L'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules épithéliales pigmentées situés entre la rétine neurale et la membrane de Bruch et joue un rôle important dans le maintien et la survie des photorécepteurs. Des malformations, le dysfonctionnement ou bien la mort de l'EPR provoque la mort des photorécepteurs. Orthodenticle homéoboîte 2 (Otx2) est un facteur de transcription exprimé par l’EPR chez l’animal adulte joue un rôle important dans l’EPR puisque son inactivation chez les souris [CreERT2 : Otx2flox] provoque la dégénérescence des photorécepteurs. En outre, les patients présentant des mutations dans le gène OTX2 souffrent de microphtalmie ou d'anophtalmie et développent généralement des maladies oculaires comme la rétinopathie pigmentaire (RP) ou l’amaurose congénitale de Leber. La délivrance par un vecteur AAV d’OTX2 dans des cellules primaires de l’EPR de porc mais aussi de cellules pluripotentes humaines différenciés en EPR nous a permis d’identifier de nouveaux gènes régulés par OTX2 et un variant d’épissage connu OTX2L. Nous avons par ailleurs identifié un nouveau variant d’épissage OTX2S par analyse bioinformatique de banques d'ADNc normalisées de RPE de rat. OTX2S présente une délétion d’une partie de l’homéodomaine. Nous avons étudié l'expression de ce variant dans la rétine et étudié ses propriétés transcriptionnelles en utilisant le promoteur du gène de la tyrosinase couplé à un gène rapporteur dans les cellules HEK293 et les cellules de l’EPR primaires de porcs. OTX2S exerce un effet transdominant négatif uniquement dans les cellules de l’EPR. Son rôle physiologique doit encore être précisé car il semble participer à la transition épithélio-mésenchymateuses qui survient après décollement de la rétine, une pathologie rétinienne fréquente. L’analyse par immunoprécipitation de la chromatine sur des cellules de l'EPR de porc montre que la plupart de ces gènes sont des cibles directes d’OTX2.Notre laboratoire a identifié un facteur neuroprotecteur sécrétée par photorécepteurs à bâtonnets, Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVF) qui est une stratégie prometteuse pour le traitement de RP lorsque les patients portent des mutations dans les gènes exprimés sélectivement photorécepteurs à bâtonnets, ce qui est le plus fréquemment rencontré. Cette stratégie thérapeutique ne s’appliquera pas aux RP causés par les mutations de gènes spécifiquement exprimés par l’EPR, comme le gène MERTK. Afin d'étudier le bénéfice potentiel du gène Otx2, nous avons utilisé un rongeur modèle de RP avec une mutation dans le gène Mertk, les rats RCS. Nous montrons que la transplantation d'EPR génétiquement modifié pour sur-exprimer Otx2, améliore la protection des photorécepteurs et la vision de l’animal. Une augmentation de la réponse électrophysiologique (ERG) des photorécepteurs (ERG) et la protection de la couche nucléaire externe représentant les photorécepteurs a pu être mise en évidence, cette dernière par tomographie par cohérence optique (OCT). Nos résultats indiquent que cette approche pourrait être applicable pour le traitement des maladies de la rétine avec le dysfonctionnement de l'EPR comme la RP ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge. / Retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of pigmented epithelial cells located between the neural retina and Bruch’s membrane and has an important function in the maintenance and survival of photoreceptor cells. Abnormalities, dysfunction and/or death of the RPE ultimately lead to death of retinal photoreceptors. Orthodenticle homeobox 2 (Otx2) is expressed in adult RPE and known to have an important role in RPE function since loss of function in Otx2flox/CreERT2 mice, leads to rapid photoreceptor degeneration. Furthermore, patients having mutations in this gene suffer from microphthalmia or anophthalmia and usually develop eye diseases as retinitis pigmentosa (RP) and Leber congenital amaurosis.Using ectopic expression involving AAV-mediated gene transfer in primary pig RPE cells and human induced pluripotent RPE derived cells, we have identified novel gene targets of Otx2 and Otx2L. The physiological role of Otx2S still needs to be addressed since it potentially participates in the epithelial to mesenchymal transition that occurs after retinal detachment, a frequent retinal pathology. Chromatin immunoprecipitation analysis using pig RPE cells shows that most of these genes are direct targets of OTX2.Our lab has previously identified a neuroprotective factor secreted by rod photoreceptors, Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVF) which is a promising strategy for treatment of RP for patients with mutations in photoreceptor cells. This therapeutic strategy will not cover RP caused in genes specifically expressed by RPE, as for example MERTK gene.In order to study the potential benefit of Otx2 for gene-cell therapy, we used an animal model of RP with a mutation in the rdy (Mertk) gene, the RCS rats. Transplantation of genetically engineered RPE cells expressing Otx2, enhances the protection of photoreceptors and vision in this model. We demonstrate an improvement in electroretinograph (ERG) recordings and thickness of outer nuclear layer as measured in optical coherence tomography (OCT). Our findings indicate that this approach might be applicable treatment for retinal diseases with RPE dysfunction like RP and/or age related macular degeneration. Furthermore, using bioinformatic tools and gene screening of normalized cDNA libraries from rat RPE we identified Otx2S, a novel-splicing variant of Otx2 that lacks a part of a homeodomain. Otx2L, another splice variant of Otx2 with an insertion was also studied. We have shown the expression of this variant in NR and RPE and studied its transcriptional properties using gene reporter assay in HEK293 cells and pig primary RPE cells. In addition, we have found that Otx2S exerts a transdominant negative effect on tyrosinase promoter only in primary RPE cells.

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Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) constituent un excellent système modèle pour étudier les mécanismes épigénétiques contrôlant la transcription du génome mammifère. Un nombre important de membres de la famille des facteurs de remodelage de chromatine ATP-dépendants ont une fonction essentielle pour l’auto-renouvellement des cellules ES, ou au cours de la différentiation. On pense que ces facteurs exercent ces rôles essentiels en régulant l’accessibilité de la chromatine au niveau des éléments régulateurs de la transcription, en modulant la stabilité et le positionnement des nucléosome.Dans ce projet, nous avons conduit une étude génomique à grande échelle du rôle d’une dizaine des remodeleurs (Chd1, Chd2, Chd4, Chd6, Chd8, Chd9, Ep400, Brg1, Smarca3, Smarcad1, Smarca5, ATRX et Chd1l) dans les cellules ES. Une double stratégie expérimentale a été utilisée : Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine suivi par un séquençage à haute-débit (ChIP-seq) sur des cellules ES étiquetées pour les différents remodeleurs, pour étudier leur distribution sur le génome, et un approche transcriptomique sur des cellules déplétées de chaque remodeleur par traitement avec des vecteurs shRNA (knockdown). Nous avons établi les profils de liaison des remodeleurs sur des éléments régulateurs (promoteurs, enhancers et sites CTCF) sur le génome, et montré que ces facteurs occupent toutes les catégories d’éléments régulateurs du génome. La corrélation entre les données ChIP-seq et les données transcriptomiques nous a permis d’analyser le rôle des remodeleurs dans les réseaux de transcription essentiels des cellules ES. Nous avons notamment démontré l’importance particulière de certains remodeleurs comme Brg1, Chd4, Ep400 et Smarcad1 dans la régulation de la transcription chez les cellules ES. / The characteristics of embryonic stem cells (ES cells) make them one of the best models to study the epigenetic regulation exerted by different actors in order to control the transcription of the mammalian genome. Members of the Snf2 family of ATP-dependent chromatin remodeling factors were shown to be of specific importance for ES cell self-renewal and during differentiation. These factors are believed to play essential roles in modifying the chromatin landscape through their capacity to position nucleosomes and determine their occupancy throughout the genome, making the chromatin more or less accessible to DNA binding factors.In this project, a genome-wide analysis of the function of a number of ATP-dependent chromatin remodelers (Chd1, Chd2, Chd4, Chd6, Chd8, Chd9, Brg1, Ep400, ATRX, Smarca3, Smarca5, Smarcad1 and Alc1) in mouse embryonic stem (ES) cells was conducted. This was done using a double experimental strategy. First, a ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation followed by deep sequencing) strategy was done on ES cells tagged for each factor in the goal of revealing the genomic binding profiles of the remodeling factors. Second, loss-of-function studies followed by transcriptome analysis in ES cells were performed in order to understand the functional role of remodelers. Data from both studies were correlated to acquire a better understanding of the role of remodelers in the transcriptional network of ES cells. Specific binding profiles of remodelers on promoters, enhancers and CTCF binding sites were revealed by our study. Transcriptomic data analysis of the deregulated genes upon remodeler factor knockdown, revealed the essential role of Chd4, Ep400, Smarcad1 and Brg1 in the control of transcription of ES cell genes. Altogether, our data highlight how the distinct chromatin remodeling factors cooperate to control the ES cell state.

Pendant l'ontogenèse, les progéniteurs hématopoïétiques sont générés en 3 vagues indépendantes. Les 2 premières (primitive, puis transitoire définitive) ont lieu dans le sac vitellin (SV), avant la génération des Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH), qui apparaissent plus tard au niveau de la région "Aorta‐Gonad‐Mesonephros" (AGM), lors de la 3ème vague, dite définitive. Tal1/SCL et son paralogue Lyl‐1 appartiennent à un complexe transcriptionnel qui régule le développement hématopoïétique. Tal‐1/SCL est indispensable à la spécification des progéniteurs hématopoïétiques des 3 vagues. Par contre, le rôle de Lyl‐1 lors du développement hématopoïétique est mal connu. Grâce au gène rapporteur lacZ des souris Lyl‐1lacZ, nous montrons que Lyl‐1 marque et régule les progéniteurs macrophagiques primitifs (MΦPrim) du SV, ainsi que la microglie. Notre analyse en RNA‐seq montre que l'ensemble des gènes exprimés par les progéniteurs MΦPrim est bien distinct de celui des progéniteurs MΦ transitoire définitifs, plus tardifs, reflétant le statut primitif des MΦPrim. De plus, l'invalidation de Lyl‐1 influence les voies de signalisations de l'inflammation et conduit à une activation anormale des gènes de la microglie impliqués dans la régulation synaptique. Lors de la 3ème vague du développement hématopoïétique, nous montrons que l'invalidation de Lyl‐1 conduit à une diminution de l'activité des reconstitutions à long terme des CSH de l'AGM à E10 et à une réduction de la population de CSH dans le foie fœtal à E12 et E14. La réduction de la population de CSH semble liée uniquement à un taux accru d'apoptose des CSH Lyl‐1LacZ/LacZ uniquement au stade de l'AGM. En conclusion, nos résultats montrent que Lyl‐1 régule la production des progéniteurs MΦ primitifs, le développement de la microglie et celui des CSH, dont il contrôle la taille de la population, peu après leur génération. / During ontogeny, hematopoietic progenitors are generated in three independent waves, the first two (primitive and transient definitive) develop from the yolk sac (YS), before the appearance of Hematopoietic Stem Cells (HSC) that occurs later in the Aorta‐Gonad‐Mesonephros (AGM), in the third and definitive wave. Both Tal1/SCL and its paralog Lyl‐1 belong to the transcriptional complex that regulates hematopoietic progenitor development. While Tal‐1/SCL is mandatory for the specification of hematopoietic progenitors from the three embryonic waves, to date the functions of Lyl‐1 during developmental hematopoiesis remains largely unknown. By making use of the lacZ reporter from the Lyl‐1lacZ mice, we previously found that Lyl‐1 marks and regulates YS macrophage progenitors from the primitive wave (MΦPrim), and embryonic microglia. In a RNA‐seq analysis, we show that MΦPrim gene expression landscape is clearly distinct from later transient definitive MΦ　progenitors, reflecting their primitive status. Lyl‐1 invalidation also influences some inflammatory signalling pathways and also leads to the abnormal activation of microglia genes involved in synaptic regulation. In the definitive wave, we found that Lyl‐1 disruption leads to a reduced efficiency of long‐term reconstitution by HSC from embryonic day (E)10 AGM and reduced HSC pool size in E12 and E14 fetal liver. The reduction of the HSC pool results from a higher apoptosis level in Lyl‐1LacZ/LacZ HSCs restricted to the AGM stage. Together, our data establish that Lyl‐1 regulates the development of MΦPrim progenitors and HSC pool size soon after they are generated.

De nos jours, plus de 50% des patients porteurs de tumeur bénéficient d’un traitement de radiothérapie. Malgré de récentes avancées technologiques augmentant de la précision des traitements, la radiothérapie encéphalique induit toujours des effets secondaires invalidants et irréversibles. Ce constat justifie le développement de nouvelles techniques de radiothérapie. Des études précliniques réalisées sur l’irradiation FLASH ont montré la possibilité de maintenir un effet anti-tumoral tout en réduisant drastiquement les effets secondaires sur le tissu sain. Cet effet a été appelé « l’effet FLASH ». Cette technologie consistant à délivrer des doses à des débits supérieurs à 40 Gy/s a généré un intérêt important pour l’augmentation de l’index thérapeutique de la radiothérapie.Ce travail de thèse vise à étudier l’effet anti-tumoral de l’irradiation FLASH sur des modèles précliniques de glioblastome, tout en évaluant ses effets sur le tissu cérébral sain. Des modèles murins de glioblastome sous-cutané, orthotopique et transgénique ont été développés et irradiés grâce à un prototype d’accélérateur linéaire d’électrons délivrant une irradiation FLASH ou conventionnelle. De plus, des modèles murins d’irradiation encéphalique ont été mis au point afin d’investiguer les effets cellulaires et les altérations fonctionnelles induites par l’irradiation FLASH. La division cellulaire et la structure neuronale dans l’hippocampe ont été évaluées, ainsi que des aspects plus physiopathologiques comme la neuroinflammation ou l’astrogliose. Un panel de tests cognitifs a également été utilisé afin d’étudier les altérations cognitives induites par l’irradiation encéphalique. Enfin, les évènements physico-chimiques engendrés par l’irradiation FLASH et plus particulièrement le rôle de la consommation de dioxygène lors de l’irradiation, ont été analysés afin d’élucider les mécanismes qui supportent l’effet FLASH.Dans tous les modèles étudiés, l’irradiation FLASH a présenté un effet anti-tumoral au minimum similaire à celui de l’irradiation conventionnelle. Les modèles d’irradiation encéphalique ont montré une innocuité de l’irradiation FLASH sur le tissu cérébral sain, avec une absence de déficits cognitifs pour des débits de dose supérieurs à 100 Gy/s, couplée à une absence d’altération de la division cellulaire et de la structure neuronale dans l’hippocampe, une absence de neuroinflammation et d’astrogliose. De plus, des résultats similaires ont été observés avec l’utilisation de rayons X délivrés à ultra-haut débit par un rayonnement synchrotron. Sur le plan mécanistique, la réversion des effets protecteurs de l’irradiation FLASH par l’induction d’une hyperoxie, l’absence d’effet de l’anoxie sur l’effet anti-tumoral et la production de moins de radicaux libres souligne le rôle primaire du dioxygène dans l’effet FLASH.L’ensemble de ces résultats illustre la possibilité d’augmenter l’index thérapeutique de la radiothérapie en utilisant l’irradiation FLASH. En effet, cette nouvelle technologie permet de préserver le tissu sain contre les toxicités radio-induites lorsque l’irradiation est délivrée à des débits supérieurs à 100 Gy/s, tout en gardant un effet anti-tumoral équivalent à l’irradiation conventionnelle. D’après ces résultats précliniques et un transfert clinique dans un futur proche, l’irradiation FLASH pourrait devenir une technique de choix dans le traitement des tumeurs par radiothérapie. / Nowadays, more than 50% of cancer patients can benefit from a radiation-therapy treatment. Despite important technological advance and dose delivery precision, encephalic radiation-therapy still induces large and irreversible side effects in pediatric and adult cancer patients, justifying the urge to develop new radiation-therapy techniques. Preclinical studies on FLASH irradiation (FLASH-RT) showed a possibility to efficiently treat the tumors, without inducing drastic side-effects on the normal tissue, by increasing the dose-rate over 40 Gy/s. This so called “FLASH effect” set off an important interest in this new irradiation technology to increase the therapeutic ratio of radiation-therapy.This PhD work aimed at investigating the antitumor effect of FLASH-RT on brain tumor models along with the assessment of the ultra-high dose-rate irradiation effects on the normal brain tissue. In this context, subcutaneous, orthotopic and transgenic glioblastoma murine models were used to investigate the curative effect of FLASH irradiation delivered with an experimental LINAC available at the CHUV, and able to deliver both conventional and FLASH irradiation. Moreover, murine models of whole brain irradiation were developed to investigate the radiation-induced cellular and functional alterations at early and late time-points post-FLASH-RT. These models were used to decipher the cellular effectors involved in the brain’s radiation response including hippocampal cell-division and neuronal responses but also more physio pathological aspects as radiation-induced reactive astrogliosis and neuroinflammation. A panel of well-defined cognitive tests was also developed to investigate the radiation-induced cognitive alterations. Eventually, the physio-chemical primary events induced by FLASH-RT, and particularly the role of dioxygen consumption, were investigated to decipher the mechanisms that underlie the FLASH effect.In all investigated tumor models, FLASH-RT displayed an efficient antitumor effect at least similar to the conventional irradiation. The whole brain irradiation models showed an innocuousness of FLASH-RT on the normal brain tissue, with an absence of cognitive deficit several months after irradiation at dose-rates above 100 Gy/s, coupled with a preservation of hippocampal cell division and neuronal structure. This protection was also observed at the physio pathological level with an absence of astrogliosis and neuroinflammation. Moreover, these results were reproduced with ultra-high dose-rate X-Rays delivered with a synchrotron light source. On the mechanistic side, the reversion of the protective effects of FLASH-RT by hyperoxia, and the absence of effect of anoxia on the antitumor effect, along with a decreased ROS production underlies the primary role of dioxygen consumption during ultra-high dose-rate irradiation.Altogether, these unique results depict the possibility to increase the therapeutic index of radiation-therapy by the use of FLASH-RT. Indeed, this new irradiation technology preserves the normal brain tissue from radiation-induced toxicities by increasing the dose-rate over 100 Gy/s, while keeping an antitumor effect equivalent to the conventional dose-rate irradiation. According to these preclinical results and an upcoming clinical translation, FLASH-RT might become a major contributor to the cancer treatment by radiation therapy.

Notre groupe a montré que l’hypoxie sévère (0.1% O2) induit un arrêt du cycle cellulaire en G0 des cellules humaines CD34+ et des cellules murines FDCP mix. Peu d’études ont exploré l’existence de Cellules Initiatrices de Leucémie (CIL) dans les LAL et leur rôle dans les rechutes. Notre projet s’est focalisé sur l’effet de l’hypoxie sévère sur la quiescence des CIL dans les LAL, qui pourrait être responsable d’un pourcentage de rechutes. En effet dans la niche hématopoïétique, ou sont localisées les Cellules souches hématopoïétiques et probablement les CIL, la concentration d’oxygène avoisinerait 0,1%.Nous avons utilisé la lignée de LAL NALM6 pour explorer les effets de l’hypoxie sévère sur leur survie, leur cycle cellulaire et leur chimiorésistance. Nos résultats ont mis en évidence qu’une culture à 0.1% O2 durant 7 jours de la lignée NALM6: - inhibe leur prolifération sans surmortalité, - révèle une population restreinte de CIL quiescentes et chimiorésistantes capables d’induire une leucémie dans des souris. Nous avons recherché les relations entre l’hypoxie sévère et quelques caractéristiques des cellules primaires de patients atteints de LAL : existence et rôle de CIL résistantes à l’hypoxie et aux agents thérapeutiques conventionnels des LAL ; localisation de ces cellules résiduelles dans la moelle osseuse des souris xénogreffées. Nos résultats suggèrent que certaines rechutes de LAL pourraient être dues à la persistance à long terme de « quiescent/dormant » CIL dans les niches hypoxiques de la moelle osseuse. Ce modèle est intéressant pour explorer les mécanismes in vitro et in vivo de chimiorésistance dans les LAL et le rôle de l’environnement dans ce phénomène. / Our group showed that severe hypoxia (0.1% O2) induces G0 cell-cycle-arrest of human CD34+ cells and of murine FDCP-mix Cells. Few studies explored the existence of quiescent Leukemia Initiating Cells (LIC) in ALL and their role in primary chemoresistance and relapses. Our project is focused on the effect of very low O2 concentrations in the maintenance of quiescent LIC in ALL, that could be responsible of a percentage of relapses. Indeed in bone marrow niches, where hematopoietic stem cells and probably LIC are located, the O2 concentrations are below 0.1%.In the present study we used the NALM-6 ALL cell line to explore the effects of culture at 0.1% O2 on their survival, cell cycle and chemoresistance. Our results evidence that a 7 days culture of NALM-6 cells at 0.1% O2: - inhibits their proliferation without major cell death; - reveals a restricted LIC population of quiescent and chemoresistant LIC; - maintains quiescent chemoresistant LIC that induce leukemia when injected in immunodeficient mice. We investigated the relationships between severe hypoxia and some characteristics of ALL primary cells obtained from patients: existence and role of quiescent chemoresistant LICs in ALL relapses; location of these residual cells inside the bone marrow of engrafted mice. Our results suggest that some ALL relapses could be due to the long term persistence of “quiescent / dormant” LIC in hypoxic bone marrow niches. This model is of interest for exploring the in vitro and in vivo (xenograft) mechanisms of chemoresistance in ALL and the role of the bone marrow environment in this phenomenon.

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) interviennent de plus en plus dans le domaine de la médecine régénérative, notamment pour traiter des maladies aujourd’hui difficilement curables avec les moyens actuels. Deux verrous scientifiques limitent pourtant leur utilisation et leur commercialisation. D’une part, de grandes quantités de cellules sont nécessaires pour répondre à la forte demande médicale. D’autre part, les cellules étant elles-mêmes le médicament final, délivré chez le patient, leur qualité doit être préservée (phénotype souche, capacité de différenciation). La mise en culture de ces cellules, sur des microporteurs, en bioréacteur agité, semble répondre à ces enjeux. Cependant, une connaissance plus précise de l’impact, sur la réponse physiologique des cellules, des technologies utilisées et de l’hydrodynamique générée est nécessaire pour améliorer les lois d’extrapolation des bioréacteurs de culture de CSM. Dans ce contexte, des travaux ont été mis en œuvre pour étudier l’influence du mode d’agitation (orbital ou mécanique) sur l’attachement, l’expansion et le détachement de CSM issues de la gelée de Wharton (GW-CSM) de cordons ombilicaux, sur des microporteurs de différentes compositions. Pour contribuer à la quantification de l’expansion cellulaire, une méthode de comptage automatique in situ a été développée pour estimer le nombre de cellules par microporteur, ainsi que leur répartition, sans avoir à procéder à leur détachement. Des microporteurs commerciaux ont ensuite pu être comparés à des microporteurs synthétisés dans un laboratoire partenaire, en termes d’attachement et expansion cellulaire, ainsi que de facilité de détachement. En parallèle de ces travaux, l’impact de la conception du mobile d’agitation, en bioréacteur mécaniquement agité, sur la mise en suspension de microporteurs a été analysé. A l’issue de cette étude, une analyse dimensionnelle et des simulations CFD ont été mises en place et deux modèles reliant la fréquence minimale de juste mise en suspension (Njs) avec la géométrie du mobile d’agitation (forme, taille, position dans la cuve) et les propriétés matérielles des particules et de la phase liquide ont été proposés. Une stratégie d’optimisation des paramètres géométriques d’un mobile en minibioréacteur, dédié à la culture de CSM sur microporteurs, a été mise en place, à partir de paramètres caractérisant les contraintes hydromécaniques perçues par la phase solide, judicieusement choisis et intégrés lors des simulations CFD. Selon un plan d’expérience, et les résultats extraits des simulations, des surfaces de réponse ont été construites et une optimisation multi-objective a été réalisée afin de déterminer la géométrie minimisant les contraintes perçues par les particules, et donc par les cellules adhérées. Des cultures de GW-CSM en minibioréacteurs équipés de différents mobiles ont finalement été validées, avec une comparaison préliminaire de l’impact de ces géométries sur l’expansion cellulaire / Mesenchymal stem cells (MSC) are becoming increasingly involved in the regenerative medicine field, particularly to treat diseases that are not effectively curable with the current therapies. Two scientific barriers are nevertheless responsible for MSC use and commercialization limitations. On one side, large amounts of cells are needed to reach the high cell dose requirements. On the other side, cells being the final product themselves, directly injected into the patient, their quality have to be controlled (stem cell phenotype, differentiation capability). MSC cultivation on microcarriers in a stirred bioreactor seems to meet these challenges. However, a precise knowledge about the impact of the technologies and the hydrodynamics generated, on the physiological cell response, is necessary to improve the scale-up of MSC cultures in bioreactors. In this context, present work is dedicated to the study of the impact of the agitation mode (orbital or mechanical) on the cell attachment, expansion and detachment on various microcarrier types, in the case of MSC derived from the Wharton’s jelly (WJ-MSC) of umbilical cords. To quantify more precisely cell distribution and expansion on microcarriers, an automatic and in situ counting method was developed, which need no detachment step. This allowed the identification of commercial microcarriers suitable for WJ-MSC cultures, which were then compared to home-made microcarriers, synthesized by a partner laboratory, in terms of cell attachment and expansion, and detachment efficiency. In parallel to these works, the impact of the impeller design on the microcarrier suspension in stirred tank bioreactors was investigated. Based on a dimensional analysis and CFD simulations, it resulted in the establishment of two models relating the minimal agitation rate to ensure all particle suspension (Njs) with the impeller geometrical characteristics (design, size, off-bottom clearance) and the material properties of both the solid and the liquid phases. CFD models validation allowed then to develop a strategy to optimize the geometrical configuration of an impeller, dedicated to MSC cultures on microcarriers in a minibioreactor. Parameters characterizing the hydromechanical stress encountered by the solid phase were wisely chosen and integrated into CFD simulations. Based on a design of experiments, and the hydrodynamics data recovered from simulations, response surfaces were built and a multiobjective optimization was achieved in order to determine the geometry minimizing the particle stress, and also by adhered cells. WJ-MSC cultures in minibioreactors equipped with impellers displaying various geometries were finally validated, with a preliminary comparison of the impact of these geometries on the cell expansion

Les maladies cardiovasculaires sont souvent causées par des arythmies qui proviennent d'une obstruction du système de conduction cardiaque. L'intervenant clé de ce système est le nœud sinu-atrial (SA), qui est responsable de l’initiation de chaque battement cardiaque. L’activation électrique à intervalles réguliers, assurant que le rythme cardiaque est un rythme normal. Le dysfonctionnement du nœud SA entraînerait des instabilités électriques dans le cœur. Une maladie cardiaque acquise, comme la cardiopathie rhumatismale, ou un bloc de conduction ne sont que quelques-uns des nombreux cas qui nécessitent un stimulateur cardiaque électronique pour surveiller la fréquence cardiaque et générer une impulsion lorsqu'elle bat anormalement. Bien que le stimulateur cardiaque électrique soit considéré comme une thérapie fiable, il n'est pas sans limites. Ces limites comprennent les complications chirurgicales, l'infection au plomb ainsi que la durée de vie limitée de la batterie, qui doit être remplacée à intervalles de quelques années, ce qui alourdit le fardeau hospitalier. Plusieurs approches ont été adoptées pour développer une méthode thérapeutique plus adéquate. Une stratégie qui sera étudiée implique l'utilisation d'une greffe de cellules de stimulateur cardiaque, créant fondamentalement un stimulateur biologique. Les approches de thérapie cellulaire utilisent des cellules souches embryonnaires pour évoluer vers les lignées de cellules cardiaques, y compris les cellules stimulatrices cardiaques. Ces cellules de stimulation sont caractérisées par une dépolarisation spontanée qui crée les impulsions rythmiques dans le cœur et contrôle la fréquence cardiaque. Un élément important des cellules du stimulateur cardiaque qui donne lieu à la dépolarisation spontanée sont les canaux « hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated » qui sont activés pendant l’hyperpolarisation et conduisent le courant sous le nom de « funny current ». Ce courant augmente la perméabilité intérieure de la cellule aux courants de sodium et de potassium conduisant à la dépolarisation de la cellule. D'autre part, le taux de conduction est déterminé par la connexine 30.2 et la connexine 45, qui sont des protéines transmembranaires qui s’assemblent pour former des jonctions lacunaires. L'expression de HCN et l'expression de la connexine ont toutes deux étés liés au facteur T-box 3 (Tbx3) dans le développement des myocytes auriculaires. Une approche praticable pour moduler l'expression des gènes et par conséquent l'expression des protéines est l'utilisation du conditionnement chimique. Le Phorbol 12- myristate 13-acétate (PMA) est un activateur de Protéine Kinase C (PKC) lié à l'expression de Tbx3, et par conséquent à l'expression de HCN et de connexine, et entraînant une modification de l'activité spontanée. Les cellules souches embryonnaires de souris sont des cellules qui sont isolées de la masse cellulaire interne des embryons. Ces cellules ont la capacité de se différencier en tous les types de cellules somatiques. En combinant les facteurs de croissance, ces cellules peuvent se différencier en cardiomyocytes. Nous émettons l'hypothèse que le conditionnement chronique de cardiomyocytes de souris avec PMA entraîne une régulation à la hausse de l'expression de Tbx3 et par conséquent une régulation à la hausse de l'expression de HCN et de l'expression de connexine, favorisant ainsi le développement des cellules stimulatrices cardiaques dans la population des cardiomyocytes. Afin de vérifier notre hypothèse, nous avons acheté des cellules de la lignée cellulaire E14TG2A de souris. Ces cellules ont été cultivées dans des pétris et différenciées en cardiomyocytes à l'aide d'un protocole en trois étapes (voir la section Méthodes). Les cardiomyocytes sont ensuite exposés à la PMA à des concentrations variables (0.1 µM vs 1 µM) pendant 1h (exposition aiguë) ou 24 h (exposition chronique). Les résultats variaient d'un groupe expérimental à l'autre par rapport au groupe témoin. Dans toutes les conditions expérimentales, il semble y avoir une augmentation initiale de l'activité spontanée, mais elle s'inverse rapidement à la marque des 24 heures, où le rythme diminue. Différentes concentrations jouent un rôle dose-dépendant dans l'effet inhibiteur de longue durée sur la stimulation des cellules. / Cardiovascular diseases are often caused by arrhythmias that originate from an obstruction within the cardiac conduction system. The key player within that system is the sinoatrial (SA) node, which is responsible for initiation the electrical impulses at a regular interval, insuring the heartbeat at a normal pace. Dysfunction of the SA node would lead to electrical instabilities in the heart. An acquired heart disease, such as rheumatic heart disease, or a conduction block are just some of many cases that would require an electronic pacemaker to monitor the heart rate and generate an impulse when it beats abnormally. Although the electric pacemaker is considered as a reliable therapy, it is not without limitations. These limitations include surgery complication, lead infection as well as limited battery lifespan, which requires replacement every few years thus adding to the hospital burden. Several approaches have been taken to develop a more adequate therapeutic method. A strategy that will be investigated involves using a graft of pacemaker cells, fundamentally creating a biological pacemaker. Cell therapy approaches use embryonic stem cells to evolve into the cardiac cell lines, including pacemaker cells. These pacing cells are characterized by spontaneous depolarization that create the rhythmic impulses in the heart and control the heart rate. An important element of the pacemaker cells that give rise to the spontaneous depolarization are the hyperpolarization- activated and cyclic nucleotide-gated (HCN) channels that are activated during hyperpolarization and conduct the funny current by increasing the cell’s inward permeability to sodium-potassium currents. On the other hand, the conduction rate is determined by connexin 30.2 and connexin 45, which are transmembrane proteins that assemble to form gap junctions. Both HCN expression and connexin expression has been linked to T-box factor 3 (Tbx3) in the development of atrial myocytes. A practicable approach to modulate gene expression and consequently protein expression is using chemical conditioning. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) is a Protein Kinase C (PKC) activator that has linked to Tbx3 expression, and consequently HCN and connexin expression, and lead to a modification in spontaneous activity. Mouse embryonic stem cells (ESCs) are cells that are isolated from the inner cell mass of early embryos. These cells can differentiate into all somatic cell types. Given the proper combination of growth factors, these cells can differentiate into cardiomyocytes. We hypothesize that chronic conditioning of mice cardiomyocytes with PMA lead to an upregulation of Tbx3 expression and consequently an upregulation of HCN expression and connexin expression, therefore promoting the development of pacemaker cells within the cardiomyocyte population. In order to test our hypothesis, we purchased cells from the mouse E14TG2A cell line. These cells were cultured in glass bottom petri dishes and differentiated into cardiomyocytes using a three-step protocol (shown in Methods section). The cardiomyocytes are then exposed to PMA in varying concentration (0.1 µM vs 1 µM) for either 1h (acute exposure) or 24 h (chronic exposure). The results varied between the experimental groups compared to the control. In all experimental conditions there seems to be an initial increase in spontaneous activity, but this is quickly reversed at the 24 h mark, where pacing decreased. Different concentration plays a dose-dependent role in long-lasting inhibitory effect on the pacing of the cells

L’AVC représente la première cause d’handicap acquis chez l’adulte. L’AVC ischémique, représentant 87% des AVCs, est une pathologie complexe dont le premier facteur de risque aggravant est l’hypertension artérielle. À l’heure actuelle les seuls traitements disponibles sont la thrombolyse et la thrombectomie. Cependant, ces traitements présentent de nombreuses contre-indications et effets secondaires limitant leurs applications chez les patients. L’objectif des travaux menés dans cette thèse est l’évaluation d’un traitement pharmacologique, le RGTA (ReGeneraTing Agent), combiné ou non à un traitement cellulaire utilisant les cellules souches mésenchymateuses (CSMs), chez des rats normo- et hyper-tendus. Les résultats obtenus dans cette thèse montrent qu’à la suite d’une ischémie cérébrale, les traitements évalués offrent une neuroprotection et une récupération fonctionnelle persistantes, chez les animaux noromo- et hyper-tendus. Cette récupération est expliquée par la réduction du volume lésionnel, par une meilleure plasticité cérébrale (angiogenèse, neurogenèse), ainsi par la potentialisation de l’effet des CSMs par le RGTA. En conclusion, nos études démontrent l’efficacité d’une thérapie robuste de neurorprotection chez le rongeur à la suite d’une ischémie cérébrale. / Stroke is the leading cause worldwide of adult severe disability. The limited available treatments for ischemic stroke, which accounts for 87% of strokes, makes it necessary to develop new therapeutical approaches. Stroke is a complex pathology and chronic hypertension (CAH) represents the first aggravating risk factor for ischemic stroke. At the present time, the only two available treatments for ischemic stroke, thrombolysis and thrombectomy, present several side effects limiting their clinical use. Here we evaluate the effect of a molecular RGTA (ReGeneraTing Agent) based therapy combined or not to a cellular therapy based on the use of mesenchymal stem cells (MSCs) for the treatment of ischemic stroke in normo- and hyper-tensive rats. The results demonstrate that the evaluated therapies confer a long lasting neuroprotection accompanied by animals’ functional recovery. Further analysis suggest that RGTA enhances brain plasticity (angiogenesis, and neurogenesis), protects the extracellular matrix structure, and potentiates MSCs’ beneficial effects. In conclusion, our studies demonstrate the efficacy of a molecular and cellular combined therapy conferring a persistent neuroprotection and functional recovery for the treatment of ischemic stroke.

La thérapie cellulaire utilisant une greffe d’hépatocytes est une stratégie prometteuse pour traiter les maladies du foie. Cependant, plusieurs limitations freinent leur transfert pour des applications cliniques, comprenant la production à haut débit d'hépatocytes fonctionnels, leur survie en culture, l’âge du donneur et la source des cellules souches hépatiques (CS). Les avancées scientifiques réalisées à ce jour ont permis d’identifier de nouveaux marqueurs moléculaires et les voies de signalisation impliquées dans la différenciation des CS en hépatocytes fonctionnels. En effet, la voie de signalisation Wnt a montré être importante pour réguler de nombreux processus biologiques des CS permettant de contrôler leur différenciation hépatique dont l’activation des GTPases et les gènes ciblant la voie de signalisation de Lgr5. Récemment, des études ont montré que le marqueur Lgr5 (récepteur 5 couplé à la protéine G contenant une répétition d’acides aminés riche en leucine) est décisif pour maintenir une expansion à long terme des CS hépatiques in vitro. En outre, Lgr5 fonctionne principalement comme un effecteur de la Cdc42 (cycle de division cellulaire 42) qui est un membre de la famille des Rho-GTPase. Une forte expression de la Cdc42 a montré être corrélée avec le vieillissement des SCs hématopoïétiques. Néanmoins, cette corrélation n'a jamais été étudiée à ce jour dans les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (hADSCs).Au cours de nos travaux de thèse, nous nous sommes intéressés (i) à proposer une nouvelle technologie de reprogrammation d’hépatocytes matures murins en progéniteurs endodermiques (mEndoPCs) exprimant Lgr5 capables de générer des organoïdes spécifiques du foie et de se différencier en hépatocytes et cholangiocytes in vitro et en des structures biliaires et hépatiques in vivo (ii) à étudier l’activité de Cdc42 dans les hADSCs âgées et l'impact de son inhibition sélective par le ML141 sur leur potentiel de différenciation hépatique in vitro.Nous montrons qu’il a été possible de générer des mEndoPCs et à améliorer la différenciation hépatique des hADSCs âgés. Nous montrons également que Lgr5 et Cdc42 sont régulés de façon distincte par la voie de signalisation Wnt. De plus, nos résultats ont révélé que les voies LIFR/STAT3 et Lgr5/WNT sont essentielles pour l’auto renouvellement des mEndoPCs permettant leur expansion illimitée in vitro en présence d’activateur de STAT3. Les voies MAPK/PKA, WNT/ β-caténine et la production d'exosomes ont montré avoir rôle majeur dans l’âge des hADSCs. Nous montrons qu’une transition mésenchymato-épithéliale était nécessaire pour différencier les hADSCs en hépatocytes fonctionnels. D’autre part, ML141 est proposé comme un nouvel outil pharmacologique permettant de reverser l’âge des hADSC âgés et d’amplifier le taux de prolifération, d’adhésion et de fonctionnalité hépatique à un niveau équivalent aux hADSCs jeunes. Enfin, le transfert de ces méthodologies à l’homme pourrait servir pour la médecine régénératrice du foie, comme outil pour évaluer la toxicité hépatique des médicaments et pour l'ingénierie et la reconstitution d’un foie entier par des approches de « bio printing ». / Hepatocytes cell-based transplantation is a promising strategy for treating liver diseases. However, there are still several limitations for their use in clinical applications among them the generation of highthrouput of functional hepatocytes, their life span in culture, the age of the donor age and the source of hepatic stem cells (SCs). At present, the challenge lies to develop approaches aiming the identification of the new molecular markers signaling pathways involved in the differentiation of SCs toward functional hepatocytes. In fact, Wnt(s) pathways governs multiple biological processes controlling the differentiation fate of SCs into hepatocytes, some of them result in the activation of small GTPase and the Lgr5 pathway regulators. Indeed, Lgr5 (a target gene of Wnt, the Leucine-rich-repeat-containing G protein-coupled Receptor 5) was shown to be crucial for maintaining long-term expansion of hepatic SC in vitro. In addition, Lgr5 primarily functions as an effector of the Cdc42 GTPases (a RhoGTPase protein, the cell division cycle 42). Higher activity of Cdc42 was reported to be correlated to hematopoietic SCs aging. However, this correlation has never been studied before in adipose tissue Mesenchymal Stem Cells (ADSCs) which were proposed recently as a promising tool for liver regeneration.In this study, we were interested (i) to propose a novel method of reprogramming mouse mature hepatocytes into murine endodermic progenitors (mEndoPCs) that express Lgr5, generate liver-specific organoids and can differentiate into hepatocytes and cholangiocytes in vitro and give arise to bile duct structures and into functional hepatocytes in vivo, and (ii) to study the activity of Cdc42 in human aged-derived hADSCs and the impact of its selective inhibition by ML141 on their hepatic differentiation potential in vitro.In our study we succeeded to generate mEndoPCs and to improve the functionality of the aged-hADSCs derived-hepatocytes. We showed that both Lgr5 and Cdc42 are regulated distinctly by Wnt signaling pathways. In addition, our results revealed that LIFR/STAT3 and LGR5/WNT pathways are important to maintain the unlimited expansion of mEndoPCs in vitro when STAT3 pathway is activated. MAPK/PKA, WNT/ β-catenin pathways and the exosome’s production were shown to be deregulated with hADSCs aging. We showed also that a mesenchymal to epithelial transition was crucial to transdifferentiate hADSCs into functional hepatocytes. On the other side, ML141 is proposed as a new pharmacological tool to rejuvenate aged-hADSCs toward functionally younger-like cells thus by promoting cell proliferation, doubling and cell adherence. Finally, the transfer of these methodologies to human could serve the regenerative medicine of the liver as a good tool for hepatocyte-based drug toxicity screening systems and for the liver engineering using a « bio printing » approach.