Le couple CXCL12/CXCR4 joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSPHs) et constitue un axe clé par lequel les niches et les CSPHs communiquent au sein de la moelle osseuse (MO). Des mutations hétérozygotes du gène CXCR4, qui tronquent le domaine C-terminal de la protéine et entraînent un défaut de désensibilisation homologue de CXCR4 et une hypersensibilité à CXCL12, ont été identifiées dans le Syndrome WHIM (SW), une immunodéficience rare caractérisée notamment par une lymphopénie. Les mécanismes sous-jacents de cette anomalie restaient inconnus. Grâce à un modèle murin porteur d’une mutation gain de fonction de Cxcr4 identifiée chez certains patients et phénocopiant la lymphopénie du SW, nous avons exploré la possibilité qu’un défaut de domiciliation, de différenciation ou d’expansion des CSPHs dans la MO soit à l’origine de la lymphopénie circulante. Nous avons mis en évidence que la désensibilisation de Cxcr4 régule la balance quiescence/cycle des CSHs à court terme ainsi que leur différenciation en progéniteurs multipotents et progéniteurs engagés vers le lignage lymphoïde. Nos travaux révèlent donc que la désensibilisation de Cxcr4 est requise à la différenciation lymphoïde des CSPHs et suggèrent que l’absence de ce processus soit à l’origine de la lymphopénie observée chez les souris mutantes et, par extrapolation, chez les patients. Ces altérations lymphoïdes impliquaient à la fois des défauts intrinsèques (CSPHs) et extrinsèques (stroma), ce qui nous a conduit à considérer l’impact de la mutation gain de fonction de Cxcr4 sur le stroma médullaire. Dans ce contexte, l’objectif principal de mon projet de thèse a consisté à investiguer à l’aide du modèle murin du SW le rôle de la désensibilisation de Cxcr4 dans le maintien des composantes mésenchymateuses au sein de la MO. Nos données ont permis de mettre en lumière que la désensibilisation de Cxcr4 est intrinsèquement requise à la régulation de l’équilibre quiescence/cycle des cellules souches mésenchymateuses (CSMs), ainsi qu’à la préservation de leur potentiel ostéogénique en contrôlant l'expression et la biodisponibilité de Cxcl12 de manière autocrine. Par conséquent, nos travaux suggèrent que les actions autocrines et paracrines de l’axe de signalisation Cxcl12/Cxcr4 au sein des CSMs régulent leur différenciation en ostéoblastes tout en contribuant au maintien des niches des CSPHs et au processus d’hématopoïèse. / The CXCL12/CXCR4 signaling axis plays an essential role in the maintenance of hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) homeostasis and constitutes a key pathway through which the niches and HSPCs communicate in the bone marrow (BM). Heterozygous gain-of-function mutations of CXCR4, which engender a truncated receptor and affect its homologous desensitization in response to CXCL12, have been reported in the WHIM Syndrome (WS); a rare immunodeficiency notably characterized by lymphopenia. The mechanisms underpinning this remain obscure. Using a mouse model harboring a naturally occurring WS-linked Cxcr4 gain-of-function mutation, we explored the possibility that the lymphopenia in WS arise from defects at the HSPC level in the BM. We showed that Cxcr4 desensitization is required for proper quiescence/cycling balance of short-term HSCs as well as their differentiation into multipotent progenitors and downstream lymphoid-biased progenitors. Thus, our results suggest that efficient Cxcr4 desensitization is critical for lymphoid differentiation of HSPCs, and its impairment is a key mechanism underpinning the lymphopenia observed in WS mice. The role of Cxcr4 desensitization in regulating such lympho-hematopoiesis process implicated both intrinsic and extrinsic properties, thus raising the question of the impact of a gain-of-Cxcr4-function mutation on BM stroma. Therefore, the main part of my PhD project was dedicated to evaluate using this relevant knock-in model the impact of Cxcr4 desensitization on maintenance of BM mesenchymal elements. We have found unexpectedly that such regulatory mechanism is intrinsically required for regulating quiescence/cycling balance of mesenchymal stem cells (MSCs) and preserving their osteogenic potential through the control of Cxcl12 expression and availability in an autocrine manner. Therefore, these findings support autocrine and paracrine actions of the Cxcl12/Cxcr4 signaling axis within MSCs to regulate osteoblast differentiation while contributing to HSPC niches and hematopoiesis.

RÉSUMÉ en françaisLes systèmes de délivrance de médicaments sont fortement investigués dans le but d’obtenir la meilleure efficacité thérapeutique et la plus faible toxicité possible. De nombreux systèmes existent à l’heure actuelle qu’ils soient mécaniques ou chimiques. Dans ce travail, nous nous sommes tout d’abord intéressés à une nouvelle approche basée sur la macropinocytose pour augmenter l’internalisation d’agents thérapeutiques aussi bien dans des cellules cibles de médicaments que dans des cellules souches mésenchymateuses d’origine musculaire (mdMSCs) actuellement de plus en plus étudiées comme nouveaux systèmes de délivrance. La macropinocytose est en effet une voie d’endocytose clathrine-indépendante permettant l’internalisation non sélective de fluide extracellulaire. Ce processus semble contribuer à l’agressivité des cancers en favorisant leur apport en nutriments, le recyclage de la membrane plasmatique et de ses récepteurs ainsi que l’internalisation d’exosomes. La macropinocytose est déclenchée notamment par l’activation des récepteurs epidermal growth factor receptor (EGFR) et platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) qui sont des marqueurs connus d’agressivité des gliomes. Au cours de ce travail, nous nous sommes demandé si la macropinocytose ne pourrait pas être utilisée pour améliorer l’internalisation d’agents chimiothérapeutiques dans les cellules de glioblastomes. Nous avons tout d’abord montré que l’expression des acteurs clés de la macropinocytose au niveau de leur ARNm est fortement altérée en fonction du grade de la tumeur en utilisant des bases de données publiques d’échantillons de tumeurs gliales humaines. Une « signature » basée sur l’expression de 38 gènes liés à la macropinocytose permet la discrimination des échantillons de glioblastomes, c’est-à-dire des tumeurs les plus agressives. Nous avons ensuite comparé les effets induits par le MOMIPP et le Vacquinol-1, deux inducteurs connus de macropinocytose, à ceux de l’Honokiol qui induit également une vacuolisation sévère au sein de cellules de gliomes. Malgré de fortes similarités morphologiques, l’Honokiol se distingue par l’induction de vacuoles provenant à la fois d’endocytose mais aussi du réticulum endoplasmique. Chacun des trois composés induit néanmoins une nette augmentation de l’internalisation de dextrans de 10 kDa. Le marquage à l’acridine orange suggère pourtant des différences dans le devenir des vacuoles induites par ces trois molécules. Il a récemment été démontré que le MOMIPP agit en empêchant la maturation des macropinosomes ce qui concorde avec notre observation d’une fusion avec les lysosomes qui serait très limitée. Si les trois molécules permettent bien d’augmenter également la concentration de témozolomide (traitement de référence) au sein des cellules de gliomes, leur impact sur l’internalisation de la doxorubicine est plus faible. L’augmentation de l’internalisation des médicaments par l’induction de macropinocytose ne semble donc pas toujours efficace et pourrait dépendre de leurs propriétés physico-chimiques ainsi que de leur voie d’internalisation basale. Étant donné que l’induction soutenue de macropinocytose peut également déclencher la mort cellulaire tant de cellules de glioblastome chimio-sensibles que chimio-résistantes, nous proposons d’envisager la macropinocytose dans des approches combinées pour bénéficier d’une augmentation de l’internalisation de médicaments et d’effets additifs/ synergiques. Comme les cellules souches mésenchymateuses sont intensément étudiées pour leur utilisation en tant que transporteur de médicaments en plus de leur potentiel intrinsèque pour la médecine régénérative, les effets de ces inducteurs de vacuolisation ont également été étudiés sur des mdMSCs. Ces dernières sont caractérisées par un niveau basal de macropinocytose plus élevé que les modèles de gliomes utilisés et elles semblent mieux répondre au Vacquinol-1 qui permet d’ailleurs d’augmenter plus efficacement la concentration intracellulaire en doxorubicine que le MOMIPP, avec une internalisation environ 2 fois plus importante qu’en absence de stimulation. Ces cellules pouvant être utilisées comme véhicule pour le transport de molécules ayant une faible biodisponibilité afin d’améliorer leur usage en clinique, nous avons ensuite évalué l’impact du chargement de mdMSCs avec de la curcumine, un polyphénol naturel bien connu pour ses propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires dont le potentiel clinique reste limité notamment par sa faible solubilité. Pour cette raison, l’utilisation du NDS27, un complexe de lysinate de curcumine et d’hydroxy-propyl-bêta-cyclodextrine qui présente une bien meilleure solubilité dans l’eau, a été préférée. Nous avons observé que l’internalisation de la curcumine, provenant du NDS27, dans les mdMSCs est concentration-dépendante et non temps-dépendante. De plus, elle ne peut pas être augmentée par l’utilisation d’inducteurs de macropinocytose. De plus amples investigations des effets de l’internalisation de la curcumine à partir du NDS27 en fonction de la concentration sur leur viabilité, prolifération, propriétés mésenchymateuses et leur fonction mitochondriale nous ont permis de montrer qu’un chargement de 2 h avec 7 µM de NDS27 était acceptable en vue de préserver la possibilité de bénéficier des mdMSCs en tant qu’agent de thérapie cellulaire régénérative en sus de leur aspect de délivrance. L’investigation du potentiel thérapeutique de telles mdMSCs chargées en curcumine pour traiter l’arthrose chez le cheval est toujours en cours. / SUMMARYDrug delivery systems are highly investigated with the aim to promote the best therapeutic efficacy and the lowest possible toxicity. Nowadays, several systems either mechanical or chemical exist. In this work, we were first interested in studying a new approach based on macropinocytosis to increase the internalisation of therapeutic agents in both target cells of drugs and skeletal muscle-derived mesenchymal stem cells (mdMSCs) currently more and more studied as new deliverance systems. Macropinocytosis is indeed a clathrin-independent endocytosis pathway allowing the nonselective internalisation of extracellular fluid. This process seems to contribute to cancer aggressiveness by favouriting nutrient supply, recycling of plasma membrane and its receptors, and exosome internalisation. Macropinocytosis may notably be triggered by epidermal growth factor receptor (EGFR) and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), two well-known markers of glioma aggressiveness. During this work, we wondered whether macropinocytosis could be used to improve the internalisation of chemotherapeutic agents into glioblastoma cells. We first showed that the mRNA expression levels of key actors of macropinocytosis are strongly altered according to the grade of the tumour using public datasets of human glioma tumour samples. A “signature” based on the expression of 38 macropinocytosis-related gene allows the discrimination of the glioblastoma samples, i.e. the most aggressive tumours. We next compared the effects induced by MOMIPP and Vacquinol-1, two well-known macropinocytosis inducers to those of Honokiol which also induces a severe vacuolisation within glioma cells. Despite high phase-contrast morphological similarities, Honokiol appeared different from the others by the induction of vacuoles from both endocytosis and endoplasmic reticulum origins. Each of the three compounds nevertheless induces a marked increase in 10 kDa dextran internalisation. Acridine orange staining however suggested differences in the fate of vacuoles induced by those three molecules. MOMIPP has recently been shown to prevent the macropinosomes maturation which is consistent with our observation ofthe lack of acridine orange staining of the vacuoles that may be attributed to a limited fusion with lysosomes. Although each of the three compounds allows nevertheless a marked increase of temozolomide (i.e. first-line treatment) concentration into glioma cells, their impact on the internalisation of doxorubicin is poor. The increased internalisation of drugs by inducing macropinocytosis does not seem to be always efficient and could depend on their physicochemical properties and their basal way of internalisation. Considering that sustained macropinocytosis induction may also trigger cell death of both chemo-sensitive and chemo-resistant glioblastoma cells, we proposefor future perspectives to consider macropinocytosis in combination approaches to benefit from an increased drug uptake and additive/synergistic effects. As mesenchymal stromal / stem cells are increasingly studied for their use as drug-carrier in addition to their intrinsic potential for regenerative medicine, the effects of these vacuolisation inducers were also studied on mdMSCs. These lasts are characterised by a higher basal level of macropinocytosis than the glioma models used in this work. They seem to better respond to Vacquinol-1 which allows to increase more efficiently the intracellular concentration of doxorubicin than MOMIPP, with an uptake approximatively 2-fold higher than without stimulation. Given that these cells can be used as vehicle to transport molecules with a poor bioavailability in order to improve their clinical usage, we evaluated the impact of the loading of mdMSCs with curcumin, a natural polyphenol well-known for its antioxidant and anti-inflammatory properties whose clinical potential remains limited notably by reason of its poor solubility. Therefore, the use of NDS27, a complex of curcumin lysinate and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin displaying an increased solubility in aqueous solution, was preferred. We observed that the uptake of curcumin from NDS27 into mdMSCs is concentration-dependent and not time-dependent. Moreover, it cannot be improve using macropinocytosis inducers. Further investigations of the effects of curcumin internalisation from NDS27 depending on the concentration used on their viability, proliferation, mesenchymal properties and their mitochondrial function allowed us to show that a loading of 2 h with NDS27 at 7 µM seems acceptable to preserve the possibility to benefit from mdMSCs as a cellular therapy agent in addition to the delivery aspect. The investigation of the double potential therapeutic benefits of such curcumin-loaded mdMSCs to treat osteoarthritis in horses is still ongoing. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'utilisation grandissante des cellules souches mésenchymateuses (CSM) en ingénierie tissulaire augmente la nécessité d'améliorer leur expansion. Ces travaux ont concerné l'étude d'un procédé performant d'expansion de CSM porcines en mode agité. Tout d'abord, un milieu de culture a été adapté aux CSM porcines multipotentes. Puis, différents modes d'expansion en conditions agitées ont été évalués avec les cellules fixées sur des microporteurs. La culture sur le microporteur Cytodex 1 a permis d'atteindre une vitesse spécifique de croissance de 0,54 j-1, supérieure à celle observée en flacon statique (0,31 j-1), avec les mêmes conditions de culture. En parallèle, une méthode de comptage innovante a été proposée pour le dénombrement automatique des cellules cultivées sur Cytodex 1, sans passer par une étape de trypsination. Enfin, les conditions opératoires du procédé d'expansion ont été étudiées. En comparaison d'une culture de CSM sur Cytodex 1 sans agitation, une agrégation des cellules et une baisse apparente de la concentration cellulaire ont été observées à 25 et 75 rpm. Par ailleurs, l'ajout de microporteurs au cours d'une culture de 300 h, réalisée dans un système de culture agité à 25 rpm et dans un volume de 200 mL, a permis de prolonger la prolifération cellulaire en évitant l'agrégation tout en maintenant la multipotence des CSM. Une concentration cellulaire de 3 x 105 cellules/mL a été obtenue, au lieu de 1,2 x 105 cellules/mL en flacons statiques avec les mêmes conditions de culture. Un procédé performant d'expansion de CSM porcines en conditions agitées a ainsi pu être proposé / The extensive use of mesenchymal stem cells (MSC) in tissue engineering increases the necessity to improve the expansion performance. This work aimed at studying an efficient expansion process for porcine MSC in agitated mode. First, a culture medium was adapted to the multipotent porcine MSC. Then, various expansion modes and agitation conditions were evaluated with the cells fixed on microcarriers. Cultures on the Cytodex 1 microcarrier enabled to reach a specific growth rate of 0.54 d-1, which was higher than the one observed in static T-flasks (0.31 d-1), with the same culture conditions. In parallel, an innovative counting method was proposed for the automatic enumeration of cells cultivated on Cytodex 1, without passing by a trypsination step. Finally, the operating conditions of the expansion process were studied. Compared to a culture of MSC on non-agitated Cytodex 1 microcarriers, cell aggregation occurred and an apparent decrease in the cell concentration was observed at an agitation rate of 25 and 75 rpm. Moreover, the addition of microcarriers during a 300 h culture, performed in an agitated culture at 25 rpm and in a volume of 200 mL enabled to prolong the cell proliferation without any aggregation, while maintaining the multipotency of the cells. A cell concentration of 3 x 105 cells/mL was obtained, instead of the 1.2 x 105 cells/mL in static flasks with the same culture conditions. An efficient expansion process for porcine MSC under agitated conditions has therefore been proposed

La thérapie cellulaire pour le traitement de l'insuffisance cardiaque post-infarctus semble prometteuse même si le bénéfice fonctionnel observé actuellement en recherche clinique reste souvent limité. Parmi les différent types cellulaires utilisables, les cellules souches mésenchymateuses (MSC) reconnues pour leur capacité d'immunomodulation, de transdifférenciation et de sécrétion paracrine représentent un outil intéressant pour la régénération myocardique.L'objectif de ce travail a été de mieux comprendre les mécanismes mis en place par les MSC pour réparer le myocarde lésé afin de développer ensuite une stratégie visant à optimiser les effets thérapeutiques de la greffe de MSCs dans le cadre expérimental de l'insuffisance cardiaque post-infarctus. Pour cette étude, nous avons réalisé des cocultures entre cardiomyocytes adultes et les MSC dérivées du tissu adipeux, les cellules hMADS (human Multipotent Adipose Derived Stem cells) afin de mimer le microenvironnement cardiaque in vitro. Des travaux antérieurs à ma thèse réalisés au laboratoire avaient montré que la communication intercellulaire entre ces deux types cellulaires grâce à des structures nanotubulaires aboutissait à la reprogrammation du cardiomyocyte vers le stade progéniteur. Durant ma thèse, nous avons ensuite pu montrer in vitro, toujours grâce au système de coculture, que ce meme type de communication hetérologue via des connexions nanotubulaires constituées de f-actine et de tubuline, modifiait la sécrétion paracrine des cellules souches hMADS. Les cellules souches ainsi reprogrammées, par les échanges intercellulaires de matériel cardiaque améliorent de façon significative leur potentiel angiogénique et de chémoattraction in vitro. Le bénéfice sur les MSCs de la coculture a été confirmé dans le traitement de l'insuffisance cardiaque post-infarctus chez la souris. Dans ce modèle nous avons pu montré que les cellules souches cocultivées avaient un capacité de régénération myocardique nettement supérieures aux cellules souches naives et que l'amélioration fonctionnelle était associée à une stimulation de la vascularisation et de la mobilisation des progéniteurs cardiaques endogènes. Enfin, des résultats similaires ont été observés dans notre modèle préclinique d'ischémie-reperfusion myocardique porcin encourageant la poursuite des travaux de recherche basés sur la communication intercellulaire afin d'optimiser l'efficacité thérapeutique des cellules souches dans la reconstruction cardiaque..En conclusion, nos travaux ont mis en évidence que la communication intercellulaire entre les cardiomyocytes souffrants et les cellules souches conditionnent de façon importante les effets thérapeutiques des cellules souches et que la manipulation ex vivo de ces phénomènes pourrait constituer une approche pour optimiser la thérapie cellulaire cardiaque chez l'homme. / Cell therapies represent one of the most promising approaches to rebuild damaged heart particularly those based on mesenchymal stem cells (MSC). These cells are known for their plasticity, immune privilege and strong self-renewal ability. Intramyocardial delivery of MSC ameliorates heart function after infarction in clinical studies but mechanisms by which MSC exert their therapeutic action is far from being understood and further investigations are required for improving the modest efficiency observed.The objective of this work was to better understand mechanisms by which MSC repair damaged myocardium in order to develop strategies optimizing their therapeutic effects. To mimic in vitro the microenvironment of an injured heart, we developed a species mismatch co-culture system consisting of terminally-differentiated cardiomyocytes (CM) and MSC from adipose tissue called hMADS for human Multipotent Adipose Derived Stem cells. Previous works in the laboratory showed that cell-to-cell communication processes between CM and hMADS involving tunnelling nanotubes (TNT) reprogram adult CM toward a progenitor-like state.During my PhD, we found that crosstalk between hMADS and CM through TNT altered the secretion by hMADS of cardioprotective soluble factors and thereby maximized the capacity of stem cells to promote angiogenesis and chemotaxis of bone-marrow multipotent cells. Additionally, engraftment experiments into mouse infracted hearts revealed that in vitro preconditioning of hMADS with CM increased the cell therapy efficacy of naive stem cells. Functional improvement was associated with higher angiogenesis and homing of bone marrow progenitor cells at the infarction site. Finally, similar results were observed in our preclinical study using a porcine model of myocardial infarction.In conclusion, our findings established the relationship between the paracrine regenerative action of MSC and the nanotubular croostalk with CM and emphasize that ex vivo manipulation of theses communication processes might be of interest for optimizing current cardiac cell therapies.

Le cartilage articulaire est composé de chondrocytes et d'une matrice extracellulaire organisés de manière stratifiée dans l'épaisseur du tissu. Ce tissu ne se régénère pas de manière efficace après une lésion. L'objectif de ce travail est de construire par pulvérisation des hydrogels à base d'alginate et de film multicouches de polyélectrolytes pour créer in vitro un néotissu pouvant combler des lésions de cartilage articulaire. La méthode a été validée en observant une bonne viabilité et une synthèse matricielle par les cellules, et de meilleures propriétés mécaniques des hydrogels pulvérisés à 0,9 bar par rapport au moulage. Après la pulvérisation de cellules souches mésenchymateuses, les résultats ont montré une bonne viabilité et une différenciation des cellules. Puis, des hydrogels bistratifiés ont été construits et cultivés jusqu'à 56 jours sans dissociation des couches et sans migration des cellules. Enfin, les hydrogels ont été fonctionnalisés en modifiant la composition des couches et en y appliquant des stimulations mécaniques. Les propriétés mécaniques des hydrogels varient en fonction de leur composition et sont meilleures pour ceux stratifiés. De plus, leur stimulation mécanique a permis de potentialiser l'effet du biomatériau sur la différenciation des cellules. En conclusion, cette étude montre que des cellules souches mésenchymateuses ensemencées dans un hydrogel bistratifié pulvérisé sont fonctionnelles en termes de différenciation chondrocytaire et de synthèse matricielle. Les propriétés mécaniques des hydrogels stratifiés ne sont pas altérées. De plus, la stimulation mécanique a potentialisé la différenciation des cellules / The articular cartilage is composed of chondrocytes and of a specific extracellular matrix which are organized depth-dependently. The tissue did not have an efficient self-renewal of defects. The purpose of this study is to build up layer-by-layer a stratified hydrogel by alternating gels and multilayers polyelectrolytes film spraying, in order to obtain a neotissu in vitro to fill lesions. First, the process was validated by observing a good cells viability and matrix synthesis, and stronger mechanical behaviors of sprayed hydrogels compared to molded one. Secondly, after their spraying, mesenchymal stem cells still have a good viability and their differentiation potential. Then, bistratified scaffolds were built up and cultured up to 56 days without layers dissociation and without cells migration between layers. Finally, scaffolds were functionalized by changing biomaterial composition and by applying mechanicals stimulations. Results show us not only that the composition influences the mechanical behavior of the hydrogel, but that the stratification did not affect it. Furthermore, mechanicals stimulations improve stem cells differentiation in function of biomaterials compositions. In conclusion, this study proves not only that we are able to build up stratified scaffold seeded with mesenchymal stem cells which still have their differentiation capability and synthesize matrix, but that mechanical behaviors are improved after the biomaterial spraying and not alter by the stratification. Moreover, mechanical stimulation applied to the scaffold improves the differentiation of mesenchymal stem cells to a chondrogenic phenotype

En ingénierie tissulaire, les biomatériaux, les cellules et l'induction de la différenciation, sont des facteurs à prendre en compte. L'objectif de cette étude est de connaitre l'effet de la nature des biomatériaux et leurs propriétés mécaniques sur la différenciation des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse. Dans un premier temps, nous avons étudié l'effet d'un biomatériau de nature protéique (le collagène de type I) supplémenté en microparticules d'hydroxyaptatite (HAP). Nous avons constaté que l'ajout d'HAP améliore les propriétés mécaniques de ce biomatériau et engage la différenciation des cellules vers des phénotypes ostéoarticulaires. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'effet d'un biomatériau à base d'alginate supplémenté par de l'acide hyaluronique ou des microparticules d'HAP, en utilisant un plan d'expériences pour choisir les matrices convenables pour l'étude biologique en fonction de leurs propriétés mécaniques. Nous avons constaté que les composants de ce biomatériau ont un effet sur l'élasticité de ce dernier et sur la différenciation des cellules souches mésenchymateuses. En conclusion, cette étude montre que les cellules souches mésenchymateuses sont sensibles à la composition du biomatériau et ses propriétés mécaniques / In tissue engineering, biomaterials, cells and the induction of cell differentiation are factors to be studied. The aim of this study is to know the effect of biomaterials composition and mechanical properties on the differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow. At first, we studied the effect of a protein biomaterial (collagen type I) supplemented with hydroxyaptatite (HAP) particles. We found that the addition of HAP improves the mechanical properties of the biomaterial and conditione cell differentiation towards osteoarticular lineages. In a second step, we studied the effect of biomaterial composed of alginate supplemented with hyaluronic acid or HAP particles, using an experimental design to select suitable matrices for biological study based on their mechanical properties. We found that the components of this biomaterial have an effect on elasticity of the latter and the differentiation of mesenchymal stem cells. In conclusion, this study shows that mesenchymal stem cells are sensitive to the composition of the biomaterial and its mechanical properties

Il existe plus de 100 formes de pathologies hépatiques causées par divers facteurs et touchant une grande quantité de personnes. Mais, le seul traitement pour les maladies du foie en phase terminale est la greffe du foie. Cependant, la greffe de foie échoue souvent à cause du déficit en donneurs hépatiques. Récemment, une nouvelle alternative innovante pour traiter les maladies du foie apparaît : les organes auto-construits. En ingénierie tissulaire du foie, la source de cellules, l’échafaudage décellularisé du foie et les bioréacteurs, sont des facteurs à prendre en compte. L’objectif de ce travail de thèse est d’étudier deux étapes nécessaires au développement d’un foie artificiel : les cellules et la décellularisation de l’organe. Tout d’abord, nous avons prélevé et caractérisé les cellules souches mésenchymateuses de la gelée de wharton (CSMs-GW) CSMs-GW et nous avons étudié leur potentiel de différenciation en hépatocytes. La deuxième étape du travail est consacrée à la décellularisation du foie. Nous avons obtenu des scaffolds acellulaires par la perfusion continue avec du SDS 1% et triton-X100 1%. En conclusion, cette étude montre la capacité de CSM-GW de se différencier en hépatocytes et la faisabilité de la décellularisation du foie. Ceci ouvre des perspectives intéressantes pour le développement d’un foie artificiel et le traitement des pathologies hépatiques / There are over 100 forms of liver diseases caused by various factors and affecting a lot of people. Unfortunately, the only treatment of a terminal liver disease is liver transplantation. However, liver transplantation often fails because of the deficit in human liver donors. Recently, a new innovative alternative for treating end-stage liver disease appears: self-built organ. In liver tissue engineering the source of cells, the decellularized liver scaffold and circular culture bioreactor, are essential factors to be taken into account. The objective of this thesis is to study two steps needed for the development of an artificial liver : cells and organ decellularization. In the first stage, we collected and characterize Wharton’s-Jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSCs), and their differentiation potential into hepatocytes. In the second stage of the work, we developed a method for liver decellularization. We were able to get acellular scaffolds by continuous perfusion with 1% SDS and Triton X100 1%. In conclusion, this study shows the capability of WJ-MSC to be differentiated into hepatocytes and the feasibility to obtain acellular livers. That open perspectives toward the development of an artificial liver and the treatment of liver diseases

Le développement du séquençage ARN, ou RNAseq, a permis l'essor de la recherche intensive de biomarqueurs dans de nombreux domaines de la biologie. L’information complète du transcriptome contenue dans les données de sorties, permet à un bioinformaticien assidu de dépasser les connaissances actuelles et d’accéder, grâce à des pipelines informatiques avancés, à d’innombrables signatures d’intérêts inédites. Dans cette thèse nous mettons en avant que ces marqueurs potentiels, essentiellement explorés pour répondre à des problématiques clinique en conditions pathologiques, peuvent être utilisés pour affiner la caractérisation de types de cellules sans marqueurs strictement spécifiques. Nous nous sommes intéressés aux cellules souches mésenchymateuses (MSCs), un type de cellules souches adultes multipotentes, fortement utilisées en clinique mais ne possédant pas de marqueurs positifs strictement spécifiques.Notre étude se concentre sur la recherche des ARN longs non-codants non annotés. Ces ARNs, aussi nommés "lncRNA", constituent une classe émergente de transcrits encore peu explorée à ce jour. De plus, cette catégorie démontre une spécificité conditionnelle et tissulaire élevée. Nous avons élaboré un pipeline d’analyse RNAseq optimisé pour la reconstruction et la quantification de lncRNAs non annotés.En utilisant les données publiques de RNAseq, venant de différentes sources de MSCs et d'autres types de cellules, nous avons identifié de nouveaux lncRNA non annotés exprimés spécifiquement dans les MSCs.Nous avons développé pour ce projet Kmerator.jl, un outil qui permet de décomposer un transcrit en sous séquences spécifiques (k-mers) afin de chercher et quantifier plus rapidement la signature de nos candidats dans un grand nombre de données RNAseq. Kmerator a également été utilisé dans d'autres applications pour tester la qualité des données RNA-seq disponibles en accés public.Après validation de ces nouveaux biomarqueurs de MSCs par qPCR, nous avons eu recours à plusieurs outils informatiques pour prédire leurs fonctions potentielles. Enfin, nous avons analysé des données RNAseq « single-cell » pour aborder l’hétérogénéité d’expression au sein des populations MSCs. / The development of RNA sequencing, or RNAseq, have opened the path of intensive biomarkers research in many areas of biology. The complete information of the transcriptome contained in the output data, allows a bioinformatician to surpass the current knowledge and to access, thanks to advanced computer pipelines, to signatures of new interest. In this thesis, we are showing that these potential markers, classically used in clinical and pathological conditions, can be used to characterize cell types without extensive markers profile. We have studied mesenchymal stem cells, a type of adult multipotent stem cells, strongly used in clinics but without strickly specific positive markers. Our study mainly focuses on the search for non-annotated, long non-coding RNAs. These RNAs, also called "lncRNA", constitute an emerging class of transcripts and are still lightly explored.In addition, this category presents a highly tissue-related specificity. We have developed an optimized RNAseq pipeline for the reconstruction and quantification of non-annotated lncRNAs.Using public data from RNAseq, coming from different sources of MSC and other cell types, we have identified new non-annotated lncRNAs clearly and specifically expressed in MSCs. to complete this project, we developed Kmerator.jl, a bioinformatical tool that allows to decompose a transcript in k-mer, and select specific sub-sequences, in order to search and quantify at a faster rate the signature of our candidates in a large number of RNAseq dataset. After validation of these new biomarkers of MSCs by qPCR, we used several computer tools to predict their potential functions. Finally, we analyzed single-cell RNAseq data to address the heterogeneity of expression within MSC populations.

Trop souvent diagnostiqués à des stades tardifs du fait de leur quasi asymptomatie, les adénocarcinomes séreux ovariens posent un véritable problème de santé publique. Malgré les progrès récents de prise en charge chirurgicale, l’émergence d’une maladie résiduelle microscopique chimiorésistante impacte grandement le pronostic des patientes.Le microenvironnement tumoral est un acteur clé de la progression tumorale et de l’émergence de résistances aux traitements anticancéreux. Durant ces travaux de thèse, nous nous sommes intéressés à deux composants majeurs du stroma tumoral, d’une part les cellules souches mésenchymateuses, d’autre part les cellules endothéliales.Nous avons pu démontrer que les cellules souches mésenchymateuses participent à la progression tumorale et l’émergence de résistances. Enfin nous avons démontré que les cellules endothéliales, via la production de facteurs angiocrines, participent à la chimiorésistance des cellules tumorales ovariennes.Dans ce travail, nous avons pu définir de nouvelles cibles thérapeutiques mettant en jeu la relation entre les cellules tumorales ovariennes et l’hôte. / Ovarian cancers constitute a poor prognosis disease. Due to their absence of symptoms, ovarian cancers are generally diagnosed at late stages. Despite major breakthrough regarding ovarian cancer surgery, minimal residual disease-induced relapse is still a hurdle for clinicians.Tumor microenvironment is a key actor on disease progression and resistance to therapy. In this study, we have focused on two major components of the tumor stroma, on one hand, the mesenchymal stem cells, and the endothelial cells on the other hand.We were able to demonstrate that mesenchymal stem cells are critically involved in ovarian cancer progression and resistance to therapy, while the endothelium, through production of angiocrine factors, is deeply involved in resistance of ovarian cancer cells to platinum and taxane based therapy.Here, we set forth the idea that disrupting the relationship between ovarian cancer cells and their host stroma constitute a new therapeutic window.

Les fibrocartilages sont des tissus repartis largement dans l'organisme dont la structure histologique est étroitement liée à la fonction. Ils jouent un role fondamental dans la transmission des forces de compression ou de traction et sont un composant majeur de l' appareil musculo‐squelettique. Parmi les différents fibrocartilages se dégage l'enthèse qui vient attacher les tendons autour des articulations et dont le vieillissement aboutit à un arrachement des tendons. Afin d'étudier les possibilités thérapeutiques, nous avons developpé chez le petit animal, un modèle de lésion de l'enthèse qui se veut proche du vieillissement, afin de recréer un modèle translationnel le plus proche possible de la réalité clinique, ce modèle nous permettant d'évaluer le taux global de cicatrisation. Le modèle que nous avons développé nous a permis d'obtenir un taux de cicatrisation, après réparation chirurgicale d'une lésion de l'enthèse du tendon de rat, un taux de cicatrisation proche de celui obtenu en pratique clinique. En injectant, lors des réparations chirurgicales, des chondrocytes dans un groupe, et des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse dans l'autre nous avons montré une différence statistiquement significative en terme de taux global de cicatrisation, de résistance à l'arrachement, et de regénération histologique de l'enthèse à 45 jours