Les principaux régulateurs de la prolifération cellulaire sont les Cdk (cyclin dependent kinase), dont l'activité dépend de leur association avec leurs partenaires, les cyclines. Le contrôle du niveau d'expression des cyclines représente le premier mécanisme par lequel l'activité des Cdk est régulée. Cette régulation est essentielle pour maintenir l'équilibre prolifération/différenciation de la peau. Cependant, les mécanismes mis en jeu restent peu connus.<br />Nous avons montré que Brm, protéine des complexes de remodelage de la chromatine SWI/SNF, est responsable de la répression de la cycline A par la mise en place ou le maintien de deux nucléosomes situés sur les sites d'initiation de la transcription. De plus, nous avons mis en évidence que l'absence de brm conduit à accélérer la progression des cellules dans le cycle cellulaire en jouant sur le déroulement de la phase S. Cependant, les cellules dépourvues de brm présentent également une mitose rallongée et des aberrations chromosomiques. Ceci pourrait être la conséquence de la dérégulation de trois oncogènes : c-myc, cycline A et cycline E et pourrait expliquer pourquoi brm est mutée dans de nombreux cancers.<br />Enfin, nous avons montré que l'entrée en différenciation des kératinocytes s'accompagne d'une forte expression de p21 qui entraîne un arrêt en G2/M en inhibant les complexes Cycline A/Cdk. Cependant, les kératinocytes en différenciation ne peuvent maintenir cet arrêt et entre dans un état G1 à 4N, caractérisé par une forte expression de la Cycline E et l'absence de Cyclines de G2/M.

Le nucléole est le lieu où débute la synthèse des ribosomes. Sa structure est fortement corrélée à la transcription des gènes ribosomiques. La régulation de l'expression des gènes ribosomiques est une étape importante de la biogenèse des ribosomes. L'objectif de ce travail a été de définir et d'ouvrir des voies méthodologiques pour mettre en évidence le rôle de macroH2A et de la nucléoline dans la régulation de l'expression des gènes ribosomiques. MacroH2A est pour l'instant le seul variant d'histone présent dans le nucléole. La nucléoline est une des protéines majoritaires du nucléole. La première partie de notre étude a porté sur un système cellulaire original celui de la carpe dont l'adaptation aux conditions climatiques (hiver et été) requiert des changements importants dans l'expression génique. Ainsi la répression de l'expression des ARN ribosomiques, associée à une baisse d'activité cellulaire, est concomitante avec (i) une déstructuration du nucléole, (ii) une augmentation de la concentration de macroH2A et de la nucléoline et (iii) une augmentation de la méthylation d'îlots CpG. Il existe donc une corrélation entre l'expression des gènes ribosomiques et le niveau d'expression de macroH2A. Pour analyser la distribution de macroH2A sur une fibre de chromatine, nous avons utilisé la technique d'étirement de la chromatine. Nous avons montré que macroH2A co-localise avec la tri-méthylation de la lysine 9 de l'histone H3 qui est un marqueur de l'hétérochromatine. De plus, la distribution de macroH2A est périodique suggérant un rôle de cette histone dans une organisation particulière de la chromatine. Enfin, nous avons développé au laboratoire un système cellulaire reposant sur l'inhibition de la nucléoline par RNAi dans des cellules HeLa. Les conséquences de l'inhibition de la nucléoline sont multiples : une diminution de la synthèse de l'ARN pré-ribosomique accompagnée d'une perturbation de la structure du nucléole et d'un arrêt du cycle cellulaire en mitose pouvant conduire à l'apoptose. La nucléoline est donc largement impliquée dans la régulation de l'expression des gènes ribosomiques.

Chez les organismes pluricellulaires, la prolifération, la différenciation ou encore la<br />mort des cellules reposent en partie sur l'activation et la répression de gènes spécifiques. Les<br />profils d'expressions géniques ainsi mis en place sont maintenus d'une génération cellulaire à<br />l'autre par des mécanismes épigénétiques stables qui altèrent la structure de la chromatine au<br />niveau des gènes cibles. Les protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG)<br />établissent une mémoire cellulaire au cours des mitoses en maintenant l'état transcriptionnel<br />de nombreux gènes par une réorganisation de la structure chromatinienne. Les protéines PcG<br />maintiennent la répression des gènes cibles en créant des domaines chromatiniens compacts<br />où l'ADN est peu accessible. Les protéines TrxG assurent le maintien de l'activation des gènes<br />en bloquant la propagation des complexes PcG et en déplaçant les nucléosomes. Chez la<br />drosophile, ces protéines agissent au sein de complexes multimèriques qui se lient à la<br />chromatine au niveau de modules communs appelés modules de mémoire cellulaire (CMM).<br />Les PcG et TrxG régulent l'expression de nombreux gènes dont les plus étudiés sont les gènes<br />homéotiques. Aujourd'hui, si les différents acteurs de la mémoire cellulaire commencent à<br />être bien connus, plusieurs questions restent posées. Quels sont les moyens de recruter<br />spécifiquement les PcG et TrxG sur leurs cibles ? Quels sont les mécanismes moléculaires qui<br />permettent le maintien de cette mémoire ? Quels sont les gènes cibles ? Est-ce que les<br />mécanismes d'action que nous étudions au niveau des gènes homéotiques sont communs à<br />l'ensemble des gènes régulés par les PcG et TrxG ?<br />Notre équipe travaille sur une protéine à boîte HMG de drosophile : DSP1 (Dorsal<br />Switch Protein 1). L'étude d'un mutant nul dsp11 a montré que la protéine intervient dans la<br />régulation des gènes homéotiques. Par ailleurs, des études d'interactions génétiques et des<br />expériences de digestion à la DNase I montrent que DSP1 est un facteur de remodelage de la<br />chromatine qui agit suivant le locus considéré en synergie avec les protéines des groupes PcG<br />ou TrxG. DSP1 fait donc partie des protéines qui participent à la mémoire cellulaire.<br />Le travail de thèse que nous présentons ici a pour objectif la recherche des gènes cibles<br />de DSP1 et du rôle de cette protéine dans la régulation de l'expression de ces gènes. Nous<br />avons identifié des cibles préférentielles de DSP1 sur l'ensemble du génome par la technique<br />d'immunoprécipitation de la chromatine pontée (ChIP). Nous avons étudié le rôle de DSP1<br />sur l'une de ces cibles, le CMM Fab-7 dont l'activité régule le gène homéotique<br />Ultrabithorax. Au cours de cette étude nous montrons par des expériences de transgenèse que<br />DSP1 est indispensable au fonctionnement du CMM. Le recrutement des protéines PcG et<br />TrxG sur les CMM reste mal connu. La fixation de DSP1 sur le CMM Fab-7 est essentielle au<br />recrutement des PcG. Ainsi nous montrons pour la première fois que DSP1 est un recruteur<br />précoce de ces protéines suivant le locus considéré au cours de l'embryogenèse. Au contraire,<br />nous montrons que DSP1 intervient tardivement dans l'activation du gène homéotique Sex<br />combs reduced. Dans ce cas, la protéine n'est essentielle qu'au cours de la vie larvaire. Enfin,<br />nous montrons que DSP1 régule l'expression du gène de segmentation knirps et est impliquée<br />dans l'établissement de son profil d'expression plutôt que dans son maintien.<br />161<br />Les protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG) établissent une<br />mémoire cellulaire en maintenant l'état transcriptionnel de nombreux gènes par un<br />remodelage de la chromatine. Chez la drosophile, ces protéines agissent au sein de complexes<br />multimériques qui se lient à des unités fonctionnelles appelées Modules de Mémoire<br />Cellulaire (CMM). Quels sont les gènes cibles des protéines PcG/TrxG ? Quels sont les<br />moyens de recruter spécifiquement ces protéines ? Sont deux questions auxquelles nous avons<br />voulu répondre. Notre équipe travaille sur une protéine à boîtes HMG de drosophile : DSP1.<br />L'objectif du travail que nous présentons ici est de rechercher des gènes cibles de DSP1 et son<br />rôle dans la régulation de l'expression de ces gènes. Plusieurs cibles ont été identifiées par la<br />technique d'immunoprécipitation de la chromatine pontée (ChIP). Nous avons étudié le rôle<br />de DSP1 sur le CMM Fab-7 qui régule le gène Ultrabithorax. Nous montrons par des<br />expériences de transgenèse que la fixation de DSP1 est indispensable à l'activité du CMM.<br />Par ailleurs, nous montrons pour la première fois que DSP1 est un recruteur précoce des<br />protéines PcG. Nous montrons également que DSP1 intervient en tant que protéine du groupe<br />TrxG dans l'activation du gène Sex combs reduced. Dans ce cas, DSP1 est essentielle au cours<br />de la vie larvaire. Enfin, nous montrons que DSP1 régule l'expression du gène knirps et<br />participe à l'établissement de son profil d'expression plutôt qu'à son maintien.

Thèse de doctorat : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie : Strasbourg 1 : 2007. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 193-222.

Thèse doctorat : Sciences du Vivant. Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie : Strasbourg 1 : 2006. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 20 p.

Thèse doctorat : Sciences du Vivant. Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie : Strasbourg 1 : 2006. Thèse doctorat : Sciences du Vivant. Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie : Université de Fudan - Shanghai - Chine : 2006. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 10 p.

La chromatine est l'assemblage du mat??riel g??n??tique, l'ADN et de prot??ines appel??es histones. En plus de leur fonction d'entreposage du g??nome, ces derni??res r??gulent l'accessibilit?? de l'ADN aux divers facteurs de r??gulation. Le variant d'histone H2A.Z est incorpor?? autour des promoteurs r??prim??s chez Saccharomyces cerevisiae. Ce variant semble impliqu?? dans la pr??paration des g??nes r??prim??s. Cette pr??paration permet une expression rapide de ces g??nes selon les conditions r??gulant leur activation. Bien qu'il soit essentiel ?? la viabilit?? chez les eucaryotes sup??rieurs, la d??l??tion du g??ne HTZ1 n'est pas l??tale chez la levure. Celle-ci engendre cependant plusieurs ph??notypes s??v??res, dont un ralentissement du cycle cellulaire et une sensibilit?? accrue ?? divers agents pharmacologiques. Par exemple, la caf??ine entra??ne un arr??t en phase G1 chez le mutant. Cet arr??t correspond au point de contr??le du cycle cellulaire le plus important, le point de d??part (START). Il est r??gul?? de fa??on tr??s stricte par la croissance et la taille des cellules. Lorsque toutes les conditions prolif??ratives sont r??unies, une cascade positive active la cycline-kinase Cdc28 coupl??e ?? la cycline Cln3. Celles-ci phosphorylent l'inhibiteur (Whi5) du complexe de facteur de transcription responsable de l'induction des cyclines de la phase G1. Ce complexe, SBF, est normalement d??j?? li?? aux promoteurs de ces cyclines et pr??pare le g??ne ?? une induction forte et rapide au moment opportun.

L'organisation de la chromatine a une importance fonctionnelle pour contrôler le programme d'expression des gènes. Par contre, les liens qui l'unissent au déroulement de la réplication de l'ADN sont beaucoup moins connus. Grâce à des approches basées sur la capture d'interactions chromosomiques et sur l'imagerie cellulaire, nous avons étudié les liens entre le repliement à grande échelle de la chromatine et le timing de réplication. Cette analyse, effectuée dans des cellules humaines lymphoblastoïdes, des cellules mononucléées du sang (PBMC) et des cellules issues d'une leucémie myéloïde à caractère érythrocytaire, a permis l'identification de domaines structuraux du noyau. Ces domaines sont relativement isolés les uns des autres et leurs frontières coïncident avec les zones d'initiation précoce. De plus, notre étude montre que ces zones d'initiation précoce interagissent préférentiellement, aussi bien entre voisins immédiats (séparation génomique de l'ordre de la mégabase) que le long du chromosome entier. Les loci répliqués tardivement interagissent eux-aussi avec leurs homologues, conduisant, dans l'espace nucléaire, à une ségrégation des loci en fonction de leur timing de réplication. Ces résultats sont soutenus par des mesures de distances sur des hybridations in-situ qui montrent que les loci répliqués en début de phase S sont plus proches qu'attendus. Nos travaux révèlent enfin que l'organisation de la chromatine est similaire dans des cellules en phase G0 (PBMC dormantes), démontrant qu'elle n'est pas spécifique des cellules en phase S. Pris ensemble, ces résultats apportent des preuves directes d'une organisation robuste de la chromatine, partagée par les cellules en cycle et dormantes, et corrélée au timing de réplication à différentes échelles.

Au cours de la spermiogenèse, les spermatides entreprennent une importante étape de remodelage de chromatine au cours de laquelle nous avons précédemment observé chez la souris, la présence de cassures transitoires d’ADN dans toutes les spermatides, un résultat qui fût également observé par notre groupe chez l’humain. De plus, il a été démontré qu’une fraction importante de ces cassures étaient bicaténaires. Compte tenu du caractère haploïde des spermatides, la recombinaison homologue ne peut avoir lieu, ne laissant recours qu’à des mécanismes de jonction d’extrémités connus pour les insertions, les délétions ainsi que les translocations chromosomiques qu’elles occasionnent. Nous avons donc proposé que ces cassures, intrinsèques au processus de maturation de cette cellule, puissent représenter une nouvelle source de variabilité génétique. Certains cas pathologiques dans lesquels la réparation d’ADN se ferait de façon dysfonctionnelle pourraient même mener à l’infertilité ou encore à la perte d’embryon. Étant donné la nouveauté de ces observations, les objectifs principaux furent d’effectuer un premier survol pour l’identification du ou des système(s) de réparation impliqué(s) durant le remodelage de chromatine et de tenter de préciser la voie de signalisation qui en est responsable. D’après la présence des protéines clés des voies de réparation possiblement impliquées dans les spermatides allongeantes murines, le D-NHEJ serait le système de réparation principalement utilisé dans la réparation de ces dernières, des expériences qui ne furent pas aussi concluantes chez l’humain. En parallèle, deux versions de MRE11 recombinantes ont été produites dans le but d’effectuer sous peu des tests fonctionnels de purification de complexes protéiques. La forme endogène de cette protéine est recrutée de façon précoce à tous les sites de cassures bicaténaires d’ADN, en faisant ainsi une excellente candidate pour confirmer les résultats obtenus chez la souris. Des analyses de colocalisation effectuées entre certaines protéines clés et yH2AFX, un marqueur normalement associé aux cassures bicaténaires d’ADN dans les cellules somatiques, n’ont pas été convaincantes. Ce résultat suggère que ce dernier ait une fonction autre dans les spermatides allongeantes. Comme notre groupe a préalablement obtenu des évidences suggérant que la TOPOIip soit à l’origine des cassures dans les spermatides allongeantes, cette hypothèse fut vérifiée en tentant de diminuer leur création en incubant les spermatides en présence de merbarone, un inhibiteur de TOPOII présélectionné in vitro.Encore quelques travaux restent à faire étant donné que l’entrée de la merbarone dans les noyaux des spermatides n’a pas pu être confirmée mais la persistance de yH2AFX dans les spermatides allongeantes malgré l’inhibition des TOPOII tend à soutenir l’hypothèse proposée. Ces travaux constituent les premiers pas vers une meilleure compréhension de l’implication des systèmes de réparation d’ADN ainsi que du variant d'histone H2AFX durant le remodelage de chromatine de la spermiogenèse. Une meilleure caractérisation du système de réparation impliqué permettra de mieux comprendre les conséquences de ce processus endogène sur l’intégrité génétique du gamète mâle et sur sa contribution à l’ajout de polymorphisme dans la population.[ symboles non conformes]

L'hétérochromatine péricentromérique semble jouer un rôle dans la régulation de l'expression génique et par conséquent dans le potentiel de développement des embryons. Nous avons fait l'hypothèse qu'une marque épigénétique, H3S10P, pourrait être un nouveau marqueur permettant le suivi des régions péricentromériques dans l'embryon préimplantatoire de souris. Par des techniques d'immunofluorescence et d'immuno-FISH couplées à de la microscopie en haute résolution, nous avons montré que la distribution de H3S10P dans les embryons de souris est différente de celle observée dans les cellules somatiques. Durant les stades 1 à 4-cellules, H3S10P est détectée en interphase autour des précurseurs des nucléoles (NPB), où elle colocalise avec les sondes ADN reconnaissant l'hétérochromatine péricentromérique, puis marque les bras chromosomiques sur toute la durée des phases de mitose. Après le stade 4-cellules, la distribution de H3S10P redevient similaire à ce qui est connu dans les cellules somatiques, avec un marquage au niveau des chromocentres seulement en fin d'interphase et sur les chromosomes mitotiques seulement jusqu'à la télophase. Cette cinétique particulière observée semble liée à l'absence de la kinase Aurora B aux stades les plus précoces. Nous avons également comparé la localisation de H3S10P avec celle d'autres marqueurs associés à l'hétérochromatine péricentromérique comme H3K9me3, HP1 β et la double modification H3K9me3S10P et en avons conclu que H3S10P est un meilleur marqueur pour l'hétérochromatine péricentromérique des deux génomes parentaux. Enfin, comme les embryons clonés obtenus par transfert nucléaire à partir de cellules somatiques (SCNT) montrent une redistribution anormale de l'hétérochromatine péricentromérique ainsi qu'un développement altéré, nous avons utilisé H3S10P pour détecter les remaniements de l'hétérochromatine après SCNT. Nos résultats montrent que, contrairement aux autres marqueurs, H3S10P n'est présente que sur la portion de l'hétérochromatine qui est correctement remaniée, tandis que l'hétérochromatine incorrectement reprogrammée conserve la signature épigénétique de la cellule donneuse.