A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e foi descoberta em 1909 por Carlos Chagas. A doença atinge cerca de 18 milhões de indivíduos na região das Américas, causando 50.000 mortes ao ano e deixando mais de 100 mil pessoas sob risco de infecção. Os tratamentos disponíveis foram desenvolvidos ainda na década de 70 apresentando baixa eficácia e fortes efeitos colaterais. Assim, é extremamente importante o desenvolvimento de novos fármacos mais seguros e eficazes para o tratamento da doença de Chagas. Uma importante estratégia que pode ser utilizada para o planejamento de novas moléculas bioativas é o planejamento baseado em um receptor-alvo. Nessa tese o alvo em estudo é a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) que faz parte da via glicolítica do protozoário T. cruzi. Este trabalho compreendeu os estudos estruturais e mecanísticos de quatro complexos cristalográficos da GAPDH na presença de ligantes diferentes. As estruturas obtidas subsidiaram estudos que forneceram informações importantes no planejamento de novos inibidores. Foi elucidado o modo pelo qual os compostos alquilantes iodoacetamida e iodoacetato atuam causando a inativação enzimática e as diferenças existentes nesse processo foram esclarecidas, mostrando que é necessária a expulsão do NAD+ do sítio ativo para que a inativação ocorra por parte do iodoacetamida. Além disso, o mecanismo de nitrosilação por complexos de rutênio foi investigado fornecendo informações que contribuem para o entendimento do mecanismo de inibição enzimática por parte dessa classe compostos. Além disso, a partir de um dos complexos estruturais obtidos, foi possível identificar a localização de um novo sítio alostérico que se forma na superfície da proteína. Essa informação é extremamente importante, pois abre novas perspectivas para o planejamento de novos inibidores mais potentes e seletivos da enzima GAPDH de T. cruzi. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi protozoan, was discovered in 1909 by Carlos Chagas. The disease affects about 18 million people in the American region, causing 50,000 deaths per year, leaving more than 100 thousand people at risk of infection. Available treatments developed in the 70 decade present low efficiency and strong side effects. Thus, it is extremely important the development of new drugs that safer and more effective. An important strategy used for the design of new bioactive molecules is based on a macromolecular target. The goal of this thesis is to study the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), an enzyme that participates of the glycolytic pathway of the parasite T. cruzi. This work comprised structural and mechanistic studies of four complex crystallographic GAPDH in the presence of different ligands. The structures obtained subsidized structural and mechanistic studies that provided important information for the design of new inhibitors. It was clarified the way in which the alkylating agents iodoacetamide and iodoacetate acts causing enzyme inactivation and the differences in this process were resolved, showing that it is necessary the NAD+ is excluded of the active site wherefore the inactivation occurs by the iodoacetamide. Moreover, the mechanism of enzyme nitrosylation by ruthenium complexes was investigated, providing information that contributed to the understanding of the mechanism of enzyme inhibition by this class of compounds. Moreover, from the structural complexes obtained, it was possible to identify the location of a new allosteric site formed at the surface of the protein. This information is extremely important, because it opens new perspectives for the design of new inhibitors that are more potent and selective for the enzyme GAPDH of T. cruzi.

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This study evaluates the roles of temperature variability and disease awareness in the emergence of Chagas disease (American trypanosomiasis). Chagas disease is endemic in Latin America and primarily spreads to humans directly via the triatomine vector. Hosts for most triatomine species are mainly rodents and occasionally dogs. The disease itself is caused by a parasitic protozoan, Trypanosoma cruzi (T. cruzi) which is found in the triatomine's feces and is often spread while the triatomine is consuming a blood meal. T. cruzi from feces enters the body via an abrasion on the skin, the mucous membranes, conjunctivae, or through consumption. To determine the risk of Chagas disease transmission one must define qualities that make the triatomine an effective disease vector as well as investigate the level of disease awareness among physicians and the population within the vector's range. This thesis maps triatomine species within the U.S. that harbor T. cruzi naturally and that exhibit qualities of domesticity. These qualities are defined by whether the species bites humans and dogs as well as reports that the species has been found in the domestic setting. Ranges illustrating temperature thresholds for increased triatomine activity for 2000 and 2030 are also depicted. Additionally, outcomes of a physician survey are presented to gauge the status of Chagas disease awareness in areas at higher risk for disease transmission. Results reveal limited consideration of Chagas disease in physician diagnosis despite the higher risk range which extends through the southern U.S. and is predicted to expand significantly by 2030. / Master of Science

Dor torácica é sintoma frequente em pacientes com cardiomiopatia crônica da doença de Chagas (CCDC). Embora, em muitos casos seja atribuído empiricamente a defeitos transitórios (isquêmicos) encontrados em cintilografia de perfusão miocárdica (CPM), ainda não há evidências científicas que embasem terapêutica adequada para essa condição. Objetivos: Testar a hipótese de que ocorra redução > 50% do déficit perfusional transitório e melhora sintomática e de qualidade de vida após tratamento oral com verapamil e ácido acetilsalicílico (AAS) em pacientes com CCDC e dor torácica. Métodos: Estudo prospectivo, unicêntrico, que incluiu pacientes submetidos a cinecoronariografia por dor torácica, em que não foram identificadas lesões obstrutivas coronarianas significativas (>30%) e não apresentavam disfunção ventricular moderada ou grave. Alterações de mobilidade segmentar na ventriculografia contrastada e epidemiologia sugestiva apontaram para CCDC, que foi confirmada por dois testes sorológicos distintos. Isquemia microvascular foi comprovada por CPM com escore diferencial (Summed Difference Score (SDS) >= 1). Avaliação de dor torácica e qualidade de vida foi realizada por aplicação de Questionário de Angina de Seattle (QAS) e EQ-5D no momento da inclusão e após 3 meses de tratamento com verapamil e AAS, quando a CPM também foi repetida. As comparações pré e pós-tratamento do EQ-5D, QAS e SDS na CPM foi realizada através de teste de Wilcoxon para amostras pareadas e não normalmente distribuídas. Resultados: Vinte e seis pacientes de ambos os gêneros (58% de mulheres), idade média de 64 ±10 anos, apresentaram melhora significativa de 62,5% no SDS após o tratamento (4,5 [4-9] vs 2 [0-4.25], p<0.001). Dos 26 pacientes, 20 apresentaram melhora do SDS, dentre os quais, 10 com SDS igual a zero, ou seja, sem evidência de déficit perfusional transitório após o tratamento. Em 4 pacientes não houve mudança no SDS e apenas 2 apresentaram piora do SDS. Houve melhora significativa no valor indexado do EQ-5D após os 3 meses de tratamento (0,63±0,11 vs 0,77±0,17, p<0.001), assim como nas 5 subáreas que compõem o QAS (p<0,001).Conclusões: O uso combinado de vasodilatador microvascular e antiplaquetário (verapamil + AAS) associou-se a significativa redução dos defeitos perfusionais transitórios sugestivos de isquemia microvascular e a melhora de dor torácica e qualidade de vida em pacientes com CCDC. Este estudo pioneiro embasa investigações futuras no intuito de sedimentar evidências, comparar a placebo por exemplo, com intuito de definir terapêutica em pacientes com CCDC sintomáticos com distúrbios microvasculares. / Chest pain is a common symptom in patients with chronic Chagas disease cardiomyopathy (CCDC). Although this might be explained by myocardial perfusion scintigraphy (MPS) evidence of regional microvascular disturbances in patients with angiographically normal coronary arteries, there is no standard evidence based therapy for this condition. Purpose: Evaluate the impact of verapamil and acetylsalicylic acid (ASA) on symptoms, quality of life and myocardial perfusion defects in CDC patients with chest pain and microvascular ischemia. Methods: 26 patients were evaluated in this clinical trial. CCDC was confirmed by 2 serologic tests. All of them had chest pain and no significant epicardial coronary artery lesions by coronarography or moderate/severe ventricle systolic dysfunction by left ventriculography. Questionnaires to evaluate quality of life (EQ-5D) and chest pain symptoms (Seattle Angina Questionnaire (SAQ)) and SPECT MPS (physical stress preferably) were performed before and three months after treatment with oral verapamil and ASA. Comparison of pre and post EQ-5D/SAQ and SPECT perfusion results were performed using Wilcoxon signed rank test for paired data. Results: Mean age was 64 ± 10 years, 15 (57,7%) men. SDS was significantly reduced by 55,6% after treatment (4,5 [4-9] vs 2 [0-4.25], p<0.001). Decrease in SDS was observed in 20 (77%) participants, of those ten (38,5%) exhibited a post-treatment SDS equals zero, i.e., had no more evidence of stress induced perfusion abnormalities. Four patients (15,3%) maintained SDS values and only 2 (7,7%) increased SDS after 3 months of medications. In the evaluation of quality of life and symptoms, enhancement in EQ-5D values (index value: 0,63±0,11 vs 0,77±0,17, p<0.001) and in all dimensions of QAS post treatment were also significant (improve > 10 points each, p<0,001). Conclusions: The combined use of a microvascular vasodilator and an antiplatelet agent seems to improve quality of life and chest pain symptoms and reduce ischemic perfusion abnormalities in patients with CCDC significantly. This study paved the way for an ongoing investigation aimed at getting more definitive evidence of benefit withthese drugs as compared to placebo in CCDC and idiopathic microvascular derangements.

Dor torácica é sintoma frequente em pacientes com cardiomiopatia crônica da doença de Chagas (CCDC). Embora, em muitos casos seja atribuído empiricamente a defeitos transitórios (isquêmicos) encontrados em cintilografia de perfusão miocárdica (CPM), ainda não há evidências científicas que embasem terapêutica adequada para essa condição. Objetivos: Testar a hipótese de que ocorra redução > 50% do déficit perfusional transitório e melhora sintomática e de qualidade de vida após tratamento oral com verapamil e ácido acetilsalicílico (AAS) em pacientes com CCDC e dor torácica. Métodos: Estudo prospectivo, unicêntrico, que incluiu pacientes submetidos a cinecoronariografia por dor torácica, em que não foram identificadas lesões obstrutivas coronarianas significativas (>30%) e não apresentavam disfunção ventricular moderada ou grave. Alterações de mobilidade segmentar na ventriculografia contrastada e epidemiologia sugestiva apontaram para CCDC, que foi confirmada por dois testes sorológicos distintos. Isquemia microvascular foi comprovada por CPM com escore diferencial (Summed Difference Score (SDS) >= 1). Avaliação de dor torácica e qualidade de vida foi realizada por aplicação de Questionário de Angina de Seattle (QAS) e EQ-5D no momento da inclusão e após 3 meses de tratamento com verapamil e AAS, quando a CPM também foi repetida. As comparações pré e pós-tratamento do EQ-5D, QAS e SDS na CPM foi realizada através de teste de Wilcoxon para amostras pareadas e não normalmente distribuídas. Resultados: Vinte e seis pacientes de ambos os gêneros (58% de mulheres), idade média de 64 ±10 anos, apresentaram melhora significativa de 62,5% no SDS após o tratamento (4,5 [4-9] vs 2 [0-4.25], p<0.001). Dos 26 pacientes, 20 apresentaram melhora do SDS, dentre os quais, 10 com SDS igual a zero, ou seja, sem evidência de déficit perfusional transitório após o tratamento. Em 4 pacientes não houve mudança no SDS e apenas 2 apresentaram piora do SDS. Houve melhora significativa no valor indexado do EQ-5D após os 3 meses de tratamento (0,63±0,11 vs 0,77±0,17, p<0.001), assim como nas 5 subáreas que compõem o QAS (p<0,001).Conclusões: O uso combinado de vasodilatador microvascular e antiplaquetário (verapamil + AAS) associou-se a significativa redução dos defeitos perfusionais transitórios sugestivos de isquemia microvascular e a melhora de dor torácica e qualidade de vida em pacientes com CCDC. Este estudo pioneiro embasa investigações futuras no intuito de sedimentar evidências, comparar a placebo por exemplo, com intuito de definir terapêutica em pacientes com CCDC sintomáticos com distúrbios microvasculares. / Chest pain is a common symptom in patients with chronic Chagas disease cardiomyopathy (CCDC). Although this might be explained by myocardial perfusion scintigraphy (MPS) evidence of regional microvascular disturbances in patients with angiographically normal coronary arteries, there is no standard evidence based therapy for this condition. Purpose: Evaluate the impact of verapamil and acetylsalicylic acid (ASA) on symptoms, quality of life and myocardial perfusion defects in CDC patients with chest pain and microvascular ischemia. Methods: 26 patients were evaluated in this clinical trial. CCDC was confirmed by 2 serologic tests. All of them had chest pain and no significant epicardial coronary artery lesions by coronarography or moderate/severe ventricle systolic dysfunction by left ventriculography. Questionnaires to evaluate quality of life (EQ-5D) and chest pain symptoms (Seattle Angina Questionnaire (SAQ)) and SPECT MPS (physical stress preferably) were performed before and three months after treatment with oral verapamil and ASA. Comparison of pre and post EQ-5D/SAQ and SPECT perfusion results were performed using Wilcoxon signed rank test for paired data. Results: Mean age was 64 ± 10 years, 15 (57,7%) men. SDS was significantly reduced by 55,6% after treatment (4,5 [4-9] vs 2 [0-4.25], p<0.001). Decrease in SDS was observed in 20 (77%) participants, of those ten (38,5%) exhibited a post-treatment SDS equals zero, i.e., had no more evidence of stress induced perfusion abnormalities. Four patients (15,3%) maintained SDS values and only 2 (7,7%) increased SDS after 3 months of medications. In the evaluation of quality of life and symptoms, enhancement in EQ-5D values (index value: 0,63±0,11 vs 0,77±0,17, p<0.001) and in all dimensions of QAS post treatment were also significant (improve > 10 points each, p<0,001). Conclusions: The combined use of a microvascular vasodilator and an antiplatelet agent seems to improve quality of life and chest pain symptoms and reduce ischemic perfusion abnormalities in patients with CCDC significantly. This study paved the way for an ongoing investigation aimed at getting more definitive evidence of benefit withthese drugs as compared to placebo in CCDC and idiopathic microvascular derangements.

A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, é uma das doenças tropicais mais devastadoras e é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. O parasita expressa uma enzima de superfície, Trypanosoma cruzi trans-sialidase (TcTS), responsável pela transferência de ácidos siálicos de células do hospedeiro para moléculas de -galactose terminais presentes em glicoproteínas de sua superfície. As moléculas de glicoproteína sialiladas estão envolvidas na adesão e subsequente penetração do parasita em células hospedeiras. Logo, TcTS desempenha papel fundamental no reconhecimento e na invasão de células do hospedeiro. Além disso, a ausência de trans-sialidase em seres humanos faz de TcTS um alvo potencial a ser explorado, no entanto nenhum inibidor desta enzima (em concentração nanomolar) é conhecido até o momento. Considerando a importância da unidade de galactose e da função carboxila do ácido siálico para interações no sítio activo de TcTS, focamos na síntese de derivados de galactose com ácido succínico em diferentes posições do anel de açúcar e sua avaliação biológica em TcTS. Além disso, foi proposta uma busca por novos inibidores de TcTS através de técnicas de modelagem molecular, como triagem virtual baseada no sítio ativo da enzima. -D-galactose e -Dgalactopiranosídeo de metila, disponíveis comercialmente, foram tratados com reagentes adequados para fornecer alguns intermediários com apenas uma hidroxila livre em poucas etapas. O tratamento destes compostos com anidrido succínico em piridina levou à formação dos respectivos derivados com ácido succínico em todas as posições do anel galactosídico. Após etapa de desproteção foi obtido apenas o derivado com ácido succínico na posição 4 (85), que foi testado em TcTS por ensaio fluorimétrico in vitro para avaliação de sua atividade inibitória. Adicionalmente, 85 foi testado em ensaios in vitro para avaliação de sua atividade tripanocida e citotóxica. De acordo com os ensaios biológicos, o composto 85 apresentou atividade inibitória promissora (56%) na concentração de 1,0 mM. Esse resultado preliminar foi importante para mostrar que esse tipo de derivado pode atuar como inibidor de TcTS e para orientar a síntese de novos derivados de galactose. O valor da atividade tripanocida foi inferior a 40% (0,5 mM) e não foi observada citotoxicidade na concentração de 0,5 mM. Os estudos de triagem virtual realizados neste trabalho através de simulações de \"docking\" resultaram na seleção das 50 melhores moléculas, baseada na orientação de maior pontuação, dentre 50.000 encontradas na base de dados diverset. O próximo passo envolve novos estudos para filtrar as moléculas mais promissoras para serem testadas em TcTS. / Chagas\' disease, also known as American trypanosomiasis, is one of the most devastating tropical diseases and it is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. The parasite expresses a cell surface enzyme, Trypanosoma cruzi trans-sialidase (TcTS), responsible for the transference of sialic acids from host cells to terminal -galactose molecules present on its glycoprotein surface. The sialylated glycoprotein molecules are involved in the attachment and subsequent penetration of the parasite into host cells. As a result, TcTS plays a key role in the recognition and invasion of host cells. Moreover, the lack of trans-sialidase in humans makes TcTS a potential drug target to be explored, however no strong inhibitors (at nanomolar range) of this enzyme are known to date. Considering the importance of galactose unit and the carboxyl function in sialic acid for interactions in the active site of TcTS, we have focused on the synthesis of galactose derivatives containing succinic acid in different positions of the sugar ring and on their biological evaluation against TcTS. In addition, we have proposed the search for new TcTS inhibitors applying molecular modeling techniques, like virtual screening based on the enzyme´s active site. Commercially available ,-D-galactose and methyl--D-galactopyranoside were treated with suitable reagents to afford some intermediates with just one free hydroxyl group in few steps. Treatment of these compounds with succinic anhydride in pyridine afforded derivatives thereof with succinic acid in all galactosidic ring positions. After deprotection step it was only obtained the derivative containing succinic acid at position 4 (85), which was tested in in vitro TcTS fluorimetric assay for evaluation of its inhibitory activity. In Addition, 85 was tested in in vitro assays for assessment of their trypanocidal activity and cytotoxic. According to the biological assays, compound 85 showed promising inhibitory activity (56%) at 1.0 mM concentration. This preliminary result was important both to show that this type of derivative can act as an inhibitor of TcTS and to guide the synthesis of new derivatives of galactose. The trypanocidal activity value was lower than 40% (0.5 mM) and there was no cytotoxicity at 0.5 mM concentration. The virtual screening studies performed in this work through docking simulations resulted in the selection of the 50 top-ranked molecules, based in the highest score orientation, among 50.000 found at diverset data base. The next step involves new studies to filter the most promising molecules to be tested against TcTS.