Les lésions carieuses ou les traumatismes physiques profonds aboutissent souvent à une destruction des fibroblastes pulpaires (FP) et des odontoblastes, et provoquent l’activation du Complément. Le rôle du Complément dans la régénération pulpo-dentinaire a été montré avec le fragment C5a, connu pour induire la migration des cellules souches pulpaires (CS). Nous avons montré que le C3a participe à la régénération pulpo-dentinaire. Après un tri cellulaire, nous avons montré l’expression du C3aR sur les CS et les FP en culture, et aussi sur coupes de dents humaines. De plus, les deux types cellulaires prolifèrent en présence de concentrations croissantes de C3a. La migration cellulaire a été évaluée dans des chambres de migration microfluidiques. Les CS sont mobilisées, tandis que les FP sont spécifiquement recrutés par un gradient de C3a. Les complexes d’attaque membranaire (CAM) produits par les FP a été montrée. Nous avons démontré que les FP peuvent détruire les bactéries cariogènes S. mutans et S. sanguis. Les FP ont été incubés avec un milieu contenant du LTA pour simuler une infection bactérienne in vitro. Nous avons montré que les bactéries cariogènes étaient très sensibles aux surnageants des FP stimulés, soulignant un effet létal des CAM. Des co-cultures de fibroblastes pulpaires et de bactéries ont révélé la présence des CAM sur les bactéries. Ces résultats soulignent des rôles inattendus du Complément pendant les étapes précoces de la régénération pulpo-dentinaire et de la défense pulpaire. Ce travail suggère de nouvelles stratégies thérapeutiques, où des molécules du Complément pourront être délivrées localement pour favoriser la régénération pulpo-dentinaire / Deep pulp physical injuries or carious lesions often lead to fibroblast cell injury and destruction of the dentin-secreting odontoblasts, and lead to the Complement activation. Its involvement in dentin-pulp regeneration has been shown with C5a fragment, known to induce specific recruitment of DPSC. We show that C3a, is also involved in dentin-pulp regeneration. After cell sorting, we highlighted C3a Receptor expression on pulp fibroblasts and STRO-1-sorted DSPC as well as on human tooth sections in vivo. The effect of C3a on proliferation of DPSCs and pulp fibroblasts was shown with an increased proliferation for both cell types. Cell migration was evaluated using microfluidic chemotaxis chambers. We showed that DPSCs were mobilized but not specifically recruited, while pulp fibroblasts were specifically recruited following a C3a gradient. We demonstrated that pulp fibroblasts can synthesize functional membrane attack complex (MAC) and kill cariogenic bacteria S. mutans and S. sanguinis. To simulate bacterial infection in vitro, pulp fibroblasts were incubated with lipoteichoïc acid (LTA). Agar well diffusion assay showed that bacteria exposed to LTA-conditioned media were highly sensitive, showing lethal effect of MAC. Coculture of pulp fibroblasts and bacteria showed that MAC synthesized by pulp fibroblasts can be directly fixed on cariogenic bacteria, after direct contact with fibroblasts. These results underline unexpected roles of Complement system activation in early events of dentin-pulp regeneration and pulp defense. Our findings suggest new therapeutic strategies, where new agents can deliver specific Complement molecules to enhance dentin-pulp regeneration.

Les plantes conservent la capacité à former de nouveaux organes tout au long de leur vie grâce au maintien de structures contenant des cellules souches, les méristèmes. La formation des fleurs, structures reproductives de la plante, est une étape essentielle de son cycle de vie. Afin d’assurer un développement floral complet, un méristème doit être formé de novo au sein du jeune bouton floral. Des données éparses de la littérature indiquent que le facteur de transcription LEAFY, en plus d’être un régulateur clé de l’identité florale, est aussi impliqué dans la mise en place du méristème floral.Dans la première partie de ce travail nous explorons le rôle de LEAFY dans l’initiation du méristème floral. Cette étude est concentrée sur un gène cible de LEAFY, le facteur de transcription REGULATOR OF AXILLARY MERISTEMS1 (RAX1). Nous montrons notamment que la voie régulée par LEAFY/RAX1 agit en parallèle du facteur de transcription REVOLUTA pour permettre la mise en place du méristème floral.Dans la deuxième partie de ce travail nous étudions les propriétés du domaine N-terminal de LEAFY. Ce domaine permet l’oligomérisation de LEAFY ainsi que potentiellement sa liaison aux régions fermées de la chromatine. Nous étudions également de manière plus exploratoire le rôle de ce domaine dans la régulation de l’expression du gène AGAMOUS, un important régulateur du développement floral. / Plants have the capacity to continuously produce organs throughout their life because they maintain stem cells containing structures called meristems. The formation of flowers is an essential step of the plant’s life-cycle. In order to ensure flower development, a new meristem must be formed within the young flower bud. Various data across the literature indicate that the transcription factor LEAFY is involved flower meristem formation in addition to its role as a master regulator of flower identity.In the first part of this work we explore the role of LEAFY in the initiation of flower meristem. This study focuses on a LEAFY target gene, the transcription factor REGULATOR OF AXILLARY MERISTEMS1 (RAX1). We show that the LEAFY/RAX1 pathway acts in parallel of the transcription factor REVOLUTA to allow flower meristem formation.In the second part of this work we study the properties of the N-terminal domain of LEAFY. This domain mediates LEAFY oligomerization and potentially its binding to closed chromatin regions. We also study in a more prospective manner the role of this domain in the transcriptional regulation of AGAMOUS, an important regulator of flower development.

L’hypothyroïdie congénitale est un des troubles endocriniens les plus fréquents chez l’enfant, touchant un nouveau-né sur 2500.[1] Toutefois, même si quatre facteurs de transcription principaux, NKX2.1, PAX8, FOXE1 et HHEX, sont connus pour être impliqués et nécessaires au développement de la glande thyroïde, seuls 2% des patients atteints de dysgénésies thyroïdiennes sont reliés à une mutation au niveau d’un de ces quatre facteurs de transcription. Ceci suggère que d’autres facteurs, encore inconnus, pourraient jouer un rôle important durant l’organogenèse de la glande thyroïde.[1]Les mécanismes moléculaires contrôlant les différentes étapes du développement thyroïdien étant encore très peu connus, l’objectif de ce projet vise à décrypter le réseau génique contrôlant le développement thyroïdien. Pour se faire, la mise au point d’un protocole d’invalidation de gènes candidats impliqués dans le développement thyroïdien au sein de cellules souches embryonnaires murines à l’aide de la technologie des Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) a été mis au point. Ce nouveau protocole d’édition ciblée du génome de cellules souches embryonnaires permet la modélisation des différentes mutations identifiées au sein de patients atteints d’hypothyroïdisme congénital mais aussi la compréhension des différents mécanismes impliqués dans le développement de la glande thyroïde lorsque ce protocole est couplé avec notre modèle in vitro de différenciation de cellules souches embryonnaires murines en cellules folliculaires thyroïdiennes. Grâce à l’utilisation combinée de ces deux protocoles, nous avons pu mettre en évidence la nécessité du gène Foxe1 pour la différenciation in vitro correcte des progéniteurs NKX2.1+ en cellules folliculaires thyroïdiennes. Toutefois, il a été démontré qu’une faible proportion de cellules sont toujours capables de générer des follicules thyroïdiens en l’absence du gène Foxe1. Enfin, la génération inattendue de structures pulmonaires tridimensionnelles parmi les cellules Foxe1 KO différenciées avec du 8-br-cAMP a été observée. Cette génération de structures pulmonaires ne semble pas être une conséquence directe de la diminution d’expression du gène Pax8 observée au sein de ces lignées Foxe1 KO mais pourrait refléter un potentiel rôle épigénétique du gène Foxe1 permettant ou non le recrutement de certaines protéines au sein de la chromatine. Le gène Foxe1 semble à la fois jouer un rôle de facteur « pioneer » et de « Gatekeeper » en orientant le destin cellulaire des progéniteurs NKX2.1+ vers une différenciation thyroïdienne à défaut d’une différenciation pulmonaire. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les cellules tumorales circulantes (CTCs) sont des cellules tumorales provenant de la tumeur primaire et/ou des métastases que l’on retrouve dans la circulation sanguine. Les plus agressives d’entre elles peuvent envahir les organes distants pour former des métastases. Leur faible nombre parmi la multitude de cellules sanguines rend difficile leurs détections et leurs études. C'est pourquoi, le challenge actuel est de pouvoir mettre en culture ces cellules.Dans le cadre de l’éude clinique nationale COLOSPOT, notre laboratoire a pu recueillir des échantillons de patients atteints d’un cancer colorectal métastatique. Grâce à ces prélèvements sanguins, 9 lignées dérivées de CTCs ont pu être établies : CTC-MCC-41, CTC-MCC-41.4, CTC-MCC-41.5A-G.Dans ce projet de thèse, les 9 lignées cellulaires ont été caractérisées au niveau du génome, du transcriptome, du protéome, du sécrétome et fonctionnel, et comparées à des lignées cellulaires tumorales primaires et métastatiques connues, comme effectuée précédemment sur la lignée CTC-MCC-41 (Cayrefourcq et al. 2015)Cette analyse très complète a montré malgré des profils génétiques très différents, toutes les lignées CTCs ont les caractéristiques d’un phénotype intermédiaire épithélial/mésenchymal, des propriétés de cellules souches, la mutation BRAFV600E et la capacité d’éviter divers processus de lutte contre les cellules tumorales comme la résistance à l’anoïkis et l’échappement au système immunitaire. Les études fonctionnelles ont montré que les CTC-MCC pouvaient induire rapidement la formation de tubes avec des cellules endothéliales in vitro, signe d'un potentiel angiogénique.La seconde partie de ce travail de thèse a été d’étudier la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) in vitro. Ce phénomène est une étape clé du processus métastatique des CTCs et implique diverses transformations des cellules à divers niveaux : morphologique, protéique et transcriptomique. Trois méthodes différentes ont été testées pour induire l’EMT au sein des lignées CTCs impliquant deux différents modes d’induction et deux modes de culture. Ces changements ont pu être observés dans les lignées témoins, validant les expérimentations effectuées. Cependant, l’EMT n’a pas été clairement observée sur les lignées CTCs.En conclusion, ces analyses suggèrent que les CTC coliques cultivés à partir de biopsies liquides séquentielles, effectuée durant le traitement d’un même patient, ont des caractéristiques communes. Mais la sélection des clones, avec un phénotype distinct, résistant au traitement, a été observée. D'autres études avec ces lignées CTC-MCC sont en cours, évaluant leur capacité à induire des tumeurs résistantes à des médicaments spécifiques ou à analyser la contribution épigénétique. Ces données peuvent fournir des indications pour la découverte de nouveaux biomarqueurs permettant d'identifier les sous-populations de CTC les plus agressives et pour la mise au point de nouveaux médicaments pour inhiber les CTCs initiatrices de métastases dans le cancer du côlon. / Circulating tumor cells (CTCs) are tumor cells that have been shed from the primary tumor and/or metastases into the bloodstream. The most aggressive ones can invade distant organs to form metastases. Their low number among the multitude of blood cells makes difficult their detection and study. This is why the current challenge in this field of expertise is to be able to culture them ex vivo.In the national COLOSPOT clinical study, our team was able to collect samples of patients with metastatic colorectal cancer. From blood samples of only one patient, 9 cancer cell lines derived from CTCs could be established: CTC-MCC-41, CTC-MCC-41.4, CTC-MCC-41.5A-G.In this project, the 9 CTC-MCC lines have been characterized at the genome, transcriptome, proteome, secretome and functional levels, and compared with primary and metastatic commercial colon cancer cell lines, as previously done on the CTC-MCC-41 line (Cayrefourcq et al., Cancer Res. 2015)These analyses have shown that despite their very different genetic profiles, all CTCs have the characteristics of an epithelial/mesenchymal intermediate phenotype, stemcell like characteristics, with BRAFV600E mutation, and the ability to avoid biological processes such as the resistance to anoïkis and the escape to the immune system. Moreover, functional studies have shown that all CTC-MCC lines can rapidly induce tubes formation with endothelial cells in vitro, a sign of an angiogenic potential.The second part of this thesis work was to study the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in vitro. This phenomenon is a key step in the metastatic process and involves several cell transformations at various levels: morphological, proteomic and transcriptomic. Three different methods have been tested to induce EMT within these CTC-MCC lines involving two different induction and culture modes. These changes could be observed in the control lines, validating the experiments carried out. However, EMT has not been clearly observed yet on the CTC-MCC lines.In conclusion, this longitudinal study suggest that colorectal CTCs cultured from sequential liquid biopsies, performed during treatment of the same patient, have common characteristics. However, our results strongly suggest that no clonal selection, with a distinct phenotype, resistant to treatment, has occurred. Further studies with these CTC-MCC lineages are in process, evaluating their ability to induce in vivo drug-resistant tumors or to analyze the epigenetic contribution. These data may provide guidance for the discovery of new biomarkers to identify the most aggressive CTC subpopulations and for the development of novel drugs to inhibit metastases-competent CTCs in colon cancer.

Le muscle squelettique adulte est capable de se régénérer à plusieurs reprises après blessure grâce à sa population de cellules souches résidentes: les cellules satellites. Cependant, les mécanismes impliquant les cellules satellite dans la recouvrement de l'homéostasie et de l'intégrité musculaire ne sont toujours pas clairs. Chez l'adulte, les cellules satellites sont quiescentes et localisées dans une niche entre la lame basale et la fibre musculaire. Après blessure, elles prolifèrent, se différencient et fusent afin de restaurer les fibres endommagées. Lorsque la niche des cellules satellite est altérée elles expriment rapidement le marqueur d'activation Myod puis prolifèrent. La lame basale des cellules souches est riche en collagène, glycoprotéines et de protéoglycan. Cependant, le mécanisme de fonction de ces protéines de la matrice extracellulaire (MEC) dans le maintien de la cellule satellite dans sa niche est toujours inconnu. De plus, l'interaction entre la MEC et des voies de signalisation cellulaire essentielles au maintien des cellules souches quiescentes sont toujours un mystère. Nous avons identifiés la voie Notch comme effecteur indispensable à la quiescence des cellules satellites. Un ChIP screening dans des cellules musculaires nous a permit d'identifier des microRNAs et collagènes spécifiques comme des gènes cibles de la voie Notch. L'utilisation d'outils génétiques permettant de moduler l'activité de la voie Notch démontrent que ces microRNAs et collagènes sont régulés transcriptionnellement par la voie Notch in vitro et in vivo. Nous proposons que le Collagène de type V et miR-708, induits par Notch, peuvent autoréguler la niche des cellules souches. / Adult skeletal muscles can regenerate after repeated trauma, yet our understanding of how adult muscle satellite (stem) cells (MuSCs) restore muscle integrity and homeostasis after regeneration is limited. In the adult mouse, MuSCs are quiescent and located between the basal lamina and the myofibre. After injury, they re-enter the cell cycle, proliferate, differentiate and fuse to restore the damaged fibre. A subpopulation of myogenic cells then self-renews and replenishes the stem cell pool for future repair. When MuSCs are removed from their niche, they rapidly express the commitment marker Myod and proliferate. The basal lamina that ensheaths MuSCs is rich in collagens, non-collagenous glycoproteins and proteoglycans. Whether these and other extracellular matrix (ECM) proteins constitute functional components of MuSCs niche remains unclear. Moreover, although signalling pathways that maintain MuSCs quiescence have been identified, how these regulate stem cell properties and niche composition remains largely unknown. Sustained, high activity of the Notch signalling pathway is critical for the maintenance of MuSCs in a quiescence state. Of interest, whole-genome ChIP for direct Notch/Rbpj transcriptional targets identified specific micro-RNAs and collagen genes in satellite cells. Using genetic tools to conditionally activate or abrogate Notch signalling, we demonstrate that the expression of these target genes is controlled by the Notch pathway in vitro and in vivo. Further, we propose that Collagen V and miR708 can contribute cell-autonomously to the generation of the MuSCs niche via a Notch signalling-regulated mechanism.

L’objectif de mon travail de thèse était d’évaluer si des autogreffes de cellules souches olfactives ecto-mésenchymateuses (CSO-EMs) restauraient les capacités d’apprentissage et de mémorisation dans un modèle d’amnésie chez le rat, consécutive à une ischémie cérébrale globale (ICG). Cette dernière pouvant avoir lieu suite à un arrêt cardiaque (AC) et conduire à des conséquences neurologiques délétères telles que des atteintes cognitives et/ou sensorimotrices.C’est dans ce contexte scientifique que se sont inscrits mes travaux de recherche dont le premier objectif était de valider un modèle fiable et reproductible d’amnésie chez le rat. Nous avons sélectionné un modèle d’AC induisant une ICG caractérisé par des pertes neuronales ciblées au niveau de la zone CA1 des hippocampes dorsaux associées à des déficits d’apprentissage et de mémorisation.Enfin, la dernière étape de mon projet a consisté à évaluer l'effet des autogreffes de CSO-EMs sur la restauration des fonctions cognitives chez des rats ayant subi une ICG. Tout d’abord, j’ai dû élaborer un protocole permettant le suivi du devenir des CSO-EMs à la suite d’autogreffes, sans en altérer leurs propriétés endogènes. Puis j’ai démontré que ces autogreffes de CSO-EMs GFP+ : i) restauraient les capacités d’apprentissage et de mémorisation, ii) stimulaient la neurogénèse et iii) amélioraient la PLT chez des rats ayant subis une ICG.L’ensemble des données recueillies au cours de ma thèse accordent d’avantage de crédibilité à l’utilisation des CSO-EMs dans le cadre de thérapies menées contre les atteintes du SNC. / The main goal of my thesis was to evaluate whether autografts of ecto-mesenchymal olfactory stem cell (EM-OSCs) restored learning and memory abilities in a rats model of amnesia following global cerebral ischemia (GCI). The latter can occur following cardiac arrest (CA) and lead to deleterious neurological consequences such as cognitive and / or sensorimotor injuries.Finally, the final step in my project was to evaluate the effect of EM-OSCs autografts on restoration of cognitive functions in ischemic rats. First of all, I had to develop a protocol to monitor the fate of EM-OSCs following autografts, without altering their endogenous properties. Then, I demonstrated that these GFP+ EM-OSCs autografts: i) restored learning and memory abilities, ii) stimulated neurogenesis, and iii) improved PLT in ischemic rats. All the data gathered during my thesis give credibility to the use of EM-OSCs in the framework of therapies against the CNS damages.

Les mutations du gène codant pour la protéine XIAP (X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein) sont à l’origine du syndrome lymphoprolifératif lié à l’X de type 2 (XLP-2). Il s’agit d’un déficit immunitaire rare caractérisé par une susceptibilité anormale à l’infection par le virus d’Epstein Barr (EBV). De plus, certains patients déficients en XIAP peuvent souffrir d’une pathologie intestinale parfois sévère. XIAP est molécule anti-apoptique qui a aussi été impliquée dans la signalisation et les fonctions de récepteurs de l’immunité innée, les récepteurs NOD1 et NOD2. Mon travail de thèse a eu pour objectif de caractériser cette pathologie intestinale et ses mécanismes physiopathologiques. Pour cela, nous avons étudié une cohorte de patients déficients en XIAP présentant une pathologie inflammatoire intestinale. Nous avons également recherché des mutations de XIAP dans une cohorte d’enfants ayant présenté comme unique signe clinique une pathologie intestinale précoce. Sur 83 patients testés, 3 patients porteurs de mutations de XIAP ont été identifiés. Nous avons ensuite montré que cette pathologie intestinale est très proche sur les plans clinique et histologique de la maladie de Crohn, qui est une des principales affections inflammatoires de l’intestin chez l’adulte. La maladie de Crohn est associée à des facteurs environnementaux et une susceptibilité génétique, dont les polymorphismes dans le gène NOD2 qui représentent le facteur plus important identifié à ce jour. Nous avons ensuite montré que les monocytes des patients déficients en XIAP ont un défaut de production d’IL-8, de MCP-1 et d’IL-10 en réponse à la stimulation de la voie NOD2. Par contre, nous n’avons pas mis en évidence d’excès d’apoptose des cellules épithéliales digestives chez les patients. En revanche, ils présentaient un nombre diminué de leur lymphocytes T innés circulants, Enfin, au cours de cette étude, nous avons identifié pour la première fois des femmes vectrices d’une mutation de XIAP à l’état hétérozygote, ayant développé des manifestations inflammatoires intestinales. Chez ces patientes, l’inactivation du chromosome X, qui normalement est biaisée en faveur de l’allèle sain chez les vectrices asymptomatiques, est de façon inhabituelle biaisée vers l’allèle muté contribuant à une diminution de l’expression de XIAP dans les monocytes et une altération de la voie NOD2. Ce travail a permis de montrer que le déficit en XIAP est responsable d’une forme monogénique de la maladie de Crohn. Nos résultats suggèrent que le défaut d’activation des monocytes par NOD2 est un mécanisme important de la pathogénèse de la maladie. Sur le plan thérapeutique, la greffe de moelle osseuse semble indiquée dans les formes sévères, puisque le principal défaut identifié est une anomalie du compartiment hématopoïétique, et chez deux de nos patients, elle a permis en effet une amélioration franche de la pathologie digestive qui était très sévère. / Mutations in the gene encoding for XIAP (X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein) are causing the X-linked lymphoproliferative syndrome type 2 (XLP-2). It is a rare immunodeficiency characterized by an abnormal susceptibility to infection with Epstein Barr virus (EBV). In addition, some XIAP-deficient patients may suffer from an intestinal disease that can be severe. XIAP is an anti-apoptotic molecule which has also been involved in the signaling and the functions of receptors of the innate immunity, NOD1 and NOD2. My thesis work aimed to characterize this intestinal pathology and its pathophysiology. For this, we studied a cohort of known XIAP-deficient patients with inflammatory bowel disease. We also looked for mutations of XIAP in a cohort of children who presented as the only clinical sign an early intestinal pathology. In 83 patients tested, three were identified as carrier of a XIAP mutation. We then showed that this intestinal pathology is clinically and histologically very close to Crohn’s disease, which is a major inflammatory bowel disease in adults. Crohn's disease is associated with environmental factors and genetic susceptibility, including polymorphisms in the NOD2 gene that represent the most important factor identified to date. We then showed that the monocytes from XIAP-deficient patients have a defect in production of IL-8, MCP-1 and IL-10 in response to stimulation of the NOD2 pathway. However, we did not reveal any excess of apoptosis in intestinal epithelial cells from XIAP-deficient patients. On the other hand, they showed a decreased number of their circulating innate T cells. Finally, during this study, we identified for the first time, female carriers of a mutation of XIAP in the heterozygous state, who developed intestinal inflammatory manifestations. In these patients, the inactivation of the X chromosome, which is normally biased toward the healthy allele in asymptomatic vectors, is biased to the unusually mutated allele contributing to a decrease of the expression of XIAP in monocytes and an alteration of the NOD2 pathway. This work showed that XIAP deficiency is responsible for a monogenic form of Crohn's disease. Our results suggest that the lack of monocyte activation by NOD2 is an important mechanism in the pathogenesis of the disease. Therapeutically, the bone marrow transplant seems indicated in severe cases, since the main identified defect is an abnormality of the hematopoietic compartment and in two of our patients, it allowed a clear improvement of the digestive pathology that was very severe.

Les cellules souches musculaires, ou cellules satellites, adoptent différents états en transitant de quiescence à prolifération et différentiation. Ces transitions s'accompagnent de variations des demandes énergétiques. Il demeure cependant incertain comment la modulation du métabolisme énergétique peut dicter la spécification d'un état cellulaire donné. Mon projet de thèse a eu pour objectif principal la caractérisation des voies du métabolisme énergétique à l’œuvre dans les différents états cellulaires, et comment leur modulation peut influencer ces états. Nous montrons ainsi que les cellules satellites quiescentes ont de faibles besoins énergétiques et que la phosphorylation oxydative est altérée au cours du vieillissement ainsi que dans les cellules survivant après la mort de l'animal. Au cours de la formation du tissu en croissance ou en régénération chez l'adulte, nos résultats indiquent de larges différences dans leurs demandes énergétiques. Les cellules fœtales ont une faible demande respiratoire et reposent essentiellement sur la glycolyse par rapport aux cellules adultes en cours de régénération. L'altération de la b-oxidation peroxisomale et non mitochondriale induit une différentiation précoce des cellules satellites. L'inhibition pharmacologique des b-oxidations peroxisomale et mitochondriale après blessure aiguë montre différentes contributions de ces organelles à la régénération musculaire. Les transitions entre différents états des cellules satellites s'accompagnent de modifications drastiques de leurs besoins énergétiques et l'altération de vois métaboliques spécifiques peut altérer le destin des cellules myogéniques et la régénération musculaire. / Muscle stem (satellite, MuSC) cells acquire different cell states as they need to pass from quiescence to proliferation and differentiation to support muscle homeostasis. Some of these changes are accompanied by changes in energy demands. However, it is currently unclear whether modulation in the energy metabolism pathways can in turn influence the commitment to a specific cell state. A central focus of my thesis project is to characterise the energy metabolism pathways that act in the different phases of lineage progression and how their modulation can influence the state of the cell. We show that quiescent cells have low energetic demands and OxPhos is perturbed during aging, as well as in cells that survive after death. We also compared different proliferative states, both during muscle growth and regeneration, and our results indicate a surprising difference in their metabolic requirements. Gene expression profiling and bioenergetics analysis showed that foetal cells have a low respiration demand and rely mostly on glycolysis when compared to regenerating MuSCs. Furthermore, we show distinct requirements for peroxisomal and mitochondrial mediated fatty acid oxidation (FAO) in myogenic cells. Altering peroxisomal but not mitochondrial FAO promotes early differentiation of satellite cells. Experiments using acute muscle injury and pharmacological block show differential requirements for these organelles during regeneration. These observations indicate that changes in the cell state of muscle stem cells lead to significant changes in metabolic requirements and altering specific metabolic pathways can have an impact on myogenic cell fate and the regeneration process.

La conception de biomatériaux actifs est actuellement encouragée par le manque de thérapies régénératives efficaces pour des tissus endommagés présentant une faible capacité d’autoréparation. Les progrès récents concernant les techniques de préparation de matériaux structurés (électrospinning, microfluidique) ainsi que la découverte du fort potentiel régénératif des cellules souches ont suscité un regain d’intérêt pour des projets collaboratifs à l’interface entre biologie et sciences des matériaux. Une approche prometteuse de régénération tissulaire repose donc sur la combinaison de cellules souches et de biomatériaux implantables. Des biomatériaux innovants, injectables et servants à la fois de support aux cellules et de réservoir de molécules actives telles que des protéines ou des agents de thérapie génique (Matrice Génétiquement Activée) ont été développés. Se plaçant plus particulièrement dans le contexte de l’ingénierie du cartilage, ce travail a pour objectif de développer une stratégie complémentaire concernant l’orientation de la différenciation de cellules souches mésenchymateuses (CSM) grâce au mécanisme d’interférence ARN.La principale difficulté rencontrée lors de l’utilisation d’acides nucléiques pour induire la différenciation des CSM reste leur faible capacité à traverser les membranes cellulaires, due à leur nature hydrophile et leur charge négative. De plus, les acides nucléiques sont dégradés très facilement par les nucléases extracellulaires, ce qui rend nécessaire l’utilisation d’un vecteur. Les vecteurs non-viraux sont d’excellents candidats pour des applications in vivo en raison de leur faible coût de production et leur faible immunogénicité. Toutefois, la plupart des systèmes de vectorisation trouvés dans la littérature présentent un manque de reproductibilité associé à une cytotoxicité vis-à-vis des cellules primaires. Nous souhaitions donc développer un système de transfection synthétique à la fois efficace et biocompatible. Pour cela, nous nous sommes basés sur les résultats encourageants concernant l’utilisation des micelles de complexes polyioniques (PIC) pour la transfection des cellules dendritiques. Ces micelles sont formées par complexation de deux polyélectrolytes : un copolymère à blocs double-hydrophiles (CBDH) avec un bloc anionique et un homopolymère cationique. Dans ce travail, nous avons évalué le polyoxyde d’éthylène – b – polyacide méthacrylique en tant que CBDH et la poly-L-lysine ou le polyéthylènimine en tant que polycation. L’influence des caractéristiques des composantes (asymétrie du CBDH, nature du polycation, taille des blocs, ratio de charges…) sur les propriétés physico-chimiques des micelles formées (taille, charge de surface) a d’abord été étudiée. Puis, la possibilité de complexation d’un siRNA au sein des micelles ainsi que leur stabilité en conditions physiologiques ont été évaluées. La formulation des micelles a été conçue pour permettre une dissociation des objets à un pH comparable à celui des endosomes ; ceci a été vérifié par diffusion dynamique de la lumière. Une analyse par cytométrie en flux avec un siRNA marqué TAMRA ont démontré l’internalisation effective des micelles dans les CSM. Plus important encore, l’inhibition spécifique d’un gène cible, Runx2, a été démontrée à un niveau comparable à celui d’un vecteur commercial standard, la Lipofectamine2000®. La seconde partie de la thèse a consisté en l’élaboration de microparticules. A cet effet, nous avons préparé des microsphères de collagène par un dispositif de microfluidique, et ce à partir de diverses sources de collagène (murin, porcin, bovin). Des expériences préliminaires démontrent qu’il est possible d’imprégner les micelles dans les microsphères. De même, de premiers résultats encourageants ont été obtenus quant à la capacité du système globale à assurer l’adhésion cellulaire et permettre une transfection efficace des CSM dans un environnement 3D par les micelles PIC vectorisant un siRNA anti-Runx2. / The relative lack of efficient regenerative therapies for damaged tissues with low capacity for self-repair is one major motivation for the design of new active biomaterials. Recent progress in hierarchical materials processing techniques (electrospinning, microfluidics…) and the demonstration of the strong regenerative potential of stem cells have prompted renewed interest for collaborative projects at the biology / materials science interface. The combination of stem cells and active implantable materials has emerged as a high potential approach for the regeneration of damaged tissues. In particular, injectable cell carriers also acting as a reservoir for active molecules like proteins or gene therapy agents (Gene Activated Matrices) bring about innovative solutions to current issues in the field of tissue engineering. In the context of cartilage regeneration, the main objective of this work was to investigate a complementary strategy to orient mesenchymal stem cell (MSC) fate by the use of RNA interference. One major difficulty to reach high transfection levels and efficiently direct MSC differentiation comes from the low ability of nucleic acids (NA) to cross cellular membranes, largely due to their hydrophilicity and negative charge. This, along with a strong susceptibility to extracellular nucleases, calls for efficient gene delivery vectors. Their low production cost and low immunogenic potential make non viral vectors good candidates for in vivo applications. Besides, most systems reported in the literature show reproducibility and cytotoxicity issues with primary cells that we intended to address to achieve a safe and efficient synthetic vector for MSC. Based on previous encouraging results on the transfection of dendritic cells, we chose to investigate tripartite polyionic complex (PIC) micelles. Their formation is based on the polyelectrolyte complexation of a polyanionic double-hydrophilic block copolymer (DHBC) with a cationic homopolymer. In this work, we investigated polyethylene oxide – b – polymethacrylic acid as the DHBC and Poly-L-Lysine or Polyethyleneimine as the polycation. One major part of the work was to study the influence of micelles components characteristics (block size, DHBC asymmetry, polycation nature and molecular weight, polyelectrolyte charge ratios, etc.) on the physical characteristics (dimensions, surface charge) of the obtained nanoparticles. We then studied the ability of micelles to stably complex siRNA at high loading levels, and their stability in physiological conditions. Importantly, the PIC micelles’ formulation was designed to allow for pH-triggered disassembly in acidic conditions similar to those found in endosomes, as assessed by light scattering measurements. These nanoparticles were shown to be efficiently internalized inside MSC by flow cytometry using a fluorescently labeled SiRNA-TAMRA. Most importantly, they were shown to efficiently down-regulate Runx2 mRNA in MSC, at levels similar to those reached with the gold standard Lipofectamine2000®. The second major step for the development of a GAM suited for cartilage regeneration was to elaborate injectable microparticles. To this purpose, we prepared collagen microspheres through a microfluidic-based process and with different collagen sources (murine, bovine, and porcine). Preliminary experiments show that micelles can be efficiently loaded into the microspheres. First encouraging results were also obtained regarding the ability of the created GAM to support cell adhesion, and to allow for the efficient transfection of MSC in this 3D environment, thanks to an anti-runX2 siRNA vectorized with PIC micelles. This proof-of-concept study has demonstrated that the main elements of the nano-in-micro system are ready and mostly meet the assigned requirements. This opens the way for further work to assess the ability of this GAM to effectively improve MSC chondrogenesis and ultimately cartilage repair.

Un grand nombre de pathologies cérébrales demeurent aujourd’hui incomprises par manque d’accès à l’information biologique contenue dans le tissu. L’anatomie complexe du système nerveux central et la distribution des grandes fonctions cognitives en réseaux d’aires fonctionnelles rend difficile la cartographie et la compréhension fine des mécanismes associés à la pathologie. Accéder au cerveau et se rendre capable d’y prélever du tissu sans dommages constitue donc un enjeu majeur. Ceci est d’autant plus vrai que, dans les populations occidentales, les cancers et les maladies neurodégénratives voient leurs incidences croître de manière quasi exponentielle, faisant d’elles un défi majeur en terme de santé publique dans les décennies qui viennent.Les travaux du laboratoire ont permis le développement d’un outil chirurgical innovant, basé sur l’utilisation de puces en silicium, pour autoriser le prélèvement de micro fragments de tissus dans le cerveau, de manière atraumatique. Ce concept d’ « empreinte » biologique sur silicium est en cours de validation chez l’Homme dans un essai clinique dédié à l’analyse des tumeurs. Cependant, plusieurs défis techniques restaient à solder pour préparer la voie à des versions ultérieures de ce dispositif. Ainsi, ce travail de thèse a permis de préparer une nouvelle stratégie matériau pour aborder non plus seulement les tumeurs cérébrales mais également les territoires profonds, ultra fonctionnels, impliqués dans les maladies d’Alzheimer ou de Parkinson, voire des pathologies d’autres organes (foie, poumon, prostate…). Un procédé de fabrication de silicium poreux a été entièrement validé en salle blanche, et nous avons testé l’ensemble de la cellule au gros animal, préparant un usage règlementaire chez l’Homme.Par ailleurs, dans l’idée d’améliorer la précision du geste chirurgical, nous avons pu évaluer la faisabilité d’associer notre concept avec un système de détection de fluorescence de type micro endoscopie confocale fibrée. Ce travail a permis de mettre en évidence un fort potentiel applicatif né du couplage, ayant été reconnu par le dépôt d’un brevet. De nombreux défis techniques restent sur la voie pour parvenir à un protoype robuste de « dispositif d’empreinte optiquement guidé dans le cerveau », mais nous parvenons à établir la faisabilité et à spécifier le cahier des charges pour un dispositif futur.En conclusion, nous avons pu, au travers de ce travail, préparer la voie pour un élargissement considérable du concept princeps, en intégrant dès les phases amont toutes les contraintes règlementaires pour viser un transfert rapide de ces développements au lit du malade. / Brain diseases today remain poorly understood due to the lack of access to the biological information contained in tissues. As cognitive functions are largely distributed in multiple functionnal areas in the brain, even as the CNS anatomy is complex, mapping and understanding of the molecular processes associated to diseases remain a challenging domain. Getting access to the brain and being able to sample tissues without any damages is a major stake. This is gaining in interest given the fact that neurodegenerative diseases and cancers are exponentially occuring in occidental population, thus becoming a public health problem.Our lab has recently developed, patented and validated an innovative surgical device allowing atraumatic tissue microfragments bioharvesting in the deep brain thanks to the use of silicon chips. This new concept, refered to as "tissue imprints", is under evaluation in a clinical trial dedicated to brain tumors investigation. Nevertheless, some technical and technological bets were to solve for extending that approach in next generations of that device. Thus, this PhD thesis has allowed the development of a new strategy regarding the material, paving the way to a use not only restricted to brain tumours but also for targeting highly functionnal, deep brain nuclei implied in neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease, Parkinson's disease) and even other organs.A porous silicon fabrication process in clean rooms has arised and was fully validated from cell culture to big animals, preparing a clinical transfer of that approach. Additionnaly, in order to increase the accuracy of the surgical procedure, we evaluated the feasibility to couple the device with a fluorescence detection system. This work has highlighted the strong applicative potential of such a device coming from the coupling of both optical detection and molecular harvesting. Fully integrated prototype development will require some adjustments but we now are able to demonstrate that our approach is operationnal and we now can specify all the requirements.As a conclusion, this work constitutes a solid base for a large extension of our primary concept with the overall integration of all the prerequisites for a clinical transfer at patients' bedside.