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Doctor of Philosophy / Department of Entomology / Kun Yan Zhu / Chitin metabolism represents an attractive target site for combating insect pests as insect growth and development are strictly dependent on precisely toned chitin synthesis and degradation and this process is absent in humans and other vertebrates. However, current understanding on this process and the involved enzymes is rather limited in insects. In this study, two chitin synthase genes (AgCHS1 and AgCHS2 or AgCHSA and AgCHSB), and 20 chitinase and chitinase-like genes (groups I-VIII) presumably encoding the enzymes for chitin biosynthesis and degradation, respectively, were identified and characterized in African malaria mosquito, Anopheles gambiae. Immunohistochemistry analysis and developmental stage- and tissue-dependent transcript profiling by using reverse transcription PCR, real-time quantitative PCR, and in situ hybridization revealed new information on these genes. Current understanding on chitin synthases is extended by the expression profiles such as the localization of AgCHS1 and AgCHS2 transcripts in eggs, AgCHS2 transcripts in the posterior larval midgut, AgCHS1 and AgCHS2 proteins in the compound eyes, and AgCHS2 enzyme in pupal inter-segments. Chitinase and chitinase-like genes are highly diverse in their gene structure, domain organization, and stage- and tissue-specific expression patterns. Most of these genes were expressed in several stages. However, some genes are stage- and tissue-specific such as AgCht8 mainly in pupal and adult stages, AgCht2 and AgCht12 specifically in foregut, AgCht13 exclusively in midgut. Functional analysis of each chitin synthase gene was conducted by using the chitosan/dsRNA nanoparticle-based RNA interference (RNAi) through larval feeding. The repression of the AgCHS1 transcripts which are predominantly expressed in carcass initiated from the mosquito larval feeding of dsRNA suggests the systemic nature of RNAi in mosquito larvae. In addition, silencing of AgCHS1 increased larval susceptibilities to diflubenzuron, whereas silencing of AgCHS2 enhanced the peritrophic matrix disruption and thus increased larval susceptibilities to calcofluor white or dithiothreitol. Furthermore, a non-radioactive method was adapted and optimized to examine the chitin synthase activity in mosquitoes. By using this method, diflubenzuron and nikkomycin Z show limited in vitro inhibition on chitin synthase at high concentration in cell free system, whereas no in vivo inhibition was observed.

Bactérias quitinolíticas são autóctones do ecossistema marinho e tem um importante papel no processo de degradação de quitina. Relativamente pouco é conhecido sobre a diversidade e potencial enzimático de bactérias quitinolíticas isoladas de ambientes tropicais costeiros. Amostras de água do mar e de plâncton foram coletadas no Canal de São Sebastião, Baixada Santista e Ubatuba. As bactérias quitinolíticas foram enumeradas e isoladas em meio mínimo contendo quitina coloidal e caracterizadas através de métodos fenotípicos e genotípicos. As maiores contagens de bactérias quitinolíticas foram observadas em amostras de água do mar e plâncton coletadas na Baixada Santista. A diversidade de bactérias quitinolíticas e o potencial de produção de quitinases foram influenciados pelo nível de contaminação fecal presente no ecossistema marinho. Uma maior diversidade foi encontrada em ambiente com médio e baixo impacto antropogênico, mas bactérias quitinolíticas isoladas de ambiente com alta atividade antropogênica mostraram os maiores valores de produção de quitinases. / Chitinolytic bacteria are autochthonous in marine ecosystems and have an important role in chitin degradation process. A very little is know about the diversity and enzymatic potential of chitinolytic bacteria isolated from coastal tropical environments. Seawater and plankton samples were collected at Canal de São Sebastião, Baixada Santista and Ubatuba. Chitinolytic bacteria were counted and isolated in minimal media containing colloidal chitin and characterized using phenotypic and genotypic methods. Highest counts of chitinolytic bacteria were observed in seawater and plankton samples collected at Baixada Santista. The diversity of chitinolytic bacteria and the potential of chitinases production were influenced by the level of fecal contamination present in the marine ecosystem. Highest diversity was found in environment with medium and low anthropogenic impact, but chitinolytic bacteria isolated from environment with high anthropogenic influences showed highest chitinases production.

Agricultores e técnicos envolvidos na citricultura orgânica procuram desenvolver sistemas de produção com maior atividade microbiana no solo. Dessa maneira, esperam obter benefícios dos processos que ocorrem no solo, entre eles, o controle natural de pragas e doenças. Porém, são poucos os estudos sobre a influência desse tipo de manejo sobre a microbiota do solo, em especial sobre os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) e o patógeno Phytophthora parasitica. Os objetivos dessa tese foram: avaliar a colonização micorrízica e conhecer a diversidade de FMAs nos sistemas de produção convencional e orgânico de citros; avaliar a aplicação de benomyl e da radiação γ na obtenção de testemunhas não micorrizadas para estudo de interação de comunidade de FMAs nativos e P. parasitica; verificar a capacidade indutora de resistência local e sistêmica dos FMAs nativos a P. parasitica; estudar atividade da quitinase no sistema radicular de limão 'Cravo' colonizado por fungos micorrízicos nativos. Foram realizadas amostragens em dois sistemas de produção de citros em São Paulo, um convencional e um orgânico. A riqueza e a diversidade de espécies de FMAs foram maiores no manejo orgânico. No entanto, a porcentagem de colonização micorrízica nas plantas no campo não variou com o tipo de manejo. Em casa de vegetação, experimentos com plantas de limão 'Cravo' (Citrus limonia) mostraram que a radiação γ foi mais adequada que a aplicação de benomyl na obtenção de testemunhas não micorrizadas para estudo de interação P. parasitica- FMAs nativos de agroecossistemas de produção de laranja. Também em casa de vegetação, foi realizado um experimento com raiz dividida de plantas de limão 'Cravo'. Não foi possível avaliar a capacidade indutora de resistência dos fungos micorrízicos arbusculares nativos porque não houve desenvolvimento da podridão de raízes nas plantas de limão 'Cravo' após a infestação com P. parasitica. Discute-se a interação de patógenos de raiz do solo natural e os FMAs nativos porque o solo natural dos sistemas de produção convencional e orgânico promoveram diferentes respostas de crescimento local e sistêmico das raízes das plantas micorrizadas. A atividade de quitinase foi igual nas raízes de plantas micorrizadas e não micorrrizadas cultivadas em solos dos sistemas de produção convencional e orgânico. Porém, a associação micorrízica aumentou localmente a proteína total nas raízes das plantas. / Farmers and technicians involved with organic citriculture try to develop systems with high microbial activity in soil. In this way, they expect to obtain benefits from processes that occur in soil, as natural control of pests and diseases. However, there are few studies about the influence of this type of management on soil microbiota, specially on the arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and the pathogen Phytophthora parasitica. The objectives of this thesis were: to evaluate mycorrhizal colonization and diversity of AMF in citrus conventional and organic farming; to evaluate benomyl application and γ radiation to obtain non-mycorrhizal controls for study of interaction between indigenous AMF and P. parasitica; to verify local and systemic capacity of indigenous AMF to induce resistance against P. parasitica; to study chitinase activity in roots of 'Rangpur' lime colonized by indigenous AMF. Samplings were carried out in two citrus systems in São Paulo, one conventional and one organic farming. The richness and the diversity of AMF species were higher in the organic farming. In greenhouse, experiments with 'Rangpur' lime (Citrus limonia) showed that γ radiation was better than benomyl to obtain non-mycorrhizal control for studies of interaction between P. parasitica-indigenous AMF from orange agroecosystems. In greenhouse also, a split root experiment with 'Rangpur' lime was carried out. It was not possible to evaluate the indigenous AMF capacity to induce resistance because no root rot developed in 'Rangpur' lime plants after inoculation with P. parasitica. We discuss the interaction between root pathogens in natural soil and indigenous AMF because natural soil from conventional e organic farming promoted different local and systemic root growth responses in mycorrhizal plants. Chitinase activity was similar in roots of mycorrhizal and non-mycorrhizal plants grown in conventional and organic farming soils. However, mycorhizal association increased local protein content in roots.

Espécies do gênero Paracoccidioides spp são fungos patogênicos, termodimórficos, agentes etiológicos de doença endêmica em diversas regiões da América Latina. O indivíduo infectado desenvolve uma resposta específica que, quando associada à alta produção de TNF-? e IFN-?, favorece a resistência ao fungo. Componentes de alguns fungos patogênicos foram caracterizados, por técnicas de knockdown gênico, como importantes para a virulência fúngica. Nosso grupo identificou paracoccina (PCN) como um componente de leveduras de P. brasiliensis; trata-se de uma proteína com um domínio enzimático, dotado de atividade quitinase e um domínio lectínico, ligante de GlcNAc. PCN é dotada das seguintes propriedades: (a) contribui para o crescimento do fungo; (b) promove a adesão da levedura à matriz extracelular, por ligar-se à laminina; (c) interage com N-glicanas de TLR2 e TLR4 e promove ativação celular; (d) estimula macrófagos a produzirem mediadores pró-inflamatórios como IL- 12, TNF-? e NO; (e) promove a polarização M1 de macrófagos; (f) induz atividade fungicida em neutrófilos, bem como formação de NETs e supressão da apoptose, eventos que se mostraram dependentes da síntese de novo de proteínas pelos neutrófilos estimulados. Dada a relevância das atividades biológicas de PCN, promovemos recentemente o silenciamento do gene que codifica essa proteína, através de metodologia que usa RNA anti-sense e transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT). Uma vez PCN silenciada, a levedura perdeu a capacidade de fazer a transição para micélio e diminuiu a resistência à atividade fungicida de macrófagos. A infecção de camundongos com as cepas silenciadas, em comparação com as WT, causou doença de menor gravidade, com carga fúngica reduzida e baixa taxa de mortalidade. Essas observações sugerem de que PCN funcione como um fator de virulência em P. brasiliensis, que afeta a patogênese da infecção. Neste trabalho, ampliamos as ferramentas moleculares de manipulação do fungo e viabilizamos a superexpressão de PCN em leveduras de P. brasiliensis, tendo como objetivos estudar seu papel na virulência e na patogênese da infecção, bem como determinar os mecanismos responsáveis por tais atividades. A inoculação de leveduras que superexpressam PCN (ov-PCN) em camundongos causou doença pulmonar muito grave, em comparação à doença leve e moderada causada por leveduras silenciadas em PCN e leveduras WT, respectivamente. Nesse sentido, nossos esforços se dedicaram à busca dos mecanismos dos mecanismos através dos quais PCN influencia o curso da infecção experimental. Na tentativa de identificar o papel exercido pelo domínio quitinase da PCN, coletamos o sobrenadante de culturas de leveduras ov-PCN e WT. Partículas de quitina presentes nesses sobrenadantes foram purificadas por afinidade à lectina WGA (wheat germ agglutinin). Através de medida da área das partículas capturadas, através de microscopia eletrônica e aplicação do programa ImageJ, verificamos que a superexpressão de PCN resultou em clivagem mais eficiente da quitina da parede de leveduras, uma vez que apenas partículas muito pequenas (mediana das medidas = 2 nm2) foram detectadas, enquanto as áreas das partículas de quitina obtidas de leveduras selvagens (WT) forneceram mediana 3 vezes maior (6 nm2). As partículas de quitina foram então utilizadas para estimular macrófagos a produzirem citocinas. As obtidas de ov-PCN estimularam preponderantemente a secreção da citocina antiinflamatória IL-10, enquanto os macrófagos estimulados com partículas de leveduras WT produziram mais TNF-? e IL-1?, ambas de efeito pró-inflamatório. Esses resultados permitiram a identificação de um mecanismo importante para que a superexpressão de PCN se associe à ocorrência de doença pulmonar muito grave: o microambiente anti-inflamatório criado pelo estímulo de macrófagos por PCN leva ao desenvolvimento de resposta imune não protetora do tipo Th2 e lesões mais graves. Um segundo mecanismo foi identificado ao compararmos a resistência de leveduras ov-PCN e WT às respostas efetoras de macrófagos. A superexpressão de PCN associou-se à maior internalização das leveduras e maior resistência à atividade fungicida exercida por macrófagos. O estudo demonstra que diferentes níveis da expressão de uma quitinase (como PCN) levam à resistência a atividades antifúngicas de macrófagos e a diferentes graus de clivagem de quitina. A clivagem, por sua vez, pode alterar a estrutura da parede celular fúngica e a geração de fragmentos de quitina, cujos tamanhos e concentrações influenciam a produção de citocinas pelos macrófagos. Sob a ação de citocinas pró- ou antiinflamatórias liberadas pelos macrófagos e, consequentemente, a montagem de respostas adaptativas pode ser decisiva para haver suscetibilidade ou resistência à infecção por P. brasiliensis. Este trabalho proporciona um importante avanço no conhecimento do papel de quitinases na resposta anti-fúngica do hospedeiro. / Species of the genus Paracoccidioides spp are thermodymorphic fungi that cause a systemic disease, which is endemic in several regions of the Latin America. The infected individual develops a specific response that, when associated with the high production of TNF-? and IFN- ?, favors resistance to the fungus. Components of some pathogenic fungi were characterized by gene knockdown techniques as important the for fungal virulence. Our group has identified a component of P. brasiliensis, named Paracoccin (PCN); it is a bifunctional protein with an enzymatic domain, endowed with chitinase activity and a lectin domain, which binds GlcNAc and chitin, a GlcNAc polymers. PCN has the following properties: (a) contributes to the fungus growth; (b) promotes the yeast adhesion to the extracellular matrix, by binding to laminina glycans; (c) interacts with TLR2 and TLR4 N-glycans, which triggers cell activation; (d) stimulates macrophages to produce proinflammatory mediators, such as IL-12, TNF-? and NO; (e) promotes the M1 polarization of macrophages; (f) induces the neutrophils fungicidal activity, NETs formation, and suppression of neutrophils apoptosis, which are depending events on the de novo protein synthesis by neutrophils. Given the relevant biological activities exerted by PCN, we have performed recently the silencing of the gene that codes for this protein through a system that uses RNA anti-sense and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT). Once having the PCN gene silenced, yeast lost the ability of doing the transition to mycelium and decreased its resistance to macrophages fungicidal activities. Mice infection with PCN-silenced yeasts, compared to the infected with WT yeasts, exhibited a milder pulmonary disease with reduced fungal burden and low mortality rate. These observations suggest that PCN acts as a P. brasiliensis virulence factor that affects the pathogenesis of the fungal infection. In the present study, we expanded the molecular tools for the fungus manipulation and enabled the overexpression of PCN in P. brasiliensis yeasts, aiming to elucidate the PCN role in the fungus virulence and the infection pathogenesis, as well as determining the responsible mechanisms for the PCN activities. Inoculation of the PCN overexpressing yeasts (ov-PCN) into mice caused a very severe lung disease, compared to the mild and moderate diseases caused by PCN-silenced and WT yeasts, respectively. Then our efforts became dedicated to the search of mechanisms through which PCN influences the course of the experimental fungal disease. In an attempt to identify the role of the PCN chitinase domain, we harvested the supernatant of the ov-PCN and WT yeasts cultures. Chitin particles contained in the supernatants have been captured by affinity to the immobilized WGA (wheat germ agglutinin) lectin. By measuring through electron microscopy and application of the ImageJ program the area of the isolated chitin particles, we verified that the overexpression of PCN resulted in a more efficient cleavage of whole chitin molecules contained in the yeast cell wall, since only very small particles (median of the measurements = 2 nm2) were detected, while the the chitin particles areas obtained from WT-yeasts provided a median 3 fold higher (6 nm2). Then, the preparations of chitin particles were taken to stimulate macrophages to produce cytokines. The particles obtained from ov-PCN have stimulated preponderantly the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10, whereas the macrophages stimulated with WT yeast particles have produced higher concentrations of TNF-? and IL-1?, which are known proinflammatory cytokines. These results allowed the identification of an important mechanism for the association of PCN overexpression to the occurrence of very severe pulmonary disease: the anti-inflammatory microenvironment created by the macrophages stimulation with PCN leads to the development of a non-protective Th2-type immune response and the more severe pulmonary injury. A second mechanism was identified as implicated in the severity of the lung disease associated to PCN overexpression. We compared the sensitivity of ov-PCN and WT yeasts to macrophages effector functions. PCN overexpressing yeasts were better internalized by macrophages and more resistant to the fungicidal activity of these cells, events that contributes for the high pulmonary fungal load verified in mice infected with ov-PCN yeasts. The study demonstrates that different levels of a chitinase (PCN) expression and enzymatic activity lead yeasts to change their sensitivity to macrophages antifungal activities as well as to different grades of chitin cleavage. The cleavage, in its turn, leads to changes in the structure of the fungal cell wall and generation of chitin fragments, whose sizes and concentrations influence the cytokines production by macrophages. Under the influence of pro-inflammatory or anti-inflammatory cytokines released by macrophages, the mounted adaptative responses can be decisive in conferring susceptibility or resistance to the P. brasiliensis infection. This study provides an important advance in the knowledge on the role of a chitinase in the host antifungal response.

Espécies do gênero Paracoccidioides spp são fungos patogênicos, termodimórficos, agentes etiológicos de doença endêmica em diversas regiões da América Latina. O indivíduo infectado desenvolve uma resposta específica que, quando associada à alta produção de TNF-? e IFN-?, favorece a resistência ao fungo. Componentes de alguns fungos patogênicos foram caracterizados, por técnicas de knockdown gênico, como importantes para a virulência fúngica. Nosso grupo identificou paracoccina (PCN) como um componente de leveduras de P. brasiliensis; trata-se de uma proteína com um domínio enzimático, dotado de atividade quitinase e um domínio lectínico, ligante de GlcNAc. PCN é dotada das seguintes propriedades: (a) contribui para o crescimento do fungo; (b) promove a adesão da levedura à matriz extracelular, por ligar-se à laminina; (c) interage com N-glicanas de TLR2 e TLR4 e promove ativação celular; (d) estimula macrófagos a produzirem mediadores pró-inflamatórios como IL- 12, TNF-? e NO; (e) promove a polarização M1 de macrófagos; (f) induz atividade fungicida em neutrófilos, bem como formação de NETs e supressão da apoptose, eventos que se mostraram dependentes da síntese de novo de proteínas pelos neutrófilos estimulados. Dada a relevância das atividades biológicas de PCN, promovemos recentemente o silenciamento do gene que codifica essa proteína, através de metodologia que usa RNA anti-sense e transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT). Uma vez PCN silenciada, a levedura perdeu a capacidade de fazer a transição para micélio e diminuiu a resistência à atividade fungicida de macrófagos. A infecção de camundongos com as cepas silenciadas, em comparação com as WT, causou doença de menor gravidade, com carga fúngica reduzida e baixa taxa de mortalidade. Essas observações sugerem de que PCN funcione como um fator de virulência em P. brasiliensis, que afeta a patogênese da infecção. Neste trabalho, ampliamos as ferramentas moleculares de manipulação do fungo e viabilizamos a superexpressão de PCN em leveduras de P. brasiliensis, tendo como objetivos estudar seu papel na virulência e na patogênese da infecção, bem como determinar os mecanismos responsáveis por tais atividades. A inoculação de leveduras que superexpressam PCN (ov-PCN) em camundongos causou doença pulmonar muito grave, em comparação à doença leve e moderada causada por leveduras silenciadas em PCN e leveduras WT, respectivamente. Nesse sentido, nossos esforços se dedicaram à busca dos mecanismos dos mecanismos através dos quais PCN influencia o curso da infecção experimental. Na tentativa de identificar o papel exercido pelo domínio quitinase da PCN, coletamos o sobrenadante de culturas de leveduras ov-PCN e WT. Partículas de quitina presentes nesses sobrenadantes foram purificadas por afinidade à lectina WGA (wheat germ agglutinin). Através de medida da área das partículas capturadas, através de microscopia eletrônica e aplicação do programa ImageJ, verificamos que a superexpressão de PCN resultou em clivagem mais eficiente da quitina da parede de leveduras, uma vez que apenas partículas muito pequenas (mediana das medidas = 2 nm2) foram detectadas, enquanto as áreas das partículas de quitina obtidas de leveduras selvagens (WT) forneceram mediana 3 vezes maior (6 nm2). As partículas de quitina foram então utilizadas para estimular macrófagos a produzirem citocinas. As obtidas de ov-PCN estimularam preponderantemente a secreção da citocina antiinflamatória IL-10, enquanto os macrófagos estimulados com partículas de leveduras WT produziram mais TNF-? e IL-1?, ambas de efeito pró-inflamatório. Esses resultados permitiram a identificação de um mecanismo importante para que a superexpressão de PCN se associe à ocorrência de doença pulmonar muito grave: o microambiente anti-inflamatório criado pelo estímulo de macrófagos por PCN leva ao desenvolvimento de resposta imune não protetora do tipo Th2 e lesões mais graves. Um segundo mecanismo foi identificado ao compararmos a resistência de leveduras ov-PCN e WT às respostas efetoras de macrófagos. A superexpressão de PCN associou-se à maior internalização das leveduras e maior resistência à atividade fungicida exercida por macrófagos. O estudo demonstra que diferentes níveis da expressão de uma quitinase (como PCN) levam à resistência a atividades antifúngicas de macrófagos e a diferentes graus de clivagem de quitina. A clivagem, por sua vez, pode alterar a estrutura da parede celular fúngica e a geração de fragmentos de quitina, cujos tamanhos e concentrações influenciam a produção de citocinas pelos macrófagos. Sob a ação de citocinas pró- ou antiinflamatórias liberadas pelos macrófagos e, consequentemente, a montagem de respostas adaptativas pode ser decisiva para haver suscetibilidade ou resistência à infecção por P. brasiliensis. Este trabalho proporciona um importante avanço no conhecimento do papel de quitinases na resposta anti-fúngica do hospedeiro. / Species of the genus Paracoccidioides spp are thermodymorphic fungi that cause a systemic disease, which is endemic in several regions of the Latin America. The infected individual develops a specific response that, when associated with the high production of TNF-? and IFN- ?, favors resistance to the fungus. Components of some pathogenic fungi were characterized by gene knockdown techniques as important the for fungal virulence. Our group has identified a component of P. brasiliensis, named Paracoccin (PCN); it is a bifunctional protein with an enzymatic domain, endowed with chitinase activity and a lectin domain, which binds GlcNAc and chitin, a GlcNAc polymers. PCN has the following properties: (a) contributes to the fungus growth; (b) promotes the yeast adhesion to the extracellular matrix, by binding to laminina glycans; (c) interacts with TLR2 and TLR4 N-glycans, which triggers cell activation; (d) stimulates macrophages to produce proinflammatory mediators, such as IL-12, TNF-? and NO; (e) promotes the M1 polarization of macrophages; (f) induces the neutrophils fungicidal activity, NETs formation, and suppression of neutrophils apoptosis, which are depending events on the de novo protein synthesis by neutrophils. Given the relevant biological activities exerted by PCN, we have performed recently the silencing of the gene that codes for this protein through a system that uses RNA anti-sense and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT). Once having the PCN gene silenced, yeast lost the ability of doing the transition to mycelium and decreased its resistance to macrophages fungicidal activities. Mice infection with PCN-silenced yeasts, compared to the infected with WT yeasts, exhibited a milder pulmonary disease with reduced fungal burden and low mortality rate. These observations suggest that PCN acts as a P. brasiliensis virulence factor that affects the pathogenesis of the fungal infection. In the present study, we expanded the molecular tools for the fungus manipulation and enabled the overexpression of PCN in P. brasiliensis yeasts, aiming to elucidate the PCN role in the fungus virulence and the infection pathogenesis, as well as determining the responsible mechanisms for the PCN activities. Inoculation of the PCN overexpressing yeasts (ov-PCN) into mice caused a very severe lung disease, compared to the mild and moderate diseases caused by PCN-silenced and WT yeasts, respectively. Then our efforts became dedicated to the search of mechanisms through which PCN influences the course of the experimental fungal disease. In an attempt to identify the role of the PCN chitinase domain, we harvested the supernatant of the ov-PCN and WT yeasts cultures. Chitin particles contained in the supernatants have been captured by affinity to the immobilized WGA (wheat germ agglutinin) lectin. By measuring through electron microscopy and application of the ImageJ program the area of the isolated chitin particles, we verified that the overexpression of PCN resulted in a more efficient cleavage of whole chitin molecules contained in the yeast cell wall, since only very small particles (median of the measurements = 2 nm2) were detected, while the the chitin particles areas obtained from WT-yeasts provided a median 3 fold higher (6 nm2). Then, the preparations of chitin particles were taken to stimulate macrophages to produce cytokines. The particles obtained from ov-PCN have stimulated preponderantly the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10, whereas the macrophages stimulated with WT yeast particles have produced higher concentrations of TNF-? and IL-1?, which are known proinflammatory cytokines. These results allowed the identification of an important mechanism for the association of PCN overexpression to the occurrence of very severe pulmonary disease: the anti-inflammatory microenvironment created by the macrophages stimulation with PCN leads to the development of a non-protective Th2-type immune response and the more severe pulmonary injury. A second mechanism was identified as implicated in the severity of the lung disease associated to PCN overexpression. We compared the sensitivity of ov-PCN and WT yeasts to macrophages effector functions. PCN overexpressing yeasts were better internalized by macrophages and more resistant to the fungicidal activity of these cells, events that contributes for the high pulmonary fungal load verified in mice infected with ov-PCN yeasts. The study demonstrates that different levels of a chitinase (PCN) expression and enzymatic activity lead yeasts to change their sensitivity to macrophages antifungal activities as well as to different grades of chitin cleavage. The cleavage, in its turn, leads to changes in the structure of the fungal cell wall and generation of chitin fragments, whose sizes and concentrations influence the cytokines production by macrophages. Under the influence of pro-inflammatory or anti-inflammatory cytokines released by macrophages, the mounted adaptative responses can be decisive in conferring susceptibility or resistance to the P. brasiliensis infection. This study provides an important advance in the knowledge on the role of a chitinase in the host antifungal response.

The Arabidopsis chitinase-like1 (Atctl1) mutant, pom1 is compromised in primary cell wall development, resulting in short roots when grown on high sucrose and shortened hypocotyls when grown in darkness. To better understand this phenotype and the evolution of AtCTL1 and its homologue, AtCTL2, we obtained a large number of CTL sequences and determined the phylogenetic relationships among them. Since microarray analysis had suggested a change in auxin response or homeostasis in pom1, I used the auxin reporter DR5::GUS in the pom1 background to assess changes in distribution. To assess whether the biochemical functions of AtCTL1 homologues in Arabidopsis and other plants are conserved, I transformed pom1 with AtCTL2 and CTLs from poplar (Populus trichocarpa x Populus deltoides clone H-11) and from Picea glauca (spruce) and assessed rescue of the pom1 phenotype. To further understand CTL expression and function, Arabidopsis and poplar CTL promoter::GUS fusions were also expressed in Arabidopsis, PopCTL1 overexpressed in Arabidopsis, and CTL expression down regulated in poplar by RNAi. Our results indicate that CTL genes represent an ancient family encoding proteins of conserved biochemical function. In dicots, represented by Arabidopsis and poplar) duplicated CTL genes are differentially expressed in conjunction with primary and secondary cell wall development, respectively. Mutation of these genes results in improperly formed primary walls in certain cell types in the case of AtCTL1, and an impairment in the differentiation of vascular bundles for AtCTL2. Overexpression of PopCTL1 in Arabidopsis seems to over stimulate the differentiation of vascular bundles, and our studies show that auxin distribution is altered in the Atctl1 mutant. Down regulation of PopCTL1 and PopCTL2 in poplar appears to phenocopy aspects of these mutations, resulting in secondary cell walls that appear to have less deposition of lignin and an accelerated production of secondary xylem respectively. While specific biochemical function(s) of CTL genes were not studied, potential functions are discussed.

The Arabidopsis chitinase-like1 (Atctl1) mutant, pom1 is compromised in primary cell wall development, resulting in short roots when grown on high sucrose and shortened hypocotyls when grown in darkness. To better understand this phenotype and the evolution of AtCTL1 and its homologue, AtCTL2, we obtained a large number of CTL sequences and determined the phylogenetic relationships among them. Since microarray analysis had suggested a change in auxin response or homeostasis in pom1, I used the auxin reporter DR5::GUS in the pom1 background to assess changes in distribution. To assess whether the biochemical functions of AtCTL1 homologues in Arabidopsis and other plants are conserved, I transformed pom1 with AtCTL2 and CTLs from poplar (Populus trichocarpa x Populus deltoides clone H-11) and from Picea glauca (spruce) and assessed rescue of the pom1 phenotype. To further understand CTL expression and function, Arabidopsis and poplar CTL promoter::GUS fusions were also expressed in Arabidopsis, PopCTL1 overexpressed in Arabidopsis, and CTL expression down regulated in poplar by RNAi. Our results indicate that CTL genes represent an ancient family encoding proteins of conserved biochemical function. In dicots, represented by Arabidopsis and poplar) duplicated CTL genes are differentially expressed in conjunction with primary and secondary cell wall development, respectively. Mutation of these genes results in improperly formed primary walls in certain cell types in the case of AtCTL1, and an impairment in the differentiation of vascular bundles for AtCTL2. Overexpression of PopCTL1 in Arabidopsis seems to over stimulate the differentiation of vascular bundles, and our studies show that auxin distribution is altered in the Atctl1 mutant. Down regulation of PopCTL1 and PopCTL2 in poplar appears to phenocopy aspects of these mutations, resulting in secondary cell walls that appear to have less deposition of lignin and an accelerated production of secondary xylem respectively. While specific biochemical function(s) of CTL genes were not studied, potential functions are discussed.

Agricultores e técnicos envolvidos na citricultura orgânica procuram desenvolver sistemas de produção com maior atividade microbiana no solo. Dessa maneira, esperam obter benefícios dos processos que ocorrem no solo, entre eles, o controle natural de pragas e doenças. Porém, são poucos os estudos sobre a influência desse tipo de manejo sobre a microbiota do solo, em especial sobre os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) e o patógeno Phytophthora parasitica. Os objetivos dessa tese foram: avaliar a colonização micorrízica e conhecer a diversidade de FMAs nos sistemas de produção convencional e orgânico de citros; avaliar a aplicação de benomyl e da radiação γ na obtenção de testemunhas não micorrizadas para estudo de interação de comunidade de FMAs nativos e P. parasitica; verificar a capacidade indutora de resistência local e sistêmica dos FMAs nativos a P. parasitica; estudar atividade da quitinase no sistema radicular de limão 'Cravo' colonizado por fungos micorrízicos nativos. Foram realizadas amostragens em dois sistemas de produção de citros em São Paulo, um convencional e um orgânico. A riqueza e a diversidade de espécies de FMAs foram maiores no manejo orgânico. No entanto, a porcentagem de colonização micorrízica nas plantas no campo não variou com o tipo de manejo. Em casa de vegetação, experimentos com plantas de limão 'Cravo' (Citrus limonia) mostraram que a radiação γ foi mais adequada que a aplicação de benomyl na obtenção de testemunhas não micorrizadas para estudo de interação P. parasitica- FMAs nativos de agroecossistemas de produção de laranja. Também em casa de vegetação, foi realizado um experimento com raiz dividida de plantas de limão 'Cravo'. Não foi possível avaliar a capacidade indutora de resistência dos fungos micorrízicos arbusculares nativos porque não houve desenvolvimento da podridão de raízes nas plantas de limão 'Cravo' após a infestação com P. parasitica. Discute-se a interação de patógenos de raiz do solo natural e os FMAs nativos porque o solo natural dos sistemas de produção convencional e orgânico promoveram diferentes respostas de crescimento local e sistêmico das raízes das plantas micorrizadas. A atividade de quitinase foi igual nas raízes de plantas micorrizadas e não micorrrizadas cultivadas em solos dos sistemas de produção convencional e orgânico. Porém, a associação micorrízica aumentou localmente a proteína total nas raízes das plantas. / Farmers and technicians involved with organic citriculture try to develop systems with high microbial activity in soil. In this way, they expect to obtain benefits from processes that occur in soil, as natural control of pests and diseases. However, there are few studies about the influence of this type of management on soil microbiota, specially on the arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and the pathogen Phytophthora parasitica. The objectives of this thesis were: to evaluate mycorrhizal colonization and diversity of AMF in citrus conventional and organic farming; to evaluate benomyl application and γ radiation to obtain non-mycorrhizal controls for study of interaction between indigenous AMF and P. parasitica; to verify local and systemic capacity of indigenous AMF to induce resistance against P. parasitica; to study chitinase activity in roots of 'Rangpur' lime colonized by indigenous AMF. Samplings were carried out in two citrus systems in São Paulo, one conventional and one organic farming. The richness and the diversity of AMF species were higher in the organic farming. In greenhouse, experiments with 'Rangpur' lime (Citrus limonia) showed that γ radiation was better than benomyl to obtain non-mycorrhizal control for studies of interaction between P. parasitica-indigenous AMF from orange agroecosystems. In greenhouse also, a split root experiment with 'Rangpur' lime was carried out. It was not possible to evaluate the indigenous AMF capacity to induce resistance because no root rot developed in 'Rangpur' lime plants after inoculation with P. parasitica. We discuss the interaction between root pathogens in natural soil and indigenous AMF because natural soil from conventional e organic farming promoted different local and systemic root growth responses in mycorrhizal plants. Chitinase activity was similar in roots of mycorrhizal and non-mycorrhizal plants grown in conventional and organic farming soils. However, mycorhizal association increased local protein content in roots.

Le latex de Carica papaya est un milieu riche en cystéine protéinases. Celles-ci ont été régulièrement utilisées en cosmétique ou pour l’attendrissement de la viande. Mais ces protéines ont aussi un intérêt pharmaceutique. En effet, le latex est bien connu pour posséder une activité antifongique mais aussi une activité anthelminthique. Ces effets sont régulièrement attribués aux cystéine protéinases qui se trouvent en concentration importante dans le latex. Malgré ces concentrations importantes en protéinases, d’autres protéines restent actives dans ce milieu. C’est le cas de la glutamine cyclase, qui a été extraite intacte de ce milieu et cristallisée. Sa structure nous a révélé une architecture particulière en ‘’&61538;-propeller‘’ à cinq pales avec double fermeture. Cette structure lui confère sa très grande stabilité. <p>Les industries pharmaceutiques sont aussi à la recherche de protéines très stables et résistantes aux protéinases endogènes. Nous avons donc entrepris l’étude du protéome de Carica papaya afin de mettre en évidence d’autres protéines minoritaires relativement stables pouvant conférer au latex son activité anthelminthique. Cette analyse a permis la mise en évidence de différentes protéines appartenant à diverses familles des « pathogenesis related protéins » (PR-proteins): une &61538;-1,3 glucosidase, une analogue à la barwin, une thaumatine et deux chitinases.<p>Nous nous sommes particulièrement intéressés à ces deux dernières au cours de cette thèse. Une caractérisation de ces deux protéines a permis de montrer que celles-ci étaient bien deux protéines distinctes, identifiées comme chitinases majeure et mineure selon leur abondance dans le latex. Elles sont relativement stables et résistantes à la protéolyse. Une analyse de la séquence de la chitinase majeure a montré que celle-ci était homologue à la chitinase issue de l’orge et une analyse de sa structure révèle la présence d’une grande concentration en prolines localisées principalement dans les neuf boucles de sa structure. Cela pourrait expliquer sa grande résistance vis à vis des cystéine protéinases.<p>La cristallisation de cette même chitinase en présence de N-acétyl-glucosamine comme additif, a conduit à une structure contenant trois molécules de GlcNac, deux dans le centre actif de notre protéine et une participant au réseau cristallin. Aucune structure de chitinase n’avait encore pu être obtenue en co-cristallisation avec un substrat. A partir des deux GlcNac observés dans le centre actif, nous avons reconstruit un complexe chitinase/(GlcNac)4. L’analyse de ce complexe a permis de mettre en évidence de nouvelles interactions entre (GlcNac)4 et les acides aminés du centre actif ainsi que de confirmer le mécanisme de la famille GH 19.<p> Des tests préliminaires sur nématodes ont finalement confirmé l’activité anthelminthique du latex et montré que la chitinase pouvait aussi être un bon nématocide<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished