O esgotamento das reservas, especialmente do petróleo mais fino, aliado à crescente demanda energética e à necessidade inadiável de reduzir as emissões de carbono para a atmosfera, sinalizam para a necessidade da busca de novas fontes de energia renováveis e limpas. As preocupações com o aquecimento global têm feito crescer o interesse mundial pelos biocombustíveis. O novo conceito de biocombustíveis de segunda geração corresponde à produção de etanol combustível a partir de biomassa lignocelulósica como matéria-prima. No entanto, para tornar possível a utilização da biomassa é necessária a conversão das moléculas constituintes da parede celular em açúcares fermentáveis. A tecnologia mais promissora para a conversão dessa biomassa lignocelulósica à etanol combustível é com base na hidrólise enzimática da celulose usando celulases. Alguns microrganismos como o fungo Trichoderma SSP. secretam um eficiente complexo enzimático de celulases. Tendo as celobiohidrolases, elevada importância na hidrólise primária da celulose, o objetivo desse trabalho foi realizar a caracterização bioquímica e biofísica a celobiohidrolase II (CBHII) do complexo de celulases do fungo filamentoso Trichoderma harzianum IOC 3844. A enzima depois de purificada mostrou uma melhor atividade contra o substrato pNPC a 60°C em pH 4,8. Estudos de eletroforese capilar mostraram apenas moléculas com uma unidade de glicose para um substrato simples inicial contendo 5 glicoses. Análises de dicroísmo circular mostraram um padrão de estrutura secundária predominante em alfa hélice, e na análise da estrutura terciária, o espectro de emissão da CBHII mostrou um comprimento de onda de fluorescência máxima a 333nm em pH5,0, indicando que os triptofanos estão parcialmente expostos ao solvente. Ensaios utilizando a técnica de espalhamento de luz a baixo ângulo, permitiram a geração de um modelo tridimensional o qual mostrou-se domínios globulares unidos por um linker, e as posições relativas entre eles, demonstrando grande similaridade com enzimas CBHII já descritas na literatura, e sendo assim, de grande interesse biotecnológico para hidrólises de biomassas. / The depletion of reserves, especially of refined oil , with increased energy demands and the urgent need to reduce the carbon emissions on the atmosphere, signals the necessity to search for new sources of energy renewable and clean. Concerns about global warming have led to an increased world interest in biofuels. The new concept of second generation biofuels corresponds to fuel ethanol production from biomass lignocellulosic feedstock. However, to make possible the use of biomass is necessary the conversion of cell-wall molecules into fermentable sugars. The most promising technology for the conversion of lignocellulosic biomass to ethanol fuel is based on the enzymatic degradation of cellulose using cellulase. Some microorganisms such Trichoderma ssp. secretes an efficient enzymatic complex of cellulase. Since the cellobiohydrolases are highly importance in the primary hydrolysis of cellulose, the objective of this study was to perform the biochemical and biophysical characterization of cellobiohydrolase II (CBHII) present into the cellulase complex from the Trichoderma harzianum IOC 3844. The enzyme showed its better activity against pNPC at 60°C and pH 4,8. Capillary electrophoresis showed only glucose molecules as the final product of C5 oligosaccharide hydrolysis. Circular dichroism analysis showed a pattern of secondary structure mainly composed of alpha helix, and the tertiary structure analysis by the emission spectrum of the CBHII showed a wavelength of maximum fluorescence at 33nm at pH 5, indicating that the tryptophans are exposed to solvent. The three dimensional model generated by SAXS showed a structure with two globular domains joined by a linker, and the relative positions among them exhibited great similarity with CBHII described on the literature, and thus, presenting a great biotechnological interest for hydrolysis of biomass.

Orientador : Helia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T11:29:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fleuri_LucianaFrancisco_M.pdf: 5945832 bytes, checksum: 5ab1eb6f9e401508de39c0e1711f5aba (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O presente trabalho visou o estudo da produção de b-1,3 glucanases, proteases líticas e quitinases pelas linhagens B1, B22, B26, FXX, Oerskovia sp. n04 e Celulomonas cartae nO191 em meios de cultura contendo diferentes indutores e aplicação na lise de leveduras. Entre as bactérias testadas as linhagens B26 e Cellulomonas cartae nº191 apresentaram maior produção de protease em meio de cultura TI composto de 8% de levedura seca instantânea; as linhagens Bl e C. cartae nº191 apresentaram maior produção de b-1,3 glucanase em meio de cultura m contendo 1% de parede celular de levedura extraída mecanicamente em Dyno- Mill; e a linhagem C. cartae nº191 apresentou maior produção de quitinase em meio de cultivo N contendo 1,5% de quitina neutralizada. Os sobrenadantes dos meios de cultura obtidos da fermentação das linhagens B1 e C. cartae nº191 cultivadas em meio de cultivo m mostraram maior atividade de lise de levedura. No estudo do fracionamento das enzimas líticas, a saturação do sobrenadante do meio de cultura com 60% de sulfato de amônio, foi adequada para a precipitação e obtenção de protease, b-1,3 glucanase e quitinase. As preparações de b-1,3 glucanase das linhagens B1 e C. cartae n °191 obtidas do sobrenadante do meio de cultura através de fracionamento com sulfato de amônio, apresentaram atividade de lise das leveduras Kluyveromyces lodderi, Saccharomyces cerevisiae (levedura de panificação Fleischmann), Saccharomyces cerevisiae (levedura de panificação Itaiquara) e sobre as linhagens "killer" Saccharomyces cerevisiae KL-88, Saccharomyces diastaticus NCYC 713, Saccharomyces cerevisiae NCYC 1001, Candida glabrata NCYC 388, Kluyveromyces marxianus NCYC 587 e Hansenula mrakii NCYC 500. As linhagens K marxianus NCYC 587 e H. mrakii NCYC 500 mostraram-se mais sensíveis à ação das b-1,3 glucanases e as linhagens de levedura ltaiquara e C. glabrata NCYC 388 mostraram-se mais resistentes à ação das b-1,3 glucanases, quando comparada com a susceptibilidade das células da linhagem de S. cerevisiae KL-88 à preparação enzimática. A adição da preparação de quitinase, obtida do sobrenadante do meio de cultura através de ftacionamento com sulfato de amônio, da linhagem C. cartae nº191, em alguns casos aumentou a susceptibilidade das leveduras à lise celular. O pré-tratamento das suspensões das leveduras com as preparações de protease obtidas dos sobrenadantes dos meios de culturas através de fracionamento com sulfato de amônio, da linhagem C. cartae nº191, diminuiu a lise da leveduras principalmente quando utilizada em altas concentrações. A maior produção de b-1,3 glucanase da linhagem C. cartae nº191 em meio de cultura m ocorreu a 35°C após 48 horas de fermentação a 200 rpm, entretanto, atividade de b-1,3 glucanase muito próxima foi obtida na fermentação do microrganismo a 30°C durante 24 horas. A maior produção de protease da linhagem C. cartae nO191 em meio de cultura II ocorreu a 35°C após 30 horas de fermentação a 150 rpm, enquanto que a maior produção de quitinase da linhagem C. cartae nO191 em meio de cultura N ocorreu a 35°C após 72 horas de fermentação a 150 rpm. No estudo das superfícies de respostas e das curvas de contorno referentes ao planejamento fatorial completo, foi obtido maior atividade de lise da levedura S. cerevisiae KL-88 utilizando-se a preparação enzimática de _-1,3 glucanase em pH 6,5 e a 35°C. As células de leveduras obtidas após 10 horas de fermentação em frascos sem agitação mostraram-se mais susceptíveis à lise pela b-1,3 glucanase de C. cartae nº191. Foi obtido maior lise da levedura S. cerevisiae KL-88 quando a suspensão de células da levedura foi submetida ao tratamento com b-1,3 glucanase e cisteína 1mM. A enzima invertas e intracelular ou ligada à célula de S. cerevisiae KL-88 e K marxianus NCYC 587 foi extraída após tratamento da suspensão celular de levedura com b-1,3 glucanase da linhagem C. cartae nº191. O tratamento prévio das células de S. cerevisiae KL-88 e K marxianus NCYC 587 com a enzima b-1,3 glucanase da linhagem C. cartae nº191, aumentou a susceptibilidade das células de levedura à lise com ultra-som / Abstract: The aim of this work was the study of b-1,3 glucanases, proteases and chitinases production by B1, B22, B26, FXX, Oerskovia sp. nO4 and Cellulomonas cartae nº191 strains in culture media containing differents inductors as well as their application on yeast cell lysis. The strains B26 and Cellulomonas cartae nO191 showed highest protease production using the culture medium II containing 8% of instant yeast. The strains Bl and C. cartae nº191 showed highest b-1,3 glucanase production using the culture medium III containing 1% of yeast cell wall obtained by Dyno-Mill. The strain C. cartae nº191 showed highest chitinase production using the culture medium IV containing 1.5% of chitin neutralized. The culture medium III supernatants obtained by fermentation of strains B1 and C. cartae nº191 demonstrated the biggest yeast cell lysis activity. The enzymes precipitation studies revealed that 60% ammonium sulphate was the best concentration for protease, b-1,3 glucanase and chitinase separation. The b-1,3 glucanase extract obtained by Bl and C. cartae nº191 strains demonstrated lysis activity against Kluyveromyces lodderi, Saccharomyces cerevisiae (yeast Fleischmann), Saccharomyces cerevisiae (yeast Itaiquara), Saccharomyces cerevisiae KL-88, Saccharomyces diastaticus NCYC 713, Saccharomyces cerevisiae NCYC 1001, Candida glabrata NCYC 388, Kluyveromyces marxianus NCYC 587 and Hansenula mrakii NCYC 500. K. marxianus NCYC 587 and H mrakii NCYC 500 were more sensitive to b-1,3 glucanases action, whereas Itaiquara yeast and C. glabrata NCYC 388 were more resistant when compared with S. cerevisiae KL-88 susceptibility. The chitinase extract obtained by C. cartae nO191, in some cases increased the susceptibility of yeast to cellular lysis. The previous treatment of the yeast suspensions with protease from C. cartae nº191, decreased the yeasts cell lysis, mainly when used at high concentrations. The maximum b-1,3 glucanase production by C. cartae nº191, using culture medium III, occurred after 48 hours of fermentation at 35°C and 200 rpm. However, when the fermentation was perform after 24 hours of fermentation at 30ºC and 200 rpm, the b-1,3 glucanase activity obtained was almost the same. The maximum protease production by C. cartae nº191, using culture medium II, occurred after 30 hours of fermentation at 35ºC and 150 rpm, while the highest chitinase production by C. cartae nº191, using culture medium IV, occurred after 72 hours of fermentation at 35°C and 150 rpm. The experimental design study showed that the best conditions to S. cerevisiae KL-88 lysis by b-1,3 glucanase extract were pH 6,5 and 35°C. This study also demonstrated that the yeast cells were more susceptible to lysis after 10 hours cultivation in flasks without agitation. Lysis activity was increased when S. cerevisiae KL-88 cell suspension was treated b-1,3 glucanase and cystein 1mM. The enzyme invertase of S. cerevisiae KL-88 and K marxianus NCYC 587 was extracted after treatment of cell suspension with b-1,3 glucanase obtained from C. cartae nº191. The previous treatment of S. cerevisiae KL-88 and K marxianus NCYC 587 with b-1,3 glucanase, increased the susceptibility to lysis when ultrasonic treatment was used. / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-01-28Bitstream added on 2014-06-13T20:40:52Z : No. of bitstreams: 1 corabiadell_c_dr_rcla.pdf: 6736961 bytes, checksum: 2fe0d3faffabe9123c2196abfd1b12ec (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A diversidade do gênero Trichoderma no estado de São Paulo (BRASIL) foi analisada sob diferentes aspectos. Foi estabelecida uma coleção de 539 linhagens obtidas a partir de 52 pontos de coleta, distribuídos pelo estado, e uma coleção de referência com 30 linhagens. Durante o período de trabalho avaliou-se a viabilidade das culturas de acordo com os métodos de preservação utilizados Castellani e câmara fria. As avaliações do potencial de biocontrole pelas técnicas de pareamento e difusão de metabólitos inibidores não apresentaram uma correspondência clara com os testes em casa de vegetação. Para as observações microscópicas de culturas de lâminas foi desenvolvida uma técnica que permitiu visualizar mais facilmente o sistema de ramificação dos conidióforos. A avaliação celulolítica dos isolados permitiu identificar linhagens com atividade superior a da linhagem de referência, indicando alto potencial biotecnológico. A análise molecular dos isolados a partir do seqüenciamento da região ITS1-5,8S-ITS2 mostrou a ocorrência de 17 espécies distribuídas no estado, sobretudo nas áreas de mata e capoeira. As espécies mais freqüentes, T. harzianum, T. spirale e T. koningii ocorreram em quase todos os ecossistemas avaliados, enquanto a ocorrência da seção Longibrachiatum foi pouco expressiva. A técnica de RAPD se mostrou eficiente na identificação de linhagens redundantes indicando seu potencial de uso durante procedimentos de triagem. A aplicação de métodos de taxonomia numérica permitiu gerar fenogramas e gráficos multidimensionais coerentes com os dados morfológicos e moleculares em diversos casos. É sugerida a aplicação de métodos topológicos para a melhor descrição do sistema de ramificação e diferenciação de hifas e da teoria de sistemas não-lineares para a compreensão do seu comportamento morfológico in e ex vitro... / The diversity of the genus Trichoderma in São Paulo State (BRAZIL) was analised under different views. A collection of 539 strains was isolated from 52 different areas and a reference collection of 30 strains was established from different brazilian culture collections. The preservation techniques of Castellani and cold storage were evaluated during the course of the study. The biocontrol potential was evaluated through pairing cultures methodology and inhibitory metabolites production. There was no clear evidence of correspondence between the data obtained in vitro and under greenhouse conditions. For microscopic observation a new technique of slide culture was developed in order to visualise the branching system easily. Cellulolytic activitiy assay identified several high-producing cellulase strains comparing to the reference QM9414 indicating a biotechnological potential. The molecular analysis from the sequencing of ITS1-5,8S-ITS2 region indicated the ocurrency of 17 different species all over the state with predominance in forest and 'capoeira' ecossystems. The most frequently species were T.harzianum, T.spirale and T.koningii, ocurring in almost all environmental conditions sampled, while the presence of section Longibrachiatum was inexpressive. The RAPD technique in separate redundants strains was demonstrated indicating its potential for using in screening procedures. Numerical taxonomy methods produced phenograms and multidimensional graphics consistent with molecular and morphological data in some cases. The use of topological methods in describing the branching system and the non-linear system theory in the comprehension of its morphological behaviour in and ex vitro (anamorphic, teleomorphic and synanomorphic states) is suggested. For the first time the total evidence analysis was applied to the genus, showing consistent results with those reported in literature.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-09-18T19:15:37Z No. of bitstreams: 2 Carolina C. de Queiroz Brito Cunha - 2012.pdf: 4678972 bytes, checksum: aa3da530028732bcbc87f49ba9ea6725 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Rejected by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com), reason: Há problemas nos campos de palavras chaves e citação. Foi acrescentado da seguinte forma: Streptomyces - bagaço de cana. De acordo com as orientações seria: Streptomyces Bagaço de cana Foi acrescentado no campo de citação: Citação: Cunha, Carolina Cândida de Queiroz Brito - Caracterização de celulases e xilanases produzidas por Streptomyces sp. cultivado em resíduos lignocelulósicos - 2012 - 99 f. - Dissertação - Programa de Pós-graduação em Biologia (ICB) - Universidade Federal de Goiás - Goiânia, 2012. Deve-se usar a NBR6023, ex.: ALCÂNTARA, Guizelle Aparecida de. Caracterização farmacognostica e atividade antimicrobiana da folha e casca do caule da myrciarostratadc.(myrtaceae). 2012. 41 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2012. on 2014-09-19T13:12:18Z (GMT) / Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-09-22T18:04:37Z No. of bitstreams: 2 Carolina C. de Queiroz Brito Cunha - 2012.pdf: 4678972 bytes, checksum: aa3da530028732bcbc87f49ba9ea6725 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-09-22T19:09:30Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Carolina C. de Queiroz Brito Cunha - 2012.pdf: 4678972 bytes, checksum: aa3da530028732bcbc87f49ba9ea6725 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-22T19:09:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Carolina C. de Queiroz Brito Cunha - 2012.pdf: 4678972 bytes, checksum: aa3da530028732bcbc87f49ba9ea6725 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-10-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / An actinomycete strain, isolated from cane sugar bagasse (CSB), identified as Streptomyces sp was selected for its ability to produce cellulases. The production of cellulases was analyzed by submerged fermentation by cultivation on minimal medium (MM) containing CSB, wheat bran (WB) or carboxymethylcellulose (CMC) as carbon source, and yeast extract (YE) as nitrogen source. The results show that WB was the best inducer of CMCases (2.0 U.mL-1). Aiming to analyze the production of cellulases and xylanases kinetics, the isolate was inoculated in minimal medium containing 0.5% (w/v) WB and maintained for 12 days at 45°C under constant agitation of 180 rpm. The highest yield of Avicelase was observed after 264 h of cultivation (5.646 Uml-1), after 144 h for CMCase (3.872 Uml-1), after 144 h for FPase (0.0947 Uml-1) and after 288 h for Xylanase (92.40 Uml- 1). Culture supernatants with maximum activity of Avicelase, CMCase, Fpase and Xylanase were analyzed for optima pH and temperature of the respective enzymes. The highest enzyme activities were detected at pH 7.0 at 35°C for Avicelase, pH 4.5/75°C for CMCase, pH 5.5/45°Cfor FPase and pH 5.5/70°C for Xylanase. The enzymes retained more than 70% of the initial activity after 2 h incubation at 50°C. The profile proteins analyzed by zymogram demonstrated a set of secreted cellulases (37, 21 and 17 kDa) and xylanases (39, 21, 18 and 17 kDa) when grown on FT for 144 h. The saccharification assay with CSB as substrate showed that the enzyme complex was able to release 19% of glucose and 62.9% of xylose. / Uma linhagem de Actinomiceto, isolada do bagaço de cana-de-açúcar (BCA), identificada como Streptomyces sp foi selecionada pela sua capacidade de produzir celulases. A produção de celulases foi analisada por fermentação submersa (FS) pelo cultivo do isolado em meio mínimo (MM) contendo BCA, farelo de trigo (FT) ou carboximetilcelulose (CMC) como fonte de carbono, e extrato de levedura (EL) como fonte de nitrogênio. Os resultados demostraram que o FT foi o melhor indutor da produção de CMCases (2,0 U.mL-1). Com o objetivo de analisar a cinética de produção de celulases e xilanases pelo isolado, este foi inoculado em meio mínimo contendo 0,5% (w/v) FT e mantido por 12 dias a 45°C sob agitação constante de 180 rpm. A maior produção de Avicelase foi observada após 264 h de cultivo (5,646 UmL-1), de CMCase após 144 h (3,872 UmL-1), de FPase após 144 h (0,0947 UmL-1) e de Xilanase após 288 h (92,40 UmL-1). Os sobrenantes de cultura com atividade máxima de Avicelase, CMCase, FPase e Xilanase foram analisados quanto ao pH e temperatura ótimos das respectivas enzimas. Os resultados obtidos demonstraram que a maior atividade de Avicelase foi detectada em pH 7,0 a 35°C; CMCase apresentou melhor atividade em pH 4,5 a 75°C; FPase apresentou melhor atividade em pH 5,5 a 45°C e Xilanase apresentou melhor atividade em pH 5,5 a 70°C. Quanto à termoestabilidade, as enzimas presentes mantiveram mais de 70% da atividade inicial após 2 h de incubação a 50°C. O perfil de proteínas analisado por zimograma demonstrou que o isolado secretou um conjunto de celulases (37, 21 e 17 KDa) e xilanases (39, 21, 18 e 17 KDa) quando cultivado em FT por 144 h. No ensaio de sacarificação de BCA o complexo enzimático foi capaz de liberar 19% de glicose e 62,9% de xilose.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-07Bitstream added on 2014-06-13T18:44:32Z : No. of bitstreams: 1 leite_rsr_dr_rcla.pdf: 371019 bytes, checksum: 830cbb582aca2919cbcad799c2e9420b (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste trabalho as ß-glicosidases produzidas pelos microrganismos Thermoascus aurantiacus e Aureobasidium pullulans foram purificadas, caracterizadas termodinamicamente, físico-quimicamente e aplicadas em terpenos e isoflavonas. O processo de purificação da enzima do T. aurantiacus apresentou rendimento final de 63,6% e fator de purificação de 46,3 vezes. Após a purificação da enzima do A. pullulans, esta apresentou fator de purificação de 35,5 vezes e rendimento de 19%. A ß-glicosidase do T. aurantiacus apresentou atividade ótima em pH 4,5 a temperatura de 75ºC. Esta manteve-se estável na faixa de pH 4,5 a 6,5 e reteve sua atividade original após 1 hora a 70ºC. A enzima purificada do A. pullulans apresentou maior atividade catalítica nos valores de pH 4,0-4,5 a temperatura de 80ºC. A mesma foi estável em ampla faixa de pH 4,0 a 9,5, e, reteve sua atividade original após 1 hora a 75ºC. A maior termoestabilidade, da enzima produzida pelo microrganismo mesofílico, A. pullulans, foi comprovada pela análise dos parâmetros termodinâmicos. A ß-glicosidase do T. aurantiacus apresentou valores menores de t(1/2), ∆G, ∆H e Ea em todas as temperaturas analisadas. As duas enzimas foram fortemente inibidas por Hg+2 e Ag+, sugerindo que o grupo tiol (SH) é essencial para atividade das mesmas. O pNPßG foi utilizado para a determinação dos parâmetros cinéticos, os valores de Km e Vmax obtidos foram 0,53 mM e 590,8 μmol/ min/mg de proteína para a enzima do T. aurantiacus, e, 0,93 mM e 29,9 μmol/ min/mg de proteína para a enzima do A. pullulans. A presença de etanol no meio de reação ativou a ß-glicosidase do T. aurantiacus, indicando atividade glicosil transferase, o mesmo não foi observado para enzima do A. pullulans. As duas ß-glicosidases atuaram em diferentes substratos glicosídicos, inclusive sobre terpenos e isoflavonas, o que confirma a ampla especificidade das enzimas. / In this work, ß-glucosidases produced by the microorganisms Thermoascus aurantiacus and Aureobasidium pullulans were purified, thermodynamically and physical-chemically characterized and applied on terpenes and isoflavones. Purification process of the enzyme from T. aurantiacus exhibited final yield of 63.6% and purification factor of 46.3 -fold. Purification process of the enzyme from A. pullulans resulted in 19% yield and purification factor of 35.5-fold. ßglucosidase from T. aurantiacus exhibited optimum activity at pH 4.5 and at temperature of 75ºC. It remained stable at pH range of 4.5 to 6.5 and maintained its original activity after 1 hour at 70ºC. Purified enzyme from A. pullulans exhibited a higher catalytic activity in pH values of 4.0-4.5 at an optimum temperature of 80ºC. It was stable over a wide pH range, from 4.0 to 9.5, and, maintained its original activity after 1 hour at 75ºC. The higher thermal stability of the enzyme produced by the mesophilic microorganism, A. pullulans, was confirmed by analysis of the thermodynamic parameters. ß-glucosidase from T. aurantiacus exhibited lower values for t(1/2), ∆G, ∆H and Ea in all temperatures tested. Both enzymes were strongly inhibited by Hg+2 and Ag+, suggesting that a thiol group (SH) is essential for their activities. pNPßG was used for the kinetic parameters determination and the values for Km and Vmax were 0.53 mM and 590.8 μmol/ min/mg of protein for the enzyme from T. aurantiacus, and, 0.93 mM and 29.9 μmol/ min/mg of protein for the enzyme from A. pullulans. The presence of ethanol in the reaction mixture activated the ß-glucosidase from T. aurantiacus, indicating glucosil transferase activity, which was not observed for the enzyme from A. pullulans. Both ß-glucosidases exhibited activity on different glucosidic substrates, including terpenes and isoflavones, confirming the broad specificity of the enzymes.

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-25Bitstream added on 2015-03-03T12:06:21Z : No. of bitstreams: 1 000806886_20160725.pdf: 581026 bytes, checksum: 4c55faecb6d2b9cbebcf0fed8076771a (MD5) Bitstreams deleted on 2016-07-25T13:17:27Z: 000806886_20160725.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-25T13:18:38Z : No. of bitstreams: 1 000806886.pdf: 2412685 bytes, checksum: 76a763d7dfe3317535d6f9ec19a7cd78 (MD5) / As endoglicanases EC 3.2.1.4 são enzimas capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas ?-1,4 da celulose, resultando na liberação de glicose, celobiose e celo-oligossacarídeos. Empregadas mundialmente em diversos processos industriais, por exemplo, como amaciante de tecidos de algodão e bioestonagem de jeans, na extração de sucos de frutas, na adição em detergentes comerciais, na fabricação de cerveja, e na produção de papel e de etanol. Atualmente, há um grande interesse em enzimas que hidrolisem biomassa lignocelulósica para obtenção de etanol de segunda geração. A imobilização de enzimas em matrizes sólidas oferece muitas vantagens, entre as quais, reuso da enzima, a fácil separação do produto e o aumento da estabilidade operacional. Os objetivos deste trabalho foram: produzir CMCases secretadas por Aspergillus niger e Humicola grisea var. thermoidea em cultivo sólido e submerso; imobilizar CMCases em suporte agarose com diferentes ativações químicas; determinar a estabilidade térmica e as propriedades cinéticas dos derivados obtidos, comparando-os com as enzimas livres; avaliar a capacidade de reuso dos derivados ativos e estáveis e analisar qualitativamente o produto de hidrólise dos substratos celulósicos. O fungo A. niger secretou grandes quantidades de CMCases, 34,1 U.mg-1, em meio Vogel, utilizando pó de bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono. O pH 5 foi determinado como o ótimo para a enzima, apresentando instabilidade ao pH 10. Com a utilização de aditivos estabilizante, a trealose a 10% (m/v), manteve, em pH 10, 80% de atividade residual, por 25 horas. Em relação à temperatura, apresentou uma faixa ampla de atividade entre 45°C a 75°C, tendo como temperatura ótima 65°C. O derivado enzimático que ofereceu melhor estabilidade foi aquele em que a imobilização foi conduzida juntamente com o substrato carboximeticelulose (CMC 1%), em... / The endoglucanases EC 3.2.1.4 are enzymes that hydrolyze the ?-1, 4 glycosidic linkages of the cellulose producing glucose, cellobiose and cello-oligosaccharides. Used worldwide in many industrial processes such as fabric softener and bioestonagem cotton jeans, extraction of fruit juices, in the addition of commercial detergents, in brewing, and the production of paper and ethanol. Currently, there is great interest in enzymes that hydrolyze lignocellulosic biomass to obtain second-generation ethanol. The immobilization of enzymes on solid arrays provides many advantages as the enzyme reuse, easy separation of the product and increased operational stability. The aims of this study were to produce secreted: CMCases produce secreted by Aspergillus niger and Humicola grisea var. thermoidea in solid and submerged cultivation; CMCases immobilized on agarose support with different chemical activations; determine the thermal stability and kinetic properties of the derivatives obtained comparing them with the free enzyme; evaluate the reuse capacity assets and stable derivatives and qualitatively analyze the product of hydrolysis of cellulosic substrates. The fungus A. niger secreted large amounts of CMCases, 34.1 U.mg-1 amid Vogel, using powdered sugarcane bagasse as a carbon source. The pH of 5 was determined as the optimum for the enzyme, presenting instability to pH 10. With the use of stabilizing additives, the 10% trehalose (w / v), kept at pH10, 80% residual activity for 25 hours. Regarding temperature there was a broad activity range from 45 °C to 75 °C and the optimum temperature as 65 °C. The enzyme derivative which offered better stability was one in which immobilization was conducted with the carboxymethycellulose substrate (1% CMC) in agarose support Glutaraldehyde (70% of reactive groups), preserving catalytic activity of 35% at 60 °C for 250 hours. Through qualitative TLC analysis, it...

Orientador: Daniela Alonso Bocchini / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Kelly Johana Dussan Medina / Banca: Jonas Contiero / Banca: Eleni Gomes / Resumo: Atualmente, há um crescente interesse na produção de bioetanol celulósico como biocombustível de segunda geração, sendo uma alternativa promissora aos combustíveis fósseis. Fungos tem sido constantemente isolados na busca por novas fontes de celulases e os endofíticos são interessantes para esta finalidade, por serem potenciais produtores de enzimas de degradação de material vegetal, incluindo celulases, e pouco estudados neste sendido. O presente estudo teve por finalidade a avaliação da influência das condições de cultivo (isolado e co-cultivo) para a produção de celulases pelos fungos endofíticos Botryosphaeria sp. AM01 e Saccharicola sp. EJC04, por meio de metodologias estatísticas, além da utilização dos extratos enzimáticos na sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado hidrotérmicamente com NaOH, otimizando-se também esta etapa empregando-se as ferramentas estatísticas citadas. Para a condição de co-cultivo dos fungos, a quantidade de substrato (5,7g) e a umidade inicial do substrato (60,6%) foram otimizadas visando maximizar a produção de endoglunacase (121,56 U/g). Para o cultivo isolado de Botryosphaeria sp. AM01, foi possível a produção de endoglunacase (168,99 U/g), empregando a concentração de NaNO3 a 6,0 g/L e 5,0 g como quantidade de substrato. Para o cultivo isolado de Saccharicola sp. EJC04, obteve-se a condição ótima para produção de β-glicosidase (750,37 U/g) na concentração de ureia de 0,0836 g/L, teor de umidade de 49,2% e quantidade de substrat... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: There is a great interest in the production of cellulosic bioethanol as second generation biofuel and it is a promising alternative to fossil fuels. Fungi have been constantly isolated in the search for new sources of cellulases and the endophytics interesting for this purpose, being potential producers of plant material degrading enzymes, including cellulases, and underexploited in this sense.The present study had as purpose the optimization of culture conditions (monoculture and co-cultivation) for the production of cellulases by the endophytic fungi Botryosphaeria sp. AM01 and Saccharicola sp. EJC04, by statistics methodology, and also the use of enzymatic extracts in saccharification of sugarcane bagasse submitted to hydrothermal pretreatment with NaOH, optimizing this step using those statistical tools. For the fungi co-cultivation, the amount of substrate (5.7g) and the substrate initial moisture (60.6%) were optimized to maximize the production of endoglunacase (121.56 U/g). For the monoculture of Botryosphaeria sp. AM01, it was possible to produce endoglunacase (168.99 U/g), using the concentration of NaNO3 at 6.0 g/L and 5.0 g as substrate amount. For the monoculture of Saccharicola sp. EJC04, the optimal condition for β- glycosidase production (750.37 U/g) was obtained using urea at 0.0836 g/L, initial substrate moisture at 49.2% and substrate amount of 3.84 g. The enzymatic extracts obtained under optimized conditions were used in the saccharification of sugarcane bagasse submitted to alkaline hydrothermal pretreatment with NaOH. The pre-treated bagasse characterization indicated 59.52, 31.62 and 11.32% as the contents of cellulose, hemicellulose and lignin, respectively. The saccharification performed with the enzymatic extract produced by Botryosphaeria sp. AM01 was more efficient in glucose (Full abstract, click on electronic access below) / Doutor

Para determinar as variáveis morfogênicas, estruturais e o fluxo de tecidos os tratamentos foram duas intensidades (baixa e moderada) e dois métodos de pastejo (pastejo com lotação contínua e rotacionada). No experimento 1 o bastão graduado apresentou a melhor correlação com a massa de forragem (r2=0,65). No 2 as melhores correlações foram obtidas quando avaliadas as faixas de pós-pastejo para o disco medidor (r2=0,47) e as de pré-pastejo para o bastão graduado (r2=0,36). Para as variáveis morfogênicas e estruturais as intensidades de pastejo foram responsáveis por diferenças na taxa de elongação de folhas (intensidade baixa resultou em maior taxa de elongação) e nas características estruturais (intensidade baixa resultou em menor densidade de perfilhos, maior comprimento e número de folhas vivas). Os métodos de pastejo influenciaram as características morfogênicas (lotação contínua resultou em maior taxa de elongação de folhas, maior taxa de surgimento e tempo de vida das folhas no ciclo de observação I) e estruturais (lotação contínua resultou em maior densidade de perfilhos); bem como foi obtida interação com as intensidades e com os ciclos de avaliação. O fluxo de crescimento (favorecido por lotação rotacionada a baixa intensidade) e de senescência (favorecido por lotação contínua a baixa intensidade) foram afetados pelos tratamentos, enquanto que o fluxo de consumo não foi alterado pelos tratamentos.

A celulose é o polímero mais abundante na natureza, sendo sua biodegradação realizada por enzimas como exoglicanases, endoglicanases e b-glicosidases, denominadas celulases. Entre os microrganismos capazes de secretar estas enzimas, destacam-se os fungos filamentosos, como Trichoderma, Penicillium e Aspergillus. Neste trabalho, em sua primeira etapa foi selecionado o fungo Aspergillus phoenicis entre seis fungos filamentosos para a produção de celulases. Foram testados doze meios de cultivos diferentes, buscando a escolha de um meio de cultivo baseado em resíduos agroindustriais para a produção de enzimas celulásicas. O meio de cultivo composto por resíduo de uva e peptona foi escolhido para efetuar de otimização do meio de cultivo, por meio da metodologia de superfície de resposta, realizando o planejamento fatorial 2². O cultivo submerso do fungo foi realizado em frascos erlenmeyers de 250 mL, com 50 mL de meio de cultivo, na temperatura de 30ºC, durante 120 horas em agitador de plataforma, a 120 rpm. Foram mensuradas as atividades de celulases totais, endoglicanases, e b-glicosidases. A atividade enzimática presente no sobrenandante do meio de cultivo foi então caracterizada quanto a diferentes valores de pH, temperatura, termoestabilidade, presença de sais e reagentes. Os resultados demonstram que as enzimas presentes no sobrenadante bruto da cultura possuem melhores atividade entre os pHs 3,0 e 5,0, temperatura de 60 ºC, mantendo-se estável por duas horas de incubação. A atividade enzimática sofreu perdas quando incubada na presença de Hg2+ , Cu+2, detergentes e ßmercaptoetanol. / Cellulose is the most abundant polymer in the nature, being its degradation carried out by enzymes such as exoglicanases, endoglicanases and b-glicosidases, called cellulases. Among the microorganisms capable to secret this enzymes, the fungi distinguished the filamentous fungi, such as Trichoderma, Penicillium and Aspergillus are the most important microrganisms. In this work, the fungus Aspergillus phoenicis was selected among six others filamentous fungi for the production of cellulases. Twelve culture media based on agroindustrial waste for cellulase production were tested. Culture medium with the composition of waste grape and peptone was chosen for the optimization of process, with the help of the response surface methodology, through factorial planning 2². The fungus was cultivated at a temperature of 30 ºC and 120 rpm on shaker rotatory during 120 hours. The activity of total cellulases, endoglucanases and b-glucosidases were measured. The enzymatic activity was characterized for the different values of pH, temperature, thermostability and presence of ions and others composts. The results demonstrated that the crude enzymes have the optimum activity between pH 3,0 and 5,0, at 60 ºC, temperature that it was remained steady for two hours of incubation. The enzymatic activity suffered losses when incubate in the presence of Hg2+, Cu+2, detergents and ß-mercaptoetanol.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2016-01-15T14:39:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 326518.pdf: 3128402 bytes, checksum: 2d904720c503bd76ec13c6f29097da18 (MD5) Previous issue date: 2013 / A presença de impurezas não celulósicas na fibra de algodão cru acarreta ao substrato têxtil dificuldade na absorção de água, o que ocasiona problemas de qualidade nos processos de acabamento, como o tingimento. A retirada destas impurezas é convencionalmente feita pela purga alcalina, utilizando o hidróxido de sódio a altas temperaturas. As condições severas do processo geram efluente com elevado pH e alto nível de DQO, além de ocasionar a degradação da celulose, resultando na diminuição da resistência das fibras. A biopurga enzimática, por sua vez, permite elevada especificidade na remoção das impurezas, não atacando a fibra celulósica e utilizando condições de processo menos severas de temperatura e pH. No presente trabalho foi investigada a utilização enzimas combinadas, celulase (E.C. 3.2.1.4), pectinase (E.C. 4.2.2.2) e lipase (E.C. 3.1.1.3) no processo de biopurga de malha 100% algodão. Para isto, as enzimas foram caracterizadas quanto às suas atividades nas condições ótimas e nas condições propostas para o processo de biopurga, e na presença de um agente quelante. A influência do agente sequestrante no tratamento enzimático também foi analisada ao se estudar dois procedimentos distintos  com a adição do agente químico no início do processo e com a adição deste somente após 30 min de reação enzimática. O efeito de cada enzima e suas interações foi avaliado com o auxílio de um planejamento experimental e a caracterização da malha tratada (perda de massa, grau de alvura, grau de remoção de pectina, resposta ao posterior tingimento e hidrofilidade). Para fins comparativos, realizou-se uma purga alcalina convencional. Os resultados mostram que o sequestrante não interferiu na atividade das enzimas. A biopurga com adição de sequestrante no início do processo e nas condições de pH 6,5 e temperatura 55 °C revelou que a combinação das três enzimas nos pontos máximos do planejamento experimental apresentou os melhores resultados  um grau de alvura de 24,99 Graus Berger, uma remoção de pectina de 87,47% e uma hidrofilidade de 14,67 s. A comparação do tratamento enzimático com a lavagem alcalina por meio da caracterização das malhas, confirmou que a biopurga pode ser tão eficaz quanto o processo convencional.<br> / Abstract : The presence of non-cellulosic impurities in the grey cotton fiber leads to textile substrate difficulty in absorption of water, which causes quality problems in the finishing process, such as dyeing. The removal of these impurities is conventionally done by scouring, using sodium hydroxide at high temperatures. The severe conditions of the process generate a effluent with high pH and high level of COD, beyond causing degradation of the cellulose, resulting in decreased of fiber strength. The enzymatic bioscouring in turn allows high specificity in the removal of impurities, not by attacking the cellulose fiber and using less severe process conditions of temperature and pH. In the present study was investigated the combined use of enzymes, cellulase (E.C. 3.2.1.4), pectinase (E.C. 4.2.2.2) and lipase (E.C. 3.1.1.3) in the bioscouring of 100% knitted cotton fabric. For this, the enzymes were characterized according to their activities in the optimal conditions and the proposed conditions for the bioscouring, and in the presence of a chelating agent. The influence of the chelating agent in the enzyme treatment was also analyzed by studying two different procedures  with the addition of the chemical agent in the begin of the process and with the addition of this only after 30 min of enzymatic reaction. The effect of each enzyme and their interactions was reported with the aid of an experimental design and characterization of treated fabric (weight loss, degree of whiteness, response to subsequent dyeing, degree of pectin removal, wettability). For comparative purposes was made a conventional scouring. The results show that the chelating agent did not affect the activities of the enzymes. The bioscouring with the addition of chelating agent in the begin of the process and conditions of pH 6,5 and temperature 55 °C showed that the combination of the three enzymes in the maximum points of the experimental design presented the best results  a degree whiteness of 24,99 Degrees Berger, a pectin removal of 87,47% and a wettability of 14,67 s. Comparison of enzymatic treatment with the alkaline wash through the knitted fabric characterization, confirmed that the bioscouring can be as effective as the conventional process.