Doctora en Bioquímica / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo hasta diciembre de 2015, en el Portal de Tesis Electrónicas / El catabolismo de proteínas es un proceso celular fundamental que ha captado la atención de distintos investigadores en los últimos años. Existen dos mecanismos por los cuales la célula degrada proteínas defectuosas: uno extralisosomal, mediado esencialmente por el proteosoma, y otro denominado lisosomal, en el cual este organelo tiene un papel protagónico en la degradación de proteínas, especialmente en las de vida media prolongada. La célula utiliza tres vías para degradar las proteínas a través del lisosoma: macroautofagia, microautofagia y autofagia mediada por chaperonas (AMC). Esta última se activa bajo condiciones de estrés fisiológico tales como la privación de nutrientes. Proteínas citosólicas con una secuencia aminoacídica particular son reconocidas por un complejo de proteínas chaperonas y destinadas al lisosoma para ser degradadas vía AMC, esta última se distingue de la macroautofagia principalmente en que no requiere tráfico vesicular. Las proteínas sustrato a ser degradadas se unen a la proteína receptora LAMP-2A, presente en la membrana lisosomal por lo que tanto sus niveles como los de Hsc70 (chaperona requerida para este proceso proteolítico) en el lisosoma se relacionan directamente con la velocidad de degradación de AMC. El recambio de proteínas intracelulares es de particular importancia en células terminalmente diferenciadas como son los cardiomiocitos y las neuronas, pues cualquier desequilibrio induce la acumulación de proteínas anormales. Diferente es lo que ocurre en células con alta capacidad proliferativa, en las cuales este efecto se mitiga por dilución a través de múltiples divisiones celulares. La oxidación de proteínas es una consecuencia del metabolismo aeróbico, así como la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs). Paralelamente, también se ha observado aumento de EROs en estados de estrés fisiológico, modificando las proteínas y favoreciendo su agregación al interior de la célula. Finalmente, este último proceso se asocia a diferentes estados patológicos por lo cual su remoción o la prevención de su formación son fundamentales para la sobrevida celular. Siendo la AMC un mecanismo involucrado en la degradación de proteínas especialmente bajo condiciones de estrés, se requiere establecer si ella se activa en cardiomiocitos privados de nutrientes, conocer cómo se regula y cuál es su interdependencia con la formación de EROs. Con esta finalidad, esta tesis tiene como hipótesis: “La privación de nutrientes estimula la autofagia mediada por chaperonas en el cardiomiocito como un mecanismo protector frente a daño oxidativo”. / The catabolism of proteins is a fundamental cellular process that has captured the attention of several researchers in the recent years. There are two mechanisms by which the cell degrades defective proteins: one extralysosomal, mediated primarily by the proteasome, and another called lysosomal, in which this organelle has a key role in protein degradation, especially in the long half-life proteins. In the last case, the cell may use three mechanisms to degrade proteins: macroautophagy, microautophagy and chaperone-mediated autophagy (CMA). The latter is activated under physiological stress conditions such as nutrient deprivation. Cytosolic proteins with a specific amino acid sequence are recognized by a chaperone protein complex and destined into the lysosome for degradation via CMA, the latter is distinguished mainly from macroautophagy by requiring no vesicular traffic. The substrate protein to be degraded bind to the receptor protein LAMP-2A present in the lysosomal membrane, therefore substrate protein and Hsc70 levels (chaperone required for this proteolytic process) in the lysosome are directly related to the rate of degradation AMC. The turnover of intracellular proteins is of particular importance in terminally differentiated cells such as cardiomyocytes and neurons, since any imbalance induces the accumulation of abnormal proteins. In those cells with high proliferative capacity, this effect is mitigated by dilution through multiple cell divisions. The protein oxidation is a consequence of aerobic metabolism and the production of reactive oxygen species (ROS). In parallel, it has been shown that the increase in ROS during physiological stress, modifying proteins and promoting their aggregation into the cells. Finally, this latter process is associated with various disease states for which removal or prevention of their formation are essential for cell survival. Being the AMC a mechanism involved in protein degradation, especially under stress, it is important to establish whether AMC is activated in nutrient-deprived cardiomyocytes, how is regulated and its interdependence with ROS generation. To this end, we propose the following hypothesis: "The deprivation of nutrients stimulates chaperone-mediated autophagy in cardiomyocytes as a protective mechanism against oxidative damage." / CONICYT FONDAP Anillo ACT 1111

Tesis para Optar al Grado Académico de Magíster en Bioquímica Área de Especialización: Proteínas y Biotecnología y Memoria para Optar al Título de Bioquímica / Para mantener la integridad, la célula debe controlar la cantidad y calidad de las proteínas. El Retículo Endoplásmico (RE) es el organelo en donde se sintetizan todas las proteínas transmembrana y la mayoría de las proteínas secretadas. Cuando se altera la homeostasis del Retículo Endoplásmico se produce una acumulación de proteínas mal plegadas en su lumen. Como respuesta a este estrés se activa una vía de señalización RE-núcleo, en la que se bloquea la expresión general, aumenta la expresión de chaperonas y se activan las vías proteolíticas del proteasoma y macroautofagia. Un método para producir Estrés en el Retículo Endoplásmico (ERE) es la eliminación del calcio reticular, necesario para el correcto plegamiento proteico. La autofagia mediada por chaperonas (AMC) es un sistema proteolítico que requiere la acción de chaperonas citosólicas para seleccionar, desplegar y dirigir proteínas mal plegadas al interior del lisosoma. Sus actores principales son el receptor lisosomal Lamp2A y la chaperona Hsc70. Se ha descrito la activación de AMC durante la privación prolongada de suero y durante el estrés oxidativo, pero no existen antecedentes de la activación durante el ERE, lo cual constituye el objetivo de esta tesis. Se usó como modelo de estudio células NIH3T3. En estas células se indujo ERE con Tapsigargina (TG), eliminando el calcio en el RE. Mediante western blot se comprobó la aparición de Chop, un factor transcripcional usado clásicamente como marcador de ERE. TG no aumentó la muerte celular, pero produjo un bloqueo en la división celular, deteniendo el ciclo en la etapa G1. Lo anterior se observó mediante citometría de flujo, usando yoduro de propidio como trazador. Mediante inmunocitoquímica y western blot se observó un aumento en los niveles totales de Lamp2A. Esto se relaciona al aumento de Lamp2A en la fracción lisosomal. Además la chaperona Hsc70 se relocaliza hacia la fracción lisosomal en respuesta al estímulo con TG. Estos eventos, el aumento del receptor Lamp2A y relocalización de la chaperona Hcs 70, se han relacionado anteriormente con aumento en la actividad de AMC. Células que expresan constitutivamente un iRNA contra Lamp2A, lo que las hace deficientes en AMC, aumentan la macroautofagia basal. La compensación de macroautofagia es mayor durante un evento de ERE. La mayor actividad de la macroautofagia se refleja en una menor expresión de Chop, que pudiese estar siendo degradado por macroautofagia. Células carentes de ATG5, que no activan macroautofagia, aumentan los niveles totales de Lamp2A. Este es un mecanismo compensatorio, que activa la AMC cuando la macroautofagia no está presente. Sin embargo, la TG disminuyó los niveles totales de Lamp2A. Este inesperado comportamiento puede estar ligado a la activación del proteasoma. En síntesis, esta tesis muestra el primer indicio de la activación de AMC durante un evento de ERE. Esta activación esta dada principalmente por un aumento en los niveles de Lamp2A, que solo se ha visto durante estrés oxidativo. Además muestra que las vías degradativas se comunican para eliminar las proteínas mal plegadas durante el ERE / To maintain the integrity, cells must control the quantity and quality of the proteins. Endoplasmic Reticulum (ER) is the organelle where all transmembrane protein and the most secretory protein are synthesized. Disturbances in the ER homeostasis lead to the accumulation of disfolding proteins in its lumen. In response to this stress a reticulum-nucleus signaling pathway is activated, inducing the selective expression of some genes (i.e. those related to chaperones) and the stimulation of proteolytic systems, including proteasome and macroautophagy. The removal of the calcium reticulum, necessary for the correct protein folding, produces ER stress. Chaperone-mediated autophagy (CMA) is another proteolytic system that requires the action of cytosolic chaperones to select, unfold and pull the unfolded substrate into the lysosomes. Its principal actors are the lysosomal receptor Lamp2A and the chaperone Hsc70. CMA is activated by long serum deprivation and oxidative stress. However it remains unknown whether CMA is stimulated during the ER stress, which it is the main aim of this thesis. The NIH3T3 cells were the study model used. In these cells, Thapsigargin (TG) induces ER stress through the removal ER calcium. Western blot showed an increase in the Chop level, a classic ER stress transcriptional factor. TG didn’t stimulate cell death but arrested cell cycle at G1 stage. This was showed through FACS, using propidium iodide dye. Immunocytochemistry and western blot studies showed that TG increases the Lamp2A total levels. Another observation is the increase of Lamp2A level in the lysosomal fraction. Also, we have seen increases in the hsc70 localization in to the lysosomal fraction. These events, the rise in Lamp2A levels and Hsc70 lysosomal localization, previously have being related with an increase in the CMA activity. Constitutive Lamp2A-siRNA cells, CMA deficient cells, increased basal macroautophagy. Also this macroautophagy compensation is most important during ER stress. The higher macroautophagy activity was associated with low expression of Chop, showing a probable degradation the Chop by macroautophagy. ATG5 knock out cells, macroautophagy deficient cells, showed an increase in the Lamp2A total levels. This cells revealing a compensatory effect of the CMA when the macroautophagy is inactive. However, TG produces a decrease of the levels of Lamp2A.This unexpected behavior is probably related to the proteasome activation. In synthesis, this tesis show by the first time the CMA activation during ER stress. This activation is related to the total Lamp2A increase, only before seen in oxidative stress. Also we show the connection between the proteolytic pathways in the unfolding protein degradation, during ER stress

Neste trabalho realizamos um programa de seqüenciamento em larga escala de cDNAs obtidos de bibliotecas construídas a partir de mRNA de células de B. emersonii submetidas ao choque térmico e ao estresse por cádmio. Obtivemos 6350 seqüências expressas (ESTs) de alta qualidade, que representam 2326 seqüências únicas putativas (unigenes) do fungo. Destes unigenes putativos, 1282 genes foram classificados em pelo menos uma das categorias do Consórcio Gene Ontology (GO). A análise do transcriptoma parcial de B. emersonii determinado até o momento permitiu a identificação de 78 unigenes codificando chaperones moleculares de todas as famílias conhecidas. Para avaliarmos a expressão global dos genes em resposta a estresses ambientais, como o choque térmico e o cádmio, realizamos ensaios de microarranjos de DNA nestas condições de estresse. Observamos que em resposta ao choque térmico, B. emersonii induz a expressão de genes que codificam proteínas relacionadas com o enovelamento de proteínas e com a proteólise, o que seria esperado em condições de temperaturas elevadas, assim como genes que codificam proteínas com propriedades antioxidantes, além de proteínas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos e no metabolismo de carboidratos. Em resposta ao estresse por cádmio, verificou-se a indução de genes que codificam principalmente proteínas com propriedades antioxidantes, proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos, proteínas relacionadas com o transporte celular e proteínas envolvidas no enovelamento de proteínas e proteólise. Uma das conseqüências do estresse por cádmio é o aumento do estresse oxidativo e proteínas antioxidantes têm um papel fundamental na resposta a este tipo de estresse. Dentre os genes observados durante o seqüenciamento das ESTs de B. emersonii, observamos dez genes codificando proteínas distintas da família Hsp70. Nove genes hsp70 são expressos em pelo menos um dos estágios do desenvolvimento do fungo e sete apresentam uma indução significativa após o choque térmico. Estes dados sugerem que estes genes desempenham um papel importante durante o desenvolvimento e em resposta ao estresse térmico em B. emersonii. Outro dado interessante obtido neste trabalho foi o enriquecimento de ESTs que continham íntrons em sua seqüência nas bibliotecas de estresse. Portanto, o choque térmico e o estresse por cádmio em B. emersonii diminuem a eficiência de processamento dos íntrons permitindo sua caracterização. O cDNA da proteína Hsp17 foi o que apresentou o maior número de ESTs seqüenciadas nas bibliotecas de estresse. Experimentos de Northern blot indicaram que o gene hsp17 possui um nível de expressão muito baixo durante o ciclo de vida de B. emersonii, no entanto, como esperado sua expressão aumenta drasticamente quando as células de esporulação ou germinação são submetidas a choque térmico. Os níveis da proteína Hsp17 acompanham os níveis do seu mRNA, indicando que o controle da expressão do gene hsp17 deve ocorrer em nível de transcrição. / In this work we realized a large scale, sequencing program of cDNAs libraries obtained from mRNA of B. emersonii cells submitted to heat shock and cadmium stress. A total of 6350 high quality expressed sequence tags (ESTs) were obtained, representing 2326 unique putative genes (unigenes) of this fungus. From these putative unigenes, 1282 genes were classified at least in one of the three Gene Ontology Consortium (GO) categories. The analysis of the partial transcriptome of B. emersonii, determined until now, allowed the identification of 78 unigenes encoding molecular chaperones of all known protein families. To evaluate the global expression of the genes in response to environmental stresses, such as heat shock and cadmium, DNA microarray assays were performed. We observed that in response to heat shock B. emersonii induces the expreession of genes encoding proteins related to protein folding and proteolysis, as expected under high temperature conditions, as well as genes encoding proteins with antioxidant properties and proteins involved in nucleotide and carbohydrate metabolism. In response to cadmium stress, we mainly verified the induction of genes for proteins with antioxidant properties, proteins involved in amino acid metabolism, proteins related to cellular transport and proteins related to protein folding and proteolysis. One of the consequences of the exposure to cadmium is the increase of oxidative stress, and antioxidant proteins have a fundamental role in the response to this kind of injury. Amongst the genes observed during the B. emersonii EST sequencing program, ten genes encoding distinct proteins from the Hsp70 family were observed. Nine of them are expressed at least in one stage of the fungus development and seven genes presented a significant induction during heat shock treatment. These data suggest that the hsp70 genes perform an important role during development and in response to heat stress in B. emersonii. Another interesting result from this work was the enrichment of ESTs containing introns in the stress libraries. Thus, heat shock and cadmium stress decrease the efficiency of intron processing in B. emersonii, allowing for intron characterization. The cDNA for the Hsp17 protein presented the highest number of ESTs sequenced from the stress libraries. Northern blot experiments indicated that the hsp17 gene is expressed at very low levels throughout the life cycle of B. emersonii, however, as expected its expression increases drastically when sporulation or germination cells are submitted to heat shock. Hsp17 protein levels accompany its mRNA levels, indicating that the control of expression of the hsp17 gene occurs at a transcriptional level.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son células que componen alrededor del 70% del total de células del corazón. Estás células son responsables de la mantención de la matriz extracelular del corazón dando soporte mecánico a los cardiomiocitos. Cuando el corazón es dañado, se inicia un proceso de remodelamiento del tejido cardiaco que puede progresar a una insuficiencia cardiaca. Uno de los factores importantes del remodelamiento es la secreción de colágeno a cargo de los fibroblastos. En el proceso de secreción de proteínas, una vez sintetizadas éstas, deben ser plegadas al interior del retículo endoplásmico (ER). Cuando aumenta la demanda de proteínas que se deben plegar, el ER entra en un estrés que gatilla una respuesta que se llama Respuesta a Proteínas Mal Plegadas (UPR). Si esta respuesta no es capaz de devolver la homeostasis a la célula, se ejecuta un proceso de apoptosis. En este estudio se determinó que el fármaco Tapsigargina es capaz de disminuir la viabilidad de cultivos de fibroblastos cardiacos de manera concentración y tiempo –dependiente a una concentración de 10 nM, además induce proteínas que son parte de la vía UPR como BiP, eIF2α, PDI, ATF4 y CHOP ésta última está muy ligada a los procesos de muerte en las células. En la literatura se ha reportado que el ácido 4-fenilbutirico (4-PBA) se comporta como una chaperona química. Demostramos que al preincubar los cultivos con 4-PBA los efectos antes mostrados por Tapsigargina quedan anulados. También se estudió la implicancia de la UPR provocada por Tapsigargina sobre la secreción de colágeno soluble y también se vieron los efectos del 4-PBA sobre la secreción de colágeno soluble los cultivos, demostrándose la capacidad del 4-PBA de modular la secreción de colágeno.

Neste trabalho realizamos um programa de seqüenciamento em larga escala de cDNAs obtidos de bibliotecas construídas a partir de mRNA de células de B. emersonii submetidas ao choque térmico e ao estresse por cádmio. Obtivemos 6350 seqüências expressas (ESTs) de alta qualidade, que representam 2326 seqüências únicas putativas (unigenes) do fungo. Destes unigenes putativos, 1282 genes foram classificados em pelo menos uma das categorias do Consórcio Gene Ontology (GO). A análise do transcriptoma parcial de B. emersonii determinado até o momento permitiu a identificação de 78 unigenes codificando chaperones moleculares de todas as famílias conhecidas. Para avaliarmos a expressão global dos genes em resposta a estresses ambientais, como o choque térmico e o cádmio, realizamos ensaios de microarranjos de DNA nestas condições de estresse. Observamos que em resposta ao choque térmico, B. emersonii induz a expressão de genes que codificam proteínas relacionadas com o enovelamento de proteínas e com a proteólise, o que seria esperado em condições de temperaturas elevadas, assim como genes que codificam proteínas com propriedades antioxidantes, além de proteínas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos e no metabolismo de carboidratos. Em resposta ao estresse por cádmio, verificou-se a indução de genes que codificam principalmente proteínas com propriedades antioxidantes, proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos, proteínas relacionadas com o transporte celular e proteínas envolvidas no enovelamento de proteínas e proteólise. Uma das conseqüências do estresse por cádmio é o aumento do estresse oxidativo e proteínas antioxidantes têm um papel fundamental na resposta a este tipo de estresse. Dentre os genes observados durante o seqüenciamento das ESTs de B. emersonii, observamos dez genes codificando proteínas distintas da família Hsp70. Nove genes hsp70 são expressos em pelo menos um dos estágios do desenvolvimento do fungo e sete apresentam uma indução significativa após o choque térmico. Estes dados sugerem que estes genes desempenham um papel importante durante o desenvolvimento e em resposta ao estresse térmico em B. emersonii. Outro dado interessante obtido neste trabalho foi o enriquecimento de ESTs que continham íntrons em sua seqüência nas bibliotecas de estresse. Portanto, o choque térmico e o estresse por cádmio em B. emersonii diminuem a eficiência de processamento dos íntrons permitindo sua caracterização. O cDNA da proteína Hsp17 foi o que apresentou o maior número de ESTs seqüenciadas nas bibliotecas de estresse. Experimentos de Northern blot indicaram que o gene hsp17 possui um nível de expressão muito baixo durante o ciclo de vida de B. emersonii, no entanto, como esperado sua expressão aumenta drasticamente quando as células de esporulação ou germinação são submetidas a choque térmico. Os níveis da proteína Hsp17 acompanham os níveis do seu mRNA, indicando que o controle da expressão do gene hsp17 deve ocorrer em nível de transcrição. / In this work we realized a large scale, sequencing program of cDNAs libraries obtained from mRNA of B. emersonii cells submitted to heat shock and cadmium stress. A total of 6350 high quality expressed sequence tags (ESTs) were obtained, representing 2326 unique putative genes (unigenes) of this fungus. From these putative unigenes, 1282 genes were classified at least in one of the three Gene Ontology Consortium (GO) categories. The analysis of the partial transcriptome of B. emersonii, determined until now, allowed the identification of 78 unigenes encoding molecular chaperones of all known protein families. To evaluate the global expression of the genes in response to environmental stresses, such as heat shock and cadmium, DNA microarray assays were performed. We observed that in response to heat shock B. emersonii induces the expreession of genes encoding proteins related to protein folding and proteolysis, as expected under high temperature conditions, as well as genes encoding proteins with antioxidant properties and proteins involved in nucleotide and carbohydrate metabolism. In response to cadmium stress, we mainly verified the induction of genes for proteins with antioxidant properties, proteins involved in amino acid metabolism, proteins related to cellular transport and proteins related to protein folding and proteolysis. One of the consequences of the exposure to cadmium is the increase of oxidative stress, and antioxidant proteins have a fundamental role in the response to this kind of injury. Amongst the genes observed during the B. emersonii EST sequencing program, ten genes encoding distinct proteins from the Hsp70 family were observed. Nine of them are expressed at least in one stage of the fungus development and seven genes presented a significant induction during heat shock treatment. These data suggest that the hsp70 genes perform an important role during development and in response to heat stress in B. emersonii. Another interesting result from this work was the enrichment of ESTs containing introns in the stress libraries. Thus, heat shock and cadmium stress decrease the efficiency of intron processing in B. emersonii, allowing for intron characterization. The cDNA for the Hsp17 protein presented the highest number of ESTs sequenced from the stress libraries. Northern blot experiments indicated that the hsp17 gene is expressed at very low levels throughout the life cycle of B. emersonii, however, as expected its expression increases drastically when sporulation or germination cells are submitted to heat shock. Hsp17 protein levels accompany its mRNA levels, indicating that the control of expression of the hsp17 gene occurs at a transcriptional level.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-17T18:21:20Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2822554 bytes, checksum: 7bef13d6e29446a21866e18f47787668 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T18:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2822554 bytes, checksum: 7bef13d6e29446a21866e18f47787668 (MD5) Previous issue date: 2005-02-23 / A proteína BiP ("binding protein") de plantas tem sido descrita como um importante mediador de translocação, dobramento e montagem de proteínas recém-sintetizadas no lúmem do retículo endoplasmático, exibindo uma forte indução em resposta a uma variedade de estresses bióticos e abióticos. Apesar de sua relevância funcional, muito pouco se sabe com relação aos mecanismos de regulação da expressão dos genes BiP de plantas e da estrutura de seus promotores. Nesta investigação, dois promotores de BiP de soja, designados gsBiP6 e gsBiP9, bem como diferentes extensões de suas extremidades 5' foram fusionados ao gene repórter beta-glucuronidase (GUS) e introduzidas em Nicotiana tabacum via transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Os promotores de gsBiP6 e gsBiP9 possuem cis-elementos gerais, característicos de promotores de genes de plantas, como as seqüências de transcrição CAAT e TATA, e cis-elementos que respondem a estresses do retículo endoplasmático (ERSE), além de seqüências relacionadas com o G-box. Ensaios de atividade de GUS em discos foliares transformados com os genes quiméricos BiP6-GUS e BiP9-GUS demonstraram que o promotor de gsBiP6 é induzido por uma variedade de estresses, enquanto gsBiP9 é induzido apenas por tunicamicina, um potente ativador da via de resposta a proteínas mal-dobradas (UPR). Além disso, análises histoquímicas de plantas transformadas com as construções -358pbip6-gus (BiP6) e -2200pbip9-gus (BiP9) revelaram que os promotores de BiP produziram um padrão intenso e uniforme de expressão de GUS em folhas, caules, raízes e meristemas apicais. Este padrão de distribuição espacial da atividade de GUS está correlacionado com uma expressão desses genes em tecidos que apresentam alta atividade celular secretória e alta proporção de células em um processo ativo de divisão celular. Análises de deleções do promotor de gsBiP9 em plantas transformadas identificaram dois domínios regulatórios cis-atuantes, denominados CRD-1 (-1090 a -670) e CRD-2 (-670 a +1), que são importantes para regulação espacial dos promotores de BiP em condições normais de desenvolvimento. A região de CRD-1 é caracterizada pela predominância quase absoluta de adenina e timina exibindo uma alta atividade do gene repórter GUS. Este domínio funcional possui uma atividade similar à de “enhancer”, já que é capaz de restaurar altos níveis de expressão quando fusionado diretamente à extremidade 5’ do promotor de BiP9. De fato, a atividade do gene repórter -glucuronidase (GUS) nas plantas contendo esse domínio regulatório cis-atuante foi praticamente idêntica àquela exibida pelo promotor inteiro. Além disso, a análise histoquímica e fluorimétrica de plantas contendo tais seqüências mostraram um aumento significativo na atividade do gene repórter GUS. A região de CDR-2 é caracterizada por conter elementos regulatórios positivos, que coordenam a expressão tecido-específica do promotor de gsBiP9, sendo capaz de restaurar em parte, os níveis de expressão basal do gene repórter GUS, uma vez que se detectou atividade do promotor em raízes e caule, entretanto, os níveis de expressão em folhas, principalmente na região dos feixes vasculares, não foram suficientemente altos e nem tão pouco de forma generalizada como visto nas construções contendo o promotor completo de BiP, sendo necessário seqüências adicionais delimitadas até a posição -1090 para uma alta atividade. Estes resultados sugerem que o controle da expressão dos genes BiP de plantas envolve múltiplos e complexos mecanismos e depende de uma complexa integração de múltiplos cis-elementos regulatórios no promotor. / Plant BiP (binding protein) has been described as an important mediator of translocation, folding and assembly of nascent secretory proteins in the endoplasmic reticulum lumen and it responds to a variety of biotic and abiotic stresses. Despite its functional relevance, little is known about the regulation mechanisms of plant BiP gene expression and the structure of their promoters. Here, we have fused two BiP promoters, designated gsBiP6 and gsBiP9, as well as different extensions of their 5'-flanking sequences to beta-glucuronidase (GUS) reporter gene and introduced into Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The gsBiP6 and gsBiP9 promoters possess cis-regulatory elements of most plant promoters, such as CAAT e TATA boxes, in addition to potential regulatory cis-elements, such as endoplasmic reticulum stress elements (ERSE) and G-box-related sequences. GUS activity assays from leaf discs expressing BiP6- GUS e BiP9-GUS demonstrated that gsBiP6 promoter is induced by a variety of stress conditions, whereas the induction of gsBiP9 is restricted to tunicamycin treatment, a potent activator of the unfolded protein response (UPR) pathway. Furthermore, histochemical analysis of transgenic lines harbouring -358pbip6-gus (BiP6) and -2200pbip9-gus (BiP9) revealed that BiP promoters drove an intense and uniform pattern of GUS expression in leaves and stems, with the expression of BiP genes in tissues with high secretory activity and in regions of intense cell division. Promoter deletion analyses allowed to identify two cis-regulatory functional domains, designated CRD-1 (-1090 to -670) and CRD-2 (-670 to +1), that are important for the spatially-regulated activation of BiP expression under normal plant development. CRD-1 corresponds to an AT-rich enhancer-like region, capable of promoting a significant increase in GUS activity in all analysed tissues. CDR-2 is able to maintain a basal expression of the reporter gene in root, stem and leaves and, most likely, it contains all the required elements of a eukaryotic promoter. In spite of that, the gene reporter expression levels driven by CRD-2 domain were not sufficiently high in these organs, and GUS activity were not detected in apical meristems. In fact, the BiP promoter activity in meristematic tissues requires the presence of a second activating domain CRD-1 (-1090 to -670), that corresponds to an AT-rich enhancer-like region, capable of promoting a significant increase in GUS activity in all analysed tissues. These results suggest that the tissue-specific control of BiP gene expression requires a complex integration of multiple cis- acting regulatory elements on the promoter. / Dissertação importada do Alexandria