Os isômeros de posição do triterpeno pentacíclico amirina (alfa e beta), estão presentes em várias espécies de plantas, como a Protium spruceanum. Estas moléculas vêm mostrando várias propriedades farmacológicas importantes, como efeitos anti-inflamatórios, efeito gastroprotetor, efeito antipruriginoso, efeito antitumoral, entre outros, sendo, dessa forma, uma candidata a um novo fármaco. No entanto, o comportamento destas substâncias frente as enzimas do citocromo P450 (CYP 450) ainda não foram estudadas. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo realizar um estudo de metabolismo in vitro com esses triterpenos, caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos assim como possíveis metabólitos que possam surgir empregando microssomas hepático de ratos. Para isto, foi desenvolvido e validado um método bioanalítico para análise desses triterpenos em microssomas de ratos e análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Como técnica de preparação das amostras foi empregado a extração liquido-liquido utilizando hexano como solvente extrator. A metodologia para quantificação dos triterpenos em microssomas hepático foi validada de acordo com a legislação vigente para análise de fármacos em fluidos biológicos, avaliando os seguintes parâmetros: linearidade, sensibilidade, seletividade, precisão, exatidão, estabilidade e recuperação. Todos os parâmetros avaliados corroboraram com as exigências da legislação. Após validação, iniciou-se os estudos para determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos avaliando a variação do tempo de incubação e da concentração de proteínas microssomais no consumo dos subtratos. Utilizando a faixa linear destes experimentos foi determinada a concentração de 0,25 mg mL-1 e o tempo de incubação de 20 min, respeitando as condições de Velocidade Inicial. Em seguida, ao avaliar a variação da concentração do substrato observou-se que a cinética obtida é do tipo sigmoidal. Dessa forma, para os cálculos dos parâmetros cinéticos foi utilizado a equação de Hill, obtendo Vmax = 0,698 ± 0,022 ?mol/mg proteína/min, S50 = 55,1 ± 10,5 ?M e o coeficiente de Hill 2,7 ± 0,17, já os parâmetros da beta amirina foram: Vmax = 0,775 ± 0,034 ?mol/mg proteína/min, S50 = 130,4 ± 42,8 ?M e coeficiente de Hill 2,5 ± 0,21. A partir destes dados obteve-se o clearance intrínseco para a beta e a alfa amirina de 3,05 mL/min/kg e 6,55 mL/min/kg, respectivamente. Apesar das amirinas serem metabolizadas pelas enzimas da CYP 450, nenhum metabólito foi encontrado. Nesse trabalho, foi demostrando pela primeira vez, o comportamento das enzimas das CYP 450 de ratos frente aos produtos naturais alfa e beta amirina, no qual foi verificado um comportamento atípico, que não segue a cinética michaeliana. / The isomers of pentacyclic triterpene amyrins (alpha and beta) occurring in a variety of plants, as Protium spruceanum. These molecules have showed significant pharmacological effects, as anti-inflammatory, gastroprotective and antitumor effects. Based on that, these substances have demonstrated great potential to become new drugs. However, the metabolic behavior by employing CYP enzymes (CYP450) has not been studied yet. The aim of this work was to perform an in vitro metabolism study by using these triterpenes and to determine the enzymatic kinetic parameters and possible metabolites by employing rat liver microsomes. To perform that, a bioanalytical method was developed and validated to analysis amyrins in rat microsomes. Gas chromatography coupled with mass spectrometer (GC-MS) was applied in the analysis. Liquid-liquid extraction was used to clean the sample and hexane was used as extraction solvent. Before metabolism studies, the method was validated according to current legislation to analysis of drugs in biological fluids. The following parameters were evaluated: linearity, sensitivity, selectivity, precision, accuracy, stability and recovery. All parameters evaluated were in agreement to legislation guidelines. After validation, enzymatic kinetic parameters were determined through variation of incubation time and concentration of microsomal proteins. By using linear range, the incubation time of 20 min and microsomal protein concentration of 0.25 mg mL-1 were determined to respect V0 conditions. The enzymatic kinect results showed a sigmoidal profile. Thus, to calculate the kinetic parameters it was used the Hill equation. It was observed a Vmax = 0.698 ± 0.022 ?mol/mg protein/min, S50 = 55.18 ± 10.5 ?M and Hill coefficient of 2.7 ± 0.17 to alpha amyrin and a Vmax = 0.775 ± 0.034 ?mol/mg protein/min, S50 = 130.4 ± 42.8 ?M and Hill coefficient of 2.5 ± 0.21 to beta amyrin. The intrinsic clearance to beta and alpha amyrin was 3.05 mL/min/kg e 6.55 mL/min/kg, respectively. In spite of amyrins were metabolized by the CYP 450 enzymes, none metabolite was found. In this work, it was demonstrated, for the first time, the behavior of rat liver microsomes front to alpha and beta amyrin, in which it was observed an atypical behavior, that it does not follow the Michaelis-Menten kinetics.

A obtenção de moléculas enantiomericamente puras ou enriquecidas tem se demonstrado um desafio em química orgânica sintética. Nesse âmbito, a biocatálise aparece como uma importante ferramenta sintética. Neste trabalho, desenvolveu-se uma metodologia para a obtenção de 6-hidróxioct-7-inoato de metila, 5-hidróxihept-6-inoato de metila, e 4-hidróxihex-5-inoato de metila enantiomericamente enriquecidos via resolução cinética enzimática. Primeiramente foram investigadas variáveis como temperatura, tempo, quantidade de doador de acila, solvente e enzima adequada para a reação. Em uma segunda etapa do trabalho, foram desenvolvidas seqüências reacionais onde os hidroxiésteres originariam moléculas bioativas Utilizando o 5-hidróxihept-6-inoato de metila, após três etapas reacionais, foi possível sintetizar intermediários sintéticos avançados das moléculas bioativas goniotalamina e argentilactona. De maneira análoga, após algumas etapas reacionais, o 4-hidróxihex-5-inoato de metila originou os feromônios buibuilactona, japonilura e 4-hexanolida / The synthesis of enantiomerically pure or enriched molecules has been an important challenge in synthetic organic chemistry. Among a variety of disciplines dedicated to achive this goal, biocatalysis appears as an important synthetic tool. Herein, we developed a methodology to obtain methyl 6-hydroxyoct-7-ynoate, methyl 5-hydroxyhept-6-ynoate and methyl 4-hydroxyhex-5-ynoate enantiomerically enriched by an enzymatic kinetic resolution. Reaction conditions such as temperature, reaction time, amount of acyl donor, solvent and enzyme were screened, in order to obtain high yields and enantioselectivities. In the second part of our work, synthetic pathways were developed where the hydroxyesters lead to bioactive molecules. Using methyl 5-hydroxyhept-6-ynoate, after three steps, advanced synthetic intermediates for the synthesis of the bioactive molecules, such as goniothalamine and argentilactone, were prepared. In the same way, methyl 4-hydroxyhex-5-ynoate was submitted to a reaction sequence leading the pheromones buibuilactone, japonilure and 4-hexanolide.

Submitted by Johnny Rodrigues (johnnyrodrigues@ufcg.edu.br) on 2018-06-05T17:07:12Z No. of bitstreams: 1 GISLEÂNIA DOURADO LANDIM PARENTE - DISSERTAÇÃO PPGSA PROFISSIONAL 2014..pdf: 1646252 bytes, checksum: 69d7142e823523d864edc041288b9b0c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-05T17:07:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GISLEÂNIA DOURADO LANDIM PARENTE - DISSERTAÇÃO PPGSA PROFISSIONAL 2014..pdf: 1646252 bytes, checksum: 69d7142e823523d864edc041288b9b0c (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / A Paraíba é o maior produtor de abacaxi do Brasil, sendo esta uma das frutas tropicais mais apreciadas, devido seu sabor e aroma característico. As exigências estabelecidas pelo mercado in natura estão entre as causas do desperdício de frutas, descartando-se as que estão fora do perfil exigido pelo consumidor. Desta forma, o objetivo desta pesquisa foi utilizar o abacaxi como matéria-prima para elaboração de aguardente de fruta. A fermentação alcoólica foi conduzida, em sistema de batelada, e avaliou-se a concentração celular (X), concentração de sólidos solúveis (S) e concentração de etanol (P) durante a fermentação para o estudo cinético através dos experimentos dispostos no planejamento fatorial. Utilizando o planejamento fatorial 22 e análise de superfície de resposta avaliou-se a influência das concentrações de sólidos solúveis e de levedura no processo de fermentação alcoólica, sobre as respostas (% conversão, produtividade, YX/S e YP/S). O fermentado alcoólico foi destilado em alambique de cobre e armazenado em barril de freijó onde permaneceu por 90 dias, para descanso. Com base nos resultados, pode-se observar que a produção de etanol nas condições operacionais do ponto central da matriz de planejamento, foi a mais adequada, alcançando um teor alcoólico de 70,66g/L (8,98ºGL). Pela superfície de resposta e o diagrama de Pareto verificou-se uma influência significativa das duas variáveis de entrada sobre a produtividade, sendo que a concentração de levedura exerceu maior influência. Por fim, a aguardente de abacaxi apresentou características físico-químicas dentro dos parâmetros exigidos pela legislação vigente, com exceção do cobre. Portanto, foi possível comprovar a viabilidade técnica do uso de abacaxi como matéria-prima na elaboração de aguardente como uma excelente alternativa de aproveitamento dos excedentes de safra, contribuindo para o crescimento da agroindústria e colaborando para melhores condições de emprego e renda nas propriedades rurais, principalmente no Estado da Paraíba. / Paraíba is the largest producer of pineapple in Brazil , this being one of the most prized tropical fruits , due to its characteristic flavor and aroma. The requirements set by the market in nature are among the causes of wasted fruit , discarding those that are out of profile required by the consumer . Thus the objective of this research was to use the pineapple as a feedstock for production of spirits from fruit. The alcoholic fermentation was conducted in a batch system, and evaluated the cell concentration (X), soluble solids concentration (S) and ethanol concentration (P) during fermentation for the kinetic study through experiments in the factorial design. Using 22 factorial design and response surface analysis evaluated the influence of concentrations of soluble solids and yeast in the fermentation process, on the responses ( % conversion, productivity, Yx\s and Yx\p) . The alcoholic fermentation was distilled in copper stills and stored in barrel freijó where he remained for 90 days of rest . Based on the results , it can be seen that ethanol production in the operating conditions of the center point of the planning matrix , was optimal , achieving an alcohol content of 70.66 g / L ( 8.98 ° GL ) . The response surface and the Pareto diagram there was a significant influence of the two input variables on productivity, whereas the concentration of yeast had greater influence. Finally, brandy pineapple presented physicochemical characteristics within the parameters required by law, with the exception of copper. Therefore, it was possible to prove the technical feasibility of using pineapple as a feedstock in the production of spirits as an excellent alternative use of surplus crop, contributing to the growth of agribusiness and helping to better conditions of employment and income in rural properties, mainly in the state of Paraíba

Submitted by Gustavo Caixeta (gucaixeta@gmail.com) on 2017-02-21T13:14:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 339223 bytes, checksum: 05053be3fb027d334a0a4fdb00eea1a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-21T13:14:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 339223 bytes, checksum: 05053be3fb027d334a0a4fdb00eea1a1 (MD5) Previous issue date: 1996-02-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, Brasil / Estudaram-se a absorção e o metabolismo do S influenciados pelo Al em dois cultivares de sorgo, um sensível (BR007A) e outro tolerante (BR006R) ao Al, com o objetivo de esclarecer alguns aspectos da tolerância a este elemento. As plantas, cultivadas em solução nutritiva, pH 4,0, foram submetidas a duas concentrações de Al (0 e 0,185 mM) e a duas concentrações de sulfato (0 e 0,6 mM) durante 10 dias. Determinaram-se, então, os pesos de matéria seca; os teores de Al, S-total, S-orgânico, S-sulfato e tióis totais; as constantes cinéticas de absorção de S; e a atividade da sulfurilase do ATP. A produção de matéria seca foi bastante reduzida tanto na ausência de S quanto na presença de Al. O Al acumulou-se principalmente no sistema radicular dos dois cultivares, independentemente da presença de S e reduziu o valor das constantes cinéticas V max e K m nos dois cultivares ou apenas no sensível, respectivamente. O C min foi idêntico nos dois cultivares, não tendo sido influenciado pelo Al. Os efeitos do Al sobre estas constantes foram sempre mais intensos quando as plantas foram cultivadas na sua presença. Os teores das frações sulfuradas decresceram na ausência de S ou na presença de Al nos dois cultivares, especialmente no sistema radicular. As reduções nas frações sulfuradas causadas pelo Al foram sempre maiores na presença de S. O cultivar tolerante, apesar do menor teor de S-total, apresentou índice de utilização deste elemento na presença de Al maior do que o cultivar sensível, principalmente no sistema radicular. O teor de tióis, independentemente da presença de S, aumentou nos tratamentos com Al, principalmente no sistema radicular. Este aumento, contudo, parece ser uma reação geral da planta ao estresse e não um mecanismo específico de tolerância das plantas de sorgo ao Al. A redução do sulfato pela sulfurilase do ATP deu-se, preferencialmente, na parte aérea. A atividade desta enzima, maior no cultivar tolerante, decresceu fortemente na presença de Al, independentemente da presença de S. / Sulfur uptake and metabolism influenced by Al were studied in two sorghum cultivars, one Al-sensitive (BR007A) and other Al-tolerant (BR006R), with the main objective to better understand some aspects of Al tolerance. Plants grown in nutrient solution, pH 4.0, were exposed to two Al concentrations (0 and 0.185 mM) and to two S concentrations (0 and 0.6 mM) during 10 days. Dry weight, Al, total-S, organic-S, sulfate-S, soluble thiol concentrations, kinetic constant of S uptake and ATP sulfurylase activity were determined. Dry weight yield was strongly reduced in the absence of S and, or presence of Al. Aluminum acumulated mainly in the root system of both cultivars, independent of the presence of S. The kinetic constants: V max and K m were reduced in the presence of Al in both cultivars or only in the Al-sensitive cultivar, respectively. The C min was identical in the two cultivars and did not change with Al treatment. Aluminum effects on those kinetic constants were always stronger when Al was added to the growth medium than in the absorption medium. The concentration of the various S fractions decreased in the S absence or Al presence, especially in the root system of both cultivars. The Al-induced reductions in these S fractions were always stronger when S was present. Although showing lower S- total concentration the Al-tolerant cultivar had in the presence of Al a higher S utilization index than the Al-sensitive one. The thiol concentration increase with Al treatment independent of S presence, especially in the root system. This increase however seems to be a general plant reaction to the stress rather than a specific Al tolerance mechanism in sorghum. The sulfate reduction, based on ATP sulfurylase activity occurred mainly in the leaves. The activity of this enzyme, higher in the Al-tolerant cultivar, was strongly reduced by Al in both cultivars, whether S was present or not in the growth medium.

A obtenção de moléculas enantiomericamente puras ou enriquecidas tem se demonstrado um desafio em química orgânica sintética. Nesse âmbito, a biocatálise aparece como uma importante ferramenta sintética. Neste trabalho, desenvolveu-se uma metodologia para a obtenção de 6-hidróxioct-7-inoato de metila, 5-hidróxihept-6-inoato de metila, e 4-hidróxihex-5-inoato de metila enantiomericamente enriquecidos via resolução cinética enzimática. Primeiramente foram investigadas variáveis como temperatura, tempo, quantidade de doador de acila, solvente e enzima adequada para a reação. Em uma segunda etapa do trabalho, foram desenvolvidas seqüências reacionais onde os hidroxiésteres originariam moléculas bioativas Utilizando o 5-hidróxihept-6-inoato de metila, após três etapas reacionais, foi possível sintetizar intermediários sintéticos avançados das moléculas bioativas goniotalamina e argentilactona. De maneira análoga, após algumas etapas reacionais, o 4-hidróxihex-5-inoato de metila originou os feromônios buibuilactona, japonilura e 4-hexanolida / The synthesis of enantiomerically pure or enriched molecules has been an important challenge in synthetic organic chemistry. Among a variety of disciplines dedicated to achive this goal, biocatalysis appears as an important synthetic tool. Herein, we developed a methodology to obtain methyl 6-hydroxyoct-7-ynoate, methyl 5-hydroxyhept-6-ynoate and methyl 4-hydroxyhex-5-ynoate enantiomerically enriched by an enzymatic kinetic resolution. Reaction conditions such as temperature, reaction time, amount of acyl donor, solvent and enzyme were screened, in order to obtain high yields and enantioselectivities. In the second part of our work, synthetic pathways were developed where the hydroxyesters lead to bioactive molecules. Using methyl 5-hydroxyhept-6-ynoate, after three steps, advanced synthetic intermediates for the synthesis of the bioactive molecules, such as goniothalamine and argentilactone, were prepared. In the same way, methyl 4-hydroxyhex-5-ynoate was submitted to a reaction sequence leading the pheromones buibuilactone, japonilure and 4-hexanolide.

Os isômeros de posição do triterpeno pentacíclico amirina (alfa e beta), estão presentes em várias espécies de plantas, como a Protium spruceanum. Estas moléculas vêm mostrando várias propriedades farmacológicas importantes, como efeitos anti-inflamatórios, efeito gastroprotetor, efeito antipruriginoso, efeito antitumoral, entre outros, sendo, dessa forma, uma candidata a um novo fármaco. No entanto, o comportamento destas substâncias frente as enzimas do citocromo P450 (CYP 450) ainda não foram estudadas. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo realizar um estudo de metabolismo in vitro com esses triterpenos, caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos assim como possíveis metabólitos que possam surgir empregando microssomas hepático de ratos. Para isto, foi desenvolvido e validado um método bioanalítico para análise desses triterpenos em microssomas de ratos e análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Como técnica de preparação das amostras foi empregado a extração liquido-liquido utilizando hexano como solvente extrator. A metodologia para quantificação dos triterpenos em microssomas hepático foi validada de acordo com a legislação vigente para análise de fármacos em fluidos biológicos, avaliando os seguintes parâmetros: linearidade, sensibilidade, seletividade, precisão, exatidão, estabilidade e recuperação. Todos os parâmetros avaliados corroboraram com as exigências da legislação. Após validação, iniciou-se os estudos para determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos avaliando a variação do tempo de incubação e da concentração de proteínas microssomais no consumo dos subtratos. Utilizando a faixa linear destes experimentos foi determinada a concentração de 0,25 mg mL-1 e o tempo de incubação de 20 min, respeitando as condições de Velocidade Inicial. Em seguida, ao avaliar a variação da concentração do substrato observou-se que a cinética obtida é do tipo sigmoidal. Dessa forma, para os cálculos dos parâmetros cinéticos foi utilizado a equação de Hill, obtendo Vmax = 0,698 ± 0,022 ?mol/mg proteína/min, S50 = 55,1 ± 10,5 ?M e o coeficiente de Hill 2,7 ± 0,17, já os parâmetros da beta amirina foram: Vmax = 0,775 ± 0,034 ?mol/mg proteína/min, S50 = 130,4 ± 42,8 ?M e coeficiente de Hill 2,5 ± 0,21. A partir destes dados obteve-se o clearance intrínseco para a beta e a alfa amirina de 3,05 mL/min/kg e 6,55 mL/min/kg, respectivamente. Apesar das amirinas serem metabolizadas pelas enzimas da CYP 450, nenhum metabólito foi encontrado. Nesse trabalho, foi demostrando pela primeira vez, o comportamento das enzimas das CYP 450 de ratos frente aos produtos naturais alfa e beta amirina, no qual foi verificado um comportamento atípico, que não segue a cinética michaeliana. / The isomers of pentacyclic triterpene amyrins (alpha and beta) occurring in a variety of plants, as Protium spruceanum. These molecules have showed significant pharmacological effects, as anti-inflammatory, gastroprotective and antitumor effects. Based on that, these substances have demonstrated great potential to become new drugs. However, the metabolic behavior by employing CYP enzymes (CYP450) has not been studied yet. The aim of this work was to perform an in vitro metabolism study by using these triterpenes and to determine the enzymatic kinetic parameters and possible metabolites by employing rat liver microsomes. To perform that, a bioanalytical method was developed and validated to analysis amyrins in rat microsomes. Gas chromatography coupled with mass spectrometer (GC-MS) was applied in the analysis. Liquid-liquid extraction was used to clean the sample and hexane was used as extraction solvent. Before metabolism studies, the method was validated according to current legislation to analysis of drugs in biological fluids. The following parameters were evaluated: linearity, sensitivity, selectivity, precision, accuracy, stability and recovery. All parameters evaluated were in agreement to legislation guidelines. After validation, enzymatic kinetic parameters were determined through variation of incubation time and concentration of microsomal proteins. By using linear range, the incubation time of 20 min and microsomal protein concentration of 0.25 mg mL-1 were determined to respect V0 conditions. The enzymatic kinect results showed a sigmoidal profile. Thus, to calculate the kinetic parameters it was used the Hill equation. It was observed a Vmax = 0.698 ± 0.022 ?mol/mg protein/min, S50 = 55.18 ± 10.5 ?M and Hill coefficient of 2.7 ± 0.17 to alpha amyrin and a Vmax = 0.775 ± 0.034 ?mol/mg protein/min, S50 = 130.4 ± 42.8 ?M and Hill coefficient of 2.5 ± 0.21 to beta amyrin. The intrinsic clearance to beta and alpha amyrin was 3.05 mL/min/kg e 6.55 mL/min/kg, respectively. In spite of amyrins were metabolized by the CYP 450 enzymes, none metabolite was found. In this work, it was demonstrated, for the first time, the behavior of rat liver microsomes front to alpha and beta amyrin, in which it was observed an atypical behavior, that it does not follow the Michaelis-Menten kinetics.

Extradiol dioxigenases são enzimas que catalisam a clivagem oxidativa de ligações C-C entre grupos hidroxila fenólicos adjacentes utilizando catecóis como substratos. Esta classe de enzimas é bem caracterizada em bactérias, onde catalisam a degradação de compostos aromáticos. Na maioria das plantas Caryophyllales, como a beterraba, primavera e a maravilha, L-3,4-diidroxifenilalanina (L-DOPA) extradiol dioxigenases (DODAs) catalisam a clivagem oxidativa de L-DOPA na posição 4,5 gerando o ácido betalâmico, aldeído precursor das betalaínas, uma classe de pigmentos naturais que substitui as antocianinas na pigmentação dessas espécies. Alguns fungos basidiomicetos também produzem betalaínas, como o agário-das-moscas (Amanita muscaria). Nesse organismo, DODA é capaz de catalisar uma clivagem adicional na posição 2,3 da L-DOPA, formando muscaflavina, um isômero do ácido betalâmico que dá origem a uma outra classe de pigmentos naturais: as higroaurinas. Desde a caracterização do gene dodA, o qual codifica para a DODA de A. muscaria (AMAMU), não existem relatos na literatura que explorem a promiscuidade catalítica desta enzima, sua relação com outras linhagens de DODAs e a síntese quimioenzimática de betalaínas a partir desta enzima. Dessa forma, buscamos contextualizar as relações filogenéticas e funcionais entre AMAMU e diferentes linhagens de DODAs, bem como estabelecer um método que viabilize a clonagem, expressão heteróloga e caracterização funcional destaenzima. As análises filogenéticas revelaram que AMAMU possui uma evolução convergente com DODAs de plantas e bactérias e que, apesar de AMAMU ser funcionalmente homóloga à DODA da bactéria Escherichia coli, esta última apresenta homologia com DODAs de plantas. Logo, não há uma relação direta entre a sequência primária de DODAs e sua função. Nós também demonstramos que não há uma relação entre a expressão de transcritos de BvDODA1, e de seu parálogo BvDODA2, e a diferença de pigmentação entre variedades de beterrabas amarelas e vermelhas. A clonagem da sequência codificadora (CDS) publicada para o gene dodA de A. muscaria resultou na retenção do primeiro íntron, o que impedia a sua expressão. Então, uma nova CDS de 558 nucleotídeos foi proposta para este gene, a qual inclui um códon de início da tradução que se mantém na fase de leitura e codifica para uma proteína de 185 resíduos, 43 a menos que AMAMU. A expressão desta CDS resultou na proteína recombinante AmDODA, capaz de catalisar a síntese de ácido betalâmico e muscaflavina a partir de L-DOPA e D-DOPA. AmDODA possui um tamanho aproximado de 22 kDa, com um pH ótimo de atividade de 8,5 e uma constante de Michaelis (KM) de 3,7 ± 0,9 mmol L-1 e de velocidade máxima (Vmax) de 3,3 ± 0,4 µ mol min-1 mg-1. Sua utilização foi demonstrada na síntese quimioenzimática de betalaínas-modelo com potencial aplicação como sondas para microscopia confocal de fluorescência de dois fótons. Neste contexto, esta Tese explora os aspectos moleculares, bioquímicos e biológicos da DODA do fungo A. muscaria e traz importantes contribuições acerca da pigmentação por betalaínas na natureza. / Extradiol dioxigenases are enzymes that catalyze the oxidative cleavage of C-C bonds between adjacent phenolic hydroxyl groups using catechols as substrates. This class of enzymes is well characterized in bacteria, where they catalyze the degradation of aromatic compounds. In most plants of the Order Caryophyllales, such as beet, paperflower and four o\'clock flower, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) extradiol dioxygenases (DODAs) catalyze the oxidative 4,5-cleavage of L-DOPA generating the betalamic acid, an aldehyde precursor of the betalains, a class of natural pigments that replaces anthocyanins in the pigmentation of these species. Some basidiomycete fungi also produce betalains, such as the fly agaric (Amanita muscaria). In this organism, DODA is able to catalyze an additional 2,3-cleavage of L-DOPA, yielding muscaflavine, an isomer of betalamic acid that gives rise to another class of natural pigments: the hygroaurins. Since the characterization of the dodA gene, which encodes the A. muscaria DODA (AMAMU), there are no reports in the literature that explore the catalytic promiscuity of this enzyme, its relation to other DODAs and the chemoenzymatic synthesis of betalains from this enzyme. Thus, we seek to contextualize the phylogenetic and functional relationships between AMAMU and different DODA lineages, as well as to establish a method that enable the cloning, heterologous expression and functional characterization of this enzyme. Phylogenetic analysis revealed that AMAMU has a convergent evolutionwith plant and bacterial DODAs and that although AMAMU is functionally homologous to the DODA of the Escherichia coli bacteria, this latter is homologous to the plant DODAs. Therefore, there is no direct relationship between the primary sequence of DODAs and their function. We have also shown that there is no relationship between the expression of BvDODA1 transcripts, and its BvDODA2 paralogue, and the pigment difference between yellow and red beet varieties. Cloning of the published coding sequence (CDS) for the dodA gene of A. muscaria resulted in the retention of the first intron, which prevented its expression. Then, a new CDS of 558 nucleotides was proposed for this gene, which includes a translation start codon that remains in the open reading frame and encodes for a protein 185 residues long, 43 less than AMAMU. Expression of this CDS resulted in the recombinant AmDODA protein, able to catalyze the synthesis of betalamic acid and muscaflavine from L-DOPA and D-DOPA. AmDODA has an approximate size of 22 kDa, with an optimum activity pH of 8.5 and a Michaelis constant (KM) of 3.7 ± 0.9 mmol L-1 and a maximum velocity (Vmax) of 3.3 ± 0.4 µmol min-1 mg-1. Its use was demonstrated in the chemoenzymatic synthesis of betalains-model with potential application as probes for confocal microscopy of two-photon fluorescence. In this context, this thesis explores the molecular, biochemical and biological aspects of the DODA of the fungus A. muscaria and brings important contributions about the pigmentation by betalains in nature.

Fumarato hidratases ou fumarases (FH) catalisam a reação estereoespecífica reversível de hidratação do fumarato em L-malato. Essas enzimas se apresentam em todas as classes de organismos, desde procariotos a eucariotos, e podem ser encontradas nas formas mitocondrial e citosólica. A enzima tem papel importante na produção de energia pois participa do ciclo do ácido cítrico, na resposta ao dano do DNA e como supressor tumoral. A fumarase humana (HsFH), que pertence à classe II, é codificada pelo gene 1q42.1, possui 467 aminoácidos em cada monômero com peso molecular de 50,2 kDa cada. Estudos associaram mutações no gene da FH com diversas doenças humanas como acidúria fumárica, leiomiomatoses de útero e pele (MCUL), que quando associadas com um agressivo carcinoma múltiplo de células é conhecido como leiomiomatose hereditária e câncer renal (HLRCC). Apesar da grande importância da fumarase humana no metabolismo energético, ainda há pouca informação em relação ao mecanismo catalítico adotado pela enzima e o efeito estrutural e cinético causado pelas mutações envolvidas com essas doenças. Diante disso, nosso trabalho utilizou uma abordagem híbrida que envolve a caracterização biofísica, bioquímica e estrutural da enzima HsFH, e seus mutantes: N107THsFH, H180RHsFH, Q185RHsFH, K230RHsFH, G282VHsFH, E362QHsFH, S365GHsFH e N373DHsFH, identificados em pacientes. Estudos cinéticos foram realizados em sete diferentes pHs e, pela primeira vez para fumarases, o ensaio foi realizado com os dois substratos presentes na mesma mistura reacional, confirmando a contribuição da reação reversa para a velocidade global da enzima. De acordo com os estudos de termoflúor a proteína é estabilizada em pHs alcalinos e através da ligação de compostos no sítio ativo. A estrutura da enzima HsFH nativa foi resolvida a 1,8 Å e identificou a presença de moléculas de HEPES complexadas na região C-terminal da enzima. Os estudos cinéticos demonstraram um aumento da eficiência catalítica na presença do HEPES, sugerindo um possível papel alostérico de seu sítio de ligação para a atividade catalítica. Foram determinadas as estruturas para os mutantes N107THsFH, H180RHsFH, Q185RHsFH, K230RHsFH, E362QHsFH, S365GHsFH e N373DHsFH. As mutações Q185R, E362Q, S365G e N373D foram identificadas no sítio ativo afetando diretamente a capacidade da proteína em ligar os substratos, enquanto que a mutação H180R foi localizada no sítio B, que conduz os substratos e produtos para dentro e fora do sítio ativo. Já a mutação K230R está localizada no domínio central, mas os resultados de termoflúor demonstram um efeito direto na capacidade da enzima em acomodar o substrato. A mutação N107T, localizada longe do sítio ativo foi a única que permaneceu ativa e teve seus parâmetros cinéticos residuais determinados. O presente trabalho contribui para o entendimento das bases estruturais que correlacionam mutações na HsFH, deficiência enzimática e patologia. / Fumarate hydratases or fumarases (FH) catalyze the reversible stereospecific hydration of fumarate to L-malate. They are present in all classes of organisms, from prokaryotes to eukaryotes, and can be found in the mitochondrial and cytosolic forms. The enzyme has an important role in energy production as part of the well-known Citric Acid Cycle, in DNA damage response and as tumor suppressor. Human fumarase (HsFH) belongs to class II and is encoded by 1q42.1 gene. HsFH is tetrameric and has 467 amino acids per monomer, with predicted molecular weight of 50.2 kDa. Several studies associated FH gene mutations with some human diseases such as fumaric aciduria, multiple cutaneous and uterine leiomyomatosis (MCUL), which when associated with an aggressive form of multiple cell carcinoma is known as hereditary leiomyomatosis and renal cancer (HLRCC) syndrome. Although the major role of HsFH in energetic metabolism, there are still little structural and kinetic information about the mutants involved in these diseases. Thus, this study aims, through a hybrid approach, composed by biophysics, biochemical and structural characterization of mutants N107THsFH, H180RHsFH, Q185RHsFH, K230RHsFH, G282VHsFH, E362QHsFH, S365GHsFH and N373DHsFH identified from patients. Steady-state kinetics studies were performed in seven different pHs and, for the first time, the contribution of both substrates was analyzed simultaneously in a single kinetic assay and allowed to quantify the contribution of the reverse reaction for kinetics. According to thermofluor studies, structural stability can be achieved at alkaline pHs and suggests that ligand binding can modulate the protein stability. HsFH crystal structure was solved at 1.8 Å resolution and identified HEPES molecules complexed with the enzyme C-terminal region. Kinetics studies with HEPES showed an increase of the catalytic efficiency and suggests that HEPES binding site might have an allosteric role. Crystal structures for the mutants N107THsFH, H180RHsFH, Q185RHsFH, K230RHsFH, E362QHsFH, S365GHsFH and N373DHsFH were determined. The mutations Q185R, E362Q, S365G and N373D were identified in the active site and affect the substrate binding capacity directly, while mutation H180R was localized in the B site, which conducts the substrates and products in and out the active site. The mutation K230R is localized in the central domain, but thermofluor results demonstrate a direct effect on the ability of the enzyme to accommodate the substrate. The N107T mutation located far from the active site was the only one that remained active and had its residual kinetic parameters determined. The present work contributes to the understanding of the structural bases that correlate mutations in HsFH, enzymatic deficiency and pathology.

Atualmente, no ensino médio brasileiro, o tema cinética química tem sido apontado por professores do ensino médio como sendo de difícil abordagem devido ao caráter empírico como também abstrato dos conhecimentos envolvidos. Levando em consideração essas dificuldades, o objetivo desta pesquisa foi o de identificar como uma abordagem com foco na história da ciência pode contribuir para uma transição progressiva de professores de química do ensino médio no que se refere ao modelo de ensino de cinética química, considerando os conteúdos e as estratégias de ensino utilizadas. Para alcançar esse objetivo foi oferecido um curso de formação continuada para 20 professores de química, em que foi apresentado o tema cinética química na perspectiva do desenvolvimento histórico desse tema (reconstrução histórica), permitindo assim uma melhor compreensão do contexto no qual esses conceitos foram desenvolvidos. Baseando-se na perspectiva de Lakatos, foram construídos modelos de ensino de cinética química a partir das ideias dos professores, procurando-se verificar se esses modelos formam sequências de transição progressiva, similares ao que Lakatos, na História da Ciência, se refere a \"problemática\" que aumenta o poder explanatório/heurístico do modelo. A evolução dos modelos, que geralmente consiste em transições progressivas e que variam em grau, está relacionada ao entendimento manifestado pelos professores dos conteúdos específicos de cinética química, do entendimento da natureza da ciência e à compreensão do desenvolvido histórico desse tema. Inicialmente, os modelos de ensino dos professores estavam baseados principalmente nos aspectos macroscópicos da cinética química, como, por exemplo, nos fatores que influem na velocidade de uma reação química, sendo que poucos professores possuíam modelos em que estavam presentes aspectos microscópicos. Percebeu-se, pela análise dos modelos de ensino dos professores, que houve transição progressiva principalmente no que se refere ao entendimento do papel da Historia da Química no ensino como também na construção de imagem de ciência mais coerente com a perspectiva racionalista. / Chemical kinetics in high school is regarded, by teachers, as a complex topic to be taught since it comprehends explanatory theoretical models (including mathematical models) besides descriptive empirical approaches. Considering these difficulties the aim of this study is to investigate how a historical approach can facilitate teaching, taking into account their decisions about the content selection and teaching strategies. An in-service course on chemical kinetics focused on its historical development (historical reconstruction) was offered to 20 chemistry teachers. The course aimed to promote the understanding of the historical context in which the kinetic concepts were developed. Based on Lakatos science program perspective, models for chemical kinetics teaching were built and they were based on the teachers\' conceptions raised during the course activities as an attempt to verify if they represented sequences of progressive transitions similar to what Lakatos has referred as \"progressive problemshifts\" in the history of science. The evolution of the teachers\' models were related to the understanding manifested by them of specific content on chemical kinetics, understanding the nature of science, as well as the comprehension of the historical development of chemical kinetic concepts and models. At the beginning of the course, the teaching models were mainly based on macroscopic aspects of chemical kinetics, for instance, the factors that affect the rate of chemical reactions. Analyzing teaching models of teachers, we noted that there was a progressive transition, especially on the understanding of the role of the History of Science in education, but also in building of the image of science, more consistent with the rationalist perspective.

O trabalho tem por objetivo a aplicação de técnicas de modelagem molecular como ferramenta de pesquisa em Engenharia Química, em particular no estudo das reações químicas envolvidas na degradação do fenol em processos oxidativos avançados. Os resultados obtidos para reações em fase gasosa mostram que o uso dessa ferramenta, no nível de teoria selecionado (B3LYP/6-31++G(d,p)), é adequado para descrever a maioria das reações do mecanismo proposto. As constantes cinéticas calculadas (através da Teoria do Estado de Transição), quando comparadas com os dados experimentais disponíveis, encontram-se dentro da mesma ordem de grandeza para a rota mais viável. A simulação de um par de reações paralelas mostra o mesmo perfil de queda do fenol encontrado para as constantes cinéticas experimentais. A comparação com resultados teóricos prévios mostra que a adição de efeitos de polarização das nuvens eletrônicas ao conjunto de base resulta em um aperfeiçoamento nos valores das constantes cinéticas. Os estudos do meio solvatado mostram que o modelo de solvatação implícita SM5.42R é adequado para descrever o sistema, por reproduzir bem o valor experimental da energia de solvatação do fenol. Entretanto, não é possível fazer comparações quanto aos radicais devido à ausência de dados experimentais. Dentre os modelos de solvatação explícita construídos, o modelo que conta com uma esfera de solvatação de 4 moléculas de água se mostrou melhor para o fenol. Já para o intermediário radicalar O1, o modelo mais adequado foi o que conta com 6 moléculas de água formando um ciclo sobre as hidroxilas ligadas ao anel. Com os resultados obtidos e suas comparações com valores experimentais discute-se a aplicabilidade de técnicas de Modelagem Molecular em estudos aplicados em Engenharia Química, reforçando a visão desta ferramenta como um instrumento importante no projeto de novos produtos e na otimização de processos de interesse tecnológico. / This work has the main objetive of applying molecular modeling techniques as a research tool in Chemical Engineering particularly on the study of the chemical reactions involved in the degradation of phenol by Advanced Oxidation Processes. The obtained results for gas phase reactions show that the use of this tool, in the selected level of theory (B3LYP/6- 31++G(d,p)) is adequate to describe most of the reactions within the proposed mechanism. The calculated kinetic constants (through Transition State Theory), when compared with the available experimental data, were found to be within the same order for the most likely pathway. The simulation of a parallel reactions pair shows the same declining profile found for experimental kinetic constants. The comparison with previous theoretical results suggest that the addition of polarization effects on the basis set results in a higher accuracy of the kinetic constant values. The studies of the continuum show that the implicit solvation model SM5.42R is adequate to describe the system, since it reproduces well the experimental value of solvation energy for phenol. However, it is not possible to do comparisons for the radicals due to the absence of experimental data. Among the explicit solvation models constructed, the one which represents a solvation sphere of four water molecules has shown better accuracy to phenol. For the radical intermediate O1, the most suitable model found was the one with six water molecules joined in a cycle on the hydroxyls bonded to the ring. With the obtained results and their comparisons with experimental data, the applicability of Molecular Modeling techniques in Chemical Engineering studies is discussed, reinforcing the perspective of this tool as an important instrument for the design of new products and the optimization of technologically relevant processes.