatment of osteoarticular lesions in sheep´s kneef. The human hSCIDP were transduced with the reporter gene EGFP, thus making easier monitoring these in vitro and in vivo after implantation in sheep´s femorotibiopatelar joint. The capacity of adhesion and accommodation of dental pulp cells in the biomaterial in vitro was observed 24 h and one month after its application, resulting in similar cell viability in both periods, but with a greater cell dispersion in the longer, period, according to analysis performed by scanning electron microscopy and histology. Moreover, some histological techiniques were performed to standardize the methods for inclusion and decalcification of bone tissue joints. Radiographic, ultrasonographic and arthroscopic analyses were made to monitor the progress of treatment. The results revealed that the human hSCIDP adhere well to the biomaterial and have an excellent apparent reconstitution of damaged tissue. With this work, we conclude that the therapy protocol used is a good model for studying OA and useful for future clinical applications.

Linfedema é uma condição crônica que predispõe a uma substancial morbidade e perda da função do órgão ou tecido afetado. Ele não tem cura e em longo prazo leva a dificuldades físicas e psicológicas ao paciente, tornando-se um grande desafio para os médicos. Infelizmente, é triste constatar que aproximadamente 400 anos após a descoberta dos vasos linfáticos, não há cura para o linfedema, sendo o tratamento baseado em drenagem linfática manual através de massagem e limitadas intervenções de fisioterapia, ambas visando redução do volume de edema, o que fornece alívio parcial para os indivíduos afetados que não garantem o desaparecimento da fibrose, aparentemente irreversível. Por isso, estudos que proporcionem novas intervenções, como a terapia celular com células-tronco, são de grande interesse. Neste trabalho tivemos como objetivo realizar terapia celular de linfedema murino utilizando células-tronco da membrana amniótica. Em um primeiro momento, a obtenção do modelo de insuficiência linfática foi feita com base em Tabibiazar et al., 2006 onde uma microablação de 2 mm em toda a circunferência foi feita na cauda do animal. Entretanto, após 30 dias de indução uma regressão espontânea foi observada inviabilizando a utilização deste modelo. Após vasta pesquisa na literatura outro modelo de indução de linfedema (Shimizu et al., 2012) foi encontrado, onde os autores fazem uma microablação cirúrgica, mantendo um flap de 4 mm na região ventral. Neste trabalho os autores obtiveram um linfedema estável por no mínimo 30 dias. Com base nestes achados, o modelo de linfedema murino induzido baseado em Shimizu foi realizado e após a comprovação desta estabilidade por 60 dias, esse modelo foi utilizado para indução do linfedema. Após esta caracterização, os animais que tiveram o linfedema induzido foram submetidos a terapia celular utilizando 0,5X106 células-tronco da membrana amniótica humana (MAh) ou saco vitelino canino (SVc) no momento da indução. Animais sem lesão, com lesão (SHAM) e tratados apenas com solução fisiológica (placebo) também foram analisados. O monitoramento do linfedema na cauda foi feito através de acompanhamento clínico, registro fotográfico e mensura do diâmetro caudal a cada 2-3 dias. Ao final do estudo, os animais foram eutanasiados, tiveram suas caudas removidas e foram submetidos a avaliação dos efeitos terapêuticos da terapia celular através de análise do exsudato, análises histológicas (HE, picrossírius) e imuno-histoquímicas. A histológica obtida por coloração de HE além de apresentar o melhor resultado quando comparado com as demais técnicas, possibilitou avaliar as alterações patológicas pertinentes de cada amostra, revelando efeitos benéficos da terapia quando comparados com SHAM e placebo. Já, a coloração Picrossírius permitiu visualizar além das alterações estruturais, a inversão da predominância da expressão de colágeno do tipo I, por colágeno do tipo III nos tecidos estruturalmente comprometidos. O resultado do conjunto de análises das amostras apresentou o padrão linfedematoso esperado para os grupos SHAM e placebo, porém também mostrou um processo inflamatório muito menor e mais curto nos grupos MAh, e SVc, permitindo sugerir que a terapia celular causou um impacto favorável e os animais apresentaram resultados muito próximos aos padrões exibidos pelo grupo controle. / Lymphedema is a chronic condition, which predisposes to substantial morbidity and loss of function of the affected organ or tissue. It has no cure and, in the long term, leads patients to physical and psychological problems, which is a major challenge for doctors. Unfortunately, it is sad to realize that, approximately 400 years after the discovery of the lymphatic vessels, there is no cure for lymphedema. The treatment is based on manual lymphatic drainage through massage and limited physiotherapy interventions. Both techniques aim at reducing the volume of the edema, which provides partial relief for affected individuals, but do not guarantee the disappearance of the fibrosis, which is, apparently, irreversible. Therefore, studies that provide new interventions, such as stem cell therapy, are of great interest. In this study, we carried out induced murine lymphedema using human amniotic membrane stem cells. At first, we obtained the model of lymphatic insufficiency based on Tabibiazar et al., 2006, in which a 2 mm microablation throughout the circumference was made in the tail of the animal. However, after 30 days of induction, a spontaneous regression was observed, making this model unusable. After extensive literature research, another model of lymphedema induction (Shimizu et al., 2012) was found. In this model, the authors perform a surgical microablation, maintaining a 4 mm flap in the ventral region. The authors obtained stable lymphedema for at least 30 days. Based on these findings, the model of induced murine lymphedema, based on Shimizu et al., 2012, was performed and, after proving this stability for 60 days, this model was used for the induction of murine lymphedema. After this characterization, the animals that have had induced lymphedema were subjected to cell therapy using 0.5X106 human amniotic membrane stem cells (MAh) or canine yolk sac (SVc) at the time of induction. Animals without lesion, with lesion (SHAM) and treated only with solution were also analyzed. The monitoring of lymphedema in the tail was done through clinical follow-up, photographic record and caudal diameter measurement every 2-3 days. At the end of the study, the animals were euthanized, had their tails removed, and were subjected to evaluation of the therapeutic effects of the cell therapy through exudate analysis, histological analysis (HE, picrosirius) and immunohistochemistry analysis. The histological obtained by HE staining, besides presenting the best result when compared to the other techniques, allowed to evaluate the pertinent pathological alterations of each sample, revealing beneficial effects of the therapy when compared to SHAM and placebo. Picrosirius staining allowed to visualize, in addition to the structural alterations, the reversal of the predominance of type I collagen expression by type III collagen in structurally compromised tissues. The result of the sample analysis showed the expected lymphomatoid pattern for the SHAM and placebo groups, but also showed a much shorter and shorter inflammatory process in the MAh and SVc groups, suggesting that the cell therapy had an impact and the animals presented results very close to the standards presented by the control group.

Les encéphalopathies spongiformes transmissibles sont des maladies neurodégénératives caractérisées par une vacuolisation intense et une perte neuronale associées à l’accumulation d’une protéine prion pathologique : la PrPSc. A cause de la longue période d’incubation silencieuse de ces maladies, les individus souffrant d’une maladie à prions peuvent exposer des patients qui recevraient leur sang ou un de leurs organes à un risque de contamination iatrogène. De plus, lorsque le diagnostic survient, les dommages cérébraux sont souvent massifs, et l’issue toujours fatale. A ce jour, aucun traitement n’est disponible, et l’ensemble des stratégies testées a échoué.L’alternative développée par le laboratoire est celle de la thérapie cellulaire couplée à la thérapie génique, en utilisant des cellules souches embryonnaires (ES) délivrant des molécules anti-prions. Concernant le choix des molécules anti-prions, nous avons choisi les mutants PrP-DN. Notre hypothèse repose sur des études montrant qu’une lysine au codon 219 de la PrP chez l’Homme ou une arginine au codon 171 de la PrP ovine, protègent du développement d’une ESST. L’étude de ces mutants, en cellules infectées ou dans des souris transgéniques, a permis de montrer que les PrP mutées n’étaient pas converties en PrPSc et qu’elles exerçaient un effet protecteur dit « dominant négatif » sur la conversion de la PrPC sauvage en PrPSc.Un des projets du laboratoire avait donc pour objectif d’utiliser les cellules souches exprimant les mutants PrP-DN pour développer une stratégie de thérapie génique et cellulaire des maladies à prions : l’hypothèse étant que les cellules greffées pourraient non seulement réparer le tissu lésé mais que ce dernier serait également protégé de l’infection par les prions.Une première approche de thérapie génique et cellulaire avait été initiée au laboratoire et montrait des résultats plutôt encourageants. En effet, la greffe de cellules souches neurales murines exprimant des PrP-DN et produites à partir de cellules souches embryonnaires murines, conduisait, pour une partie des souris, à un allongement du temps d’incubation de la maladie, ainsi qu’à une diminution de l’astrogliose et de la vacuolisation.Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse a été de valider l’approche thérapeutique en montrant que les cellules greffées délivraient des mutants PrP-DN capables d’inhiber la réplication du prion. Nous avons opté pour un modèle de culture organotypique infectée par des prions murins. En plus de répondre aux exigences éthiques de la directive 2010/63/UE, ce modèle offre l’avantage de pouvoir réaliser plus d’essais, des cinétiques d’accumulation de PrPSc et de visualiser le devenir des cellules greffées. Enfin, opter pour cette stratégie permettait de transposer dans un modèle humanisé des travaux précédemment réalisés et ayant montré des résultats encourageants. Pour cela, il a été nécessaire de mettre en place un modèle prion ex vivo de culture organotypique de tranches de cerveau, dans lequel il était possible de réaliser des greffes et permettant d’évaluer l’effet inhibiteur des mutant-PrP-DN sur la réplication du prion. Par ailleurs, notre groupe fait partie, avec d’autres groupes travaillant avec des cellules souches mésenchymateuses, de l’équipe « Biologie des cellules souches et médecine régénératrice », il nous est apparu pertinent d’évaluer l’effet des MSC sur la pathologie prions dans des modèles prions en culture organotypique et en particulier d’évaluer l’impact de greffes de MSC concomitantes aux greffes de NSC-PrP-DN. En effet, ces cellules sont décrites comme pouvant induire un microenvironnement neuroprotecteur en limitant la prolifération des cellules de la microglie et des astrocytes, et peuvent favoriser la différenciation des NSC. Enfin notre dernier objectif visait à transposer les outils murins vers des outils « humains » en produisant des NSC humaines issues d’ES et exprimant une PrP humaine portant les mutations DN. / Transmissible spongiform encephalopathies are neurodegenerative diseases characterized by a strong vacuolization, a neuronal lost and deposits of prion pathologic protein: PrPSc. This PrPSc accumulation is the result of the conformational conversion of the host encoded endogenous PrPC protein. Although the incidence of these diseases in humans remains low (about one to two cases per million inhabitants per year), these diseases remain a public health problem. Indeed, because of their long and silent incubation period, patients with prion disease may expose people through blood transfusion or organ transplantation with a risk of iatrogenic contamination. In addition, when the diagnosis occurs, brain damage is often massive, and the outcome is always fatal and rapidly occurs. Until now, there is no treatment that could be proposed to patients.The alternative developed by our laboratory for several years, is a strategy of cell therapy coupled with gene therapy. The general objective is to use pluripotent embryonic stem cells (ESC) and graft them as a “medicine” not only to orchestrate a functional recovery of the damaged zones and protect the grafted cells from prion propagation but also to deliver anti-prion molecules.For the anti-prion molecules, we have chosen dominant negative PrP mutants (PrP-DN). Our choice is based on studies showing that a lysine at codon 219 of the human PrP or an arginine at codon 171 of the ovine PrP protect against the development of a TSE. Study of these mutants in infected cells or in transgenic mice showed that the mutated PrPC were not converted into PrPSc. Moreover, they exibit a so-called "dominant negative" protective effect on the conformational conversion of their wild-type PrPC counterparts. A first approach of gene and cell therapy was initiated in the laboratory and has shown encouraging results. Indeed, the graft of murine neural stem cells (NSC) derived from murine embryonic stem cells and expressing anti-prion molecules, has allowed, for some of the mice, to an increase the incubation time of the diseaseas well as to a decrease of astrogliosis and vacuolization.In this context, the first objective of my thesis was to validate the therapeutic approach by showing that the grafted cells were able to inhibit prion replication trough the dominant negative effect of the PrP-DN. To address this point, we have chosen to use an organotypic culture model infected with murine prions (22L strain). In addition to fill the ethical requirements under the European Directive 2010/63 and the 3Rs, organotypic culture models offer the advantage to perform and repeat experiments, kinetic tests, and PrPres analysis. This model also allows to visualize the fate of the grafted cells. Finally, by choosing this strategy, it will be possible to transpose into a humanized model the work previously performed on mouse organotypic cultures.To achieve this task, it was necessary to establish an ex vivo prion model of organotypic culture brain slices, in which it was possible to perform grafts and to evaluate the inhibitory effect of PrP-DN mutants on the prion replication.In addition, as our group is included in the team "Stem cell biology and regenerative medicine" (led by Pr Jorgensen) in which several stem cells are studied (liver stem cells and mesenchymal stem cells (MSC)) and because MSC have been shown to provide protective effects when grafted in the brain of mice with neurological diseases, it was therefore relevant to evaluate the effect of MSC on prion pathology in our prion models and in particular to evaluate the impact of concomitant MSC grafts on NSC-PrP-DN.In a last step, our goal was to transpose the mouse tools (NSC from ES and expressing the PrP-DN mutants) to "human" tools by producing human NSCs derived from human ESC and expressing human PrP-DN, and to characterized the resulted cells.

La dystrophie musculaire de Duchenne de Boulogne (DMD) est une myopathie héréditaire liée au chromosome X et causée par une mutation du gène de la dystrophine. Affectant un garçon sur 5000, cette maladie entraine une dégénérescence progressive des muscles striés squelettiques et cardiaques. A ce jour, la DMD demeure une maladie invalidante, incurable et les personnes atteintes ont une espérance de vie de 30 ans. Parmi les thérapies innovantes en cours de développement, la thérapie cellulaire est une stratégie prometteuse. Cependant elle présente plusieurs limitations notamment liées à l’efficacité des types cellulaires utilisés et le devenir des cellules après injection in vivo. Le premier objectif de cette thèse est le développement d’une méthode d’imagerie pour étudier à l’échelle de l’organisme et de façon non invasive la biodistribution et la survie des cellules suite à leur injection systémique dans un modèle préclinique pertinent, le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), un modèle animal reproduisant fidèlement le phénotype DMD. Notre attention s’est portée sur l’utilisation du symporteur sodium iode (NIS) pour le suivi non invasif des cellules. Nous avons obtenu des cellules myogéniques exprimant le NIS, autorisant leur visualisation par scintigraphie grâce à la propriété d’absorption du technétium 99m conférée par ce symporteur. Nous avons montré in vitro que le NIS est fonctionnel pour la capture de radioactivité même après une différentiation avancée des cellules. En parallèle, nous nous sommes intéressés au type cellulaire. Les cellules primaires ayant une capacité de renouvellement limitée, cela restreint leur utilisation en thérapie et leur modification génomique. Afin de contourner cette limitation, plusieurs protocoles visant à obtenir des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) dérivées de cellules canines ont été utilisés. De plus, pour ne plus être dépendant de l’immunosuppression imposée par les greffes allogéniques, nous avons utilisé le système d’édition génomique CRISPR/Cas9 pour mettre au point une correction des cellules GRMD afin de permettre la réalisation de greffes autologues. Nous avons également utilisé le système CRISPR/Cas9 pour réaliser l’insertion ciblée du gène NIS dans un site précis du génome des cellules. Les résultats obtenus autorisent le développement de programmes comparant le potentiel thérapeutique de cellules dans un modèle préclinique de la DMD. / Duchenne muscular dystrophy (DMD), an X-linked recessive myopathy, is caused by mutations in the dystrophin gene. One boy out of 5000 is affected by this disease, which induces a progressive loss of skeletal striated and cardiac muscles. To date, DMD remains an invalidating disease and there is no cure for it. People suffering from DMD usually die in their 30’s. Among the innovative therapies currently under development, cell therapy is a promising strategy. However, it has some limitations related notably to a low efficiency of tested therapeutic cells and their tracking in vivo after injection. The first aim of this thesis is to develop an imaging method allowing non-invasive monitoring of biodistribution and survival of cells at the scale of a large organism, following systemic injection in the GRMD dog (Golden retriever muscular Dystrophy, a relevant animal model of DMD, as it replicates finely the DMD phenotype). We took interest in the sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter. We induced the expression of the NIS in myogenic cells to allow visualization of the cells by scintigraphy thanks to its ability to uptake technetium 99m. We showed that NIS is functional in the cells and they maintain their ability to differentiate. Primary cells have a limited self-renewal capability restraining their use in human cell therapy and gene editing. To overcome this limitation, we used several protocols to derive induced pluripotent stem cells (iPSCs) from adult canine cells. Furthermore, to avoid immune suppression protocols, we used the CRISPR/Cas9 gene editing tools to design a correction strategy of the GRMD mutation for future autologous injections. We also used CRISPR/Cas9 to perform a targeted integration of the NIS gene in a safe harbor locus. Results allow us to develop protocols to compare the therapeutic potential of candidate cells in a preclinical model of DMD.

La thérapie cellulaire est basée sur l'administration de cellules immunocompétentes dans le but d'induire une réponse thérapeutique. Le transfert de gène est un moyen d'optimiser et de sécuriser la thérapie cellulaire. Récemment, plusieurs essais cliniques d'immunothérapie ont montré l'efficacité de lymphocytes T reprogrammés pour le traitement des cancers. De plus, le transfert de gène « suicide » permet de sécuriser les effecteurs immunitaires utilisés en thérapie cellulaire. Cependant, les capacités des cellules pourraient encore être améliorées par l'expression de cytokines et de récepteurs aux chémiokines. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet de thèse était le développement et la caractérisation d'outil innovants de thérapie génique. Ce travail a demandé le développement de vecteurs sécurisés pour 1 reprogrammation des lymphocytes T avec un CAR et leur persistance in vivo. Ces outils pourront par la suite être mis à la disposition de la recherche clinique afin de promouvoir de nouvelles stratégies de thérapi cellulaire anti-tumorale. / Cell therapy is based on administration of immunocompetent cells in order to induce a therapeutic response. Gene transfer can optimize and secure the cell therapy. Recently, several clinical trials of immunotherapy have shown the efficacy of reprogrammed T cells for the treatment of cancers. Moreover, the transfer of suicide gene enables th use of secure immune effectors in cell therapy. However, capacities of cells could be further improved by the expression of cytokines and receptors chemiokines. ln this context, the aim of this thesis project was the development and the characterization of innovative tools for gene therapy. This work required the development of safe retroviral vectors for reprogramming T cells with Chi me rie Antigen Receptor (CAR). These tools will be made available for clinical research in order to promote new anti-tumor cell therapy strategies.