The study of cis-regulatory elements (CREs) will allow for increased understanding of regulation and lead to insight regarding the mechanisms governing growth, development, health, and disease. The aim of this study was to characterize the de novo in silico predictions of Arabidopsis CREs. Eight synthetic and 30 native promoter-constructs containing an eGFP/GUS reporter protein were generated for cold, genotoxic, heat, osmotic, and salt stress; the circadian clock; ABA signaling; root and epidermis tissue. Constructs were stably transformed into A. thaliana Col-0 and the effects of the CREs were evaluated by in planta stress or tissue assays using GUS expression levels. Results reveal a novel genotoxic element that specifically directs GUS expression in rosette leaves during genotoxic stress. Results also look promising for novel epidermis and root-specific elements. Results of these assays validate the de novo prediction pipeline's ability to identify novel and known CREs related to abiotic stress.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:25:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_taciane_finatto.pdf: 5834731 bytes, checksum: e10f781234d54582cc17a9b8dff16c53 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / Iron toxicity in plants is associated with the presence of large concentrations of reduced iron (Fe2+) in the soil solution, which occurs in flooded soils and affects rice plants grown under this condition. Symptoms of iron toxicity involve oxidative stress in leaves, as a response to excessive Fe2+ absorption by the roots. The responses of plants to stress conditions include stimulus perception, signal transduction and gene transcription activation. Besides gene expression, LTR (Long Terminal Repeat) retrotransposons represent ca. 22% of the rice genome, they can be transcriptionally activated under stress, and they can alter the expression of adjacent genes (e.g. due to alterations in chromatin structure). This study aimed to identify differentially expressed genes and LTR retrotransposons in leaves of 18-day-old rice seedlings (Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare) after four days of iron excess exposure. They were identified a differential expression of genes and LTR retrotransposons in rice exposed to iron excess using a microarray approach. Total RNA was extracted from leaves of 18-day-old rice seedlings (Oryza sativa L. ssp japonica cv. Nipponbare) after four days of cultivation in nutrient solution with iron excess (7 mM of FeSO47H2O) and in a control solution. The hybridization was performed with cDNA and rice transposome array v. 2.0 microarray (Roche/NimbleGen technology, an improvement of v.1.0, Picault et al., 2009). Data from gene expression was analyzed by the Bayesian t-test with BH adjustment method. Gene annotation, gene ontology, and LTR retrotransposon identification were performed at RAP-DB (Rice Annotation Project Database, build 5), and microarray results were validated by RT-qPCR. Considering log2 FC (log2-fold-change) ≤ -1 as underexpression and ≥ 1 as overexpression (p-values ≤ 0.05), 44 down-regulated and 1,572 up-regulated genes with described function were identified. Down-regulated genes were related to a wide range of functions and no gene family could be highlighted. Among the up-regulated genes, 166 were transcription factors, the most representative belonging to the Zinc finger RING/FYVE/PHD-type family (22) and WRKY family (19); other genes were from the kinase family, participating in biological processes of protein amino acid phosphorylation (86); had molecular function of iron ion binding (56); were involved in response to oxidative stress (scavenging of reactive oxygen species) (26); had molecular function of transport activity (84), including four genes related to heavy metal transport/detoxification and four genes of the multi antimicrobial extrusion protein MATE family; and were involved in the biological process of apoptosis (14), including 10 genes of NB-ARC. Among the up-regulated genes, 435 present at least one cis-regulatory element responsive to abscisic acid (ABA) with significant occurrence (P≤0.05) in its promoter region (1 kbp upstream of the transcription start site). These data indicate that about 28% of the up-regulated genes can be regulated by changing in the ABA content in leaves in response to iron excess. Regarding expression of LTR retrotransposons, 302 were down-regulated (53 Ty1/Copia, 172 Ty3/Gypsy and 77 unclassified), and 4342 up-regulated (466 Ty1/Copia, 2276 Ty3/Gypsy and 1600 unclassified). They were observed a large activity of LTR retrotransposons in response to iron toxicity, and furthermore, they were verified that LTR retrotransposons transcription can extend to 5' and 3' flanking regions. In addition, 16 situations that should up-regulated LTR retrotransposons are located at a very short distance (smaller than 1000 base pairs) in the same chromosome of up-regulated genes suggesting co-transcription, these occurrences are represented by eight where the LTR retrotransposon and the gene have the same sense of transcription (plus); five occurrences with the both with the same sense of transcription (minus) and one occurrence where they have opposite senses. Additionally, two occurrences that in which both, DNA sequences of up-regulated retrotransposon and gene, are overlapped and have the same sense of transcription. / A toxidez por ferro em plantas está associada com a presença de grandes concentrações de ferro (Fe) reduzido (Fe2+) na solução do solo, esta condição pode ocorrer em solos irrigados por inundação. Os sintomas de toxidez por ferro incluem estresse oxidativo nas folhas como resultado do excesso de Fe2+ absorvido pelas raízes, resultando em perdas na produtividade. As respostas das plantas às condições de estresse envolvem a percepção dos estímulos, transdução de sinais e ativação da transcrição gênica. Além da expressão gênica, os LTR retrotransposons (Long Terminal Repeat Retrotransposons) que respresentam cerca de 20% do genoma do arroz, podem ser transcricionalmente ativados em condições de estresse e desta forma, influenciar a expressão de genes adjacentes (por exemplo devido a alterações na estrutura da cromatina). Este estudo teve por objetivo identificar genes e LTR retrotransposons diferencialmente expressos em plântulas de arroz (Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare), após quatro dias de exposição ao excesso de ferro em solução nutritiva. A expressão diferencial de genes e LTR retrotransposons foi analisada utilizando a técnica de microarranjo e sua validação foi realizada por meio de RT-qPCR. O RNA total foi extraído de folhas de plântulas de arroz cv. Nipponbare, após quatro dias de cultivo em solução nutritiva adicionada de ferro na concentração de 7 mM (FeSO47H2O) (presença de toxidez) e a condição controle com presença de ferro na concentração de 10 μM. O cDNA fita dupla foi sintetitizado a partir do RNA mensageiro. A hibridização foi realizada entre o cDNA das duas condições em triplicatas biológicas e o microarranjo Rice Transposome Array v. 2.0 (Roche/NimbleGen technology, an improvement of v.1.0, Picault et al., 2009). Os valores de intensidade de cada spot foram normalizados, transformados e comparados pelo teste T Bayesiano. A identificação dos genes e LTR retrotransposons foi realizada de acordo com o banco de dados RAP-DB (Rice Annotation Project Database, build 5). Considerando log2 FC (log2-fold-change) ≤ -1 como subexpressão e ≥ 1 como superexpressão e P≤ 0.05 para ambas condições. Foram identificados 44 genes subexpressos e 1.572 superexpressos com funções descritas. Os genes subexpressos desempenham a uma vasta gama de funções. Entre elas destacam-se: 166 genes que são fatores de transcrição, sendo que os mais representativos pertencem à família Zinc finger RING/FYVE/PHD-type family (22 genes) e WRKY (19 genes); outros genes da família das cinases que participam também da sinalização celular em processos biológicos de fosforilação de aminoácidos nas proteínas (86 genes); outros genes com função molecular de ligação ao íon ferro (56 genes); 26 genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo (scavengers de espécies reativas de oxigênio); 84 genes com função molecular de transporte, incluindo quatro genes relacionados ao transporte e detoxificação de metais pesados e quatro genes da família MATE; 14 genes envolvidos em apoptose, incluindo 10 genes NB-ARC. Entre os genes superexpressos, 435 apresentam pelo menos um elemento regulatório de ação cis responsivo ao ácido abscisico (ABA) com ocorrência significativa (P≤0,05) em sua região promotora (1 kbp a montante do sítio de início da transcrição). Estes dados indicam que cerca de 28% dos genes superexpressos podem ser regulados pelas alterações no conteúdo de ABA nas folhas, em resposta ao estresse por excesso de ferro. Considerando a expressão do LTR retrotransposons, 302 apresentaram subexpressão (53 Ty1/Copia, 172 Ty3/Gypsy e 77 não classificados), e 4.342 apresentaram superexpressão (466 Ty1/Copia, 2276 Ty3/Gypsy e 1600 não classificados). Foi constatada grande atividade transcricional dos LTR retrotransposons em resposta à toxidez por ferro, sendo que a transcrição dos LTR retrotransposons pode se estender às suas regiões flanqueadoras 5 e 3 , além disso foram encontradas 16 ocorrencias em que o LTR retrotransposon e o gene superexpresso estão localizados a uma distância menor do que 1000 pares de bases no mesmo cromossomo, sugerindo co-transcrição entre ambos. Entre as 16 ocorrências, oito em que o LTR retrotransposon e o gene apresentam o mesmo sentido de transcrição (plus); cinco ocorrências com mesmo sentido de transcrição (minus) e uma ocorrência onde LTR retrotrotransposon e gene apresentam sentidos de transcrição opostos. Foram observadas ainda, duas ocorrências em que as sequencias de DNA do LTR retrotransposon e do gene superexpressos estão sobrepostas, e apresentam o mesmo sentido de transcrição.estresse oxidativo (scavengers de espécies reativas de oxigênio); 84 genes com função molecular de transporte, incluindo quatro genes relacionados ao transporte e detoxificação de metais pesados e quatro genes da família MATE; 14 genes envolvidos em apoptose, incluindo 10 genes NB-ARC. Entre os genes superexpressos, 435 apresentam pelo menos um elemento regulatório de ação cis responsivo ao ácido abscisico (ABA) com ocorrência significativa (P≤0,05) em sua região promotora (1 kbp a montante do sítio de início da transcrição). Estes dados indicam que cerca de 28% dos genes superexpressos podem ser regulados pelas alterações no conteúdo de ABA nas folhas, em resposta ao estresse por excesso de ferro. Considerando a expressão do LTR retrotransposons, 302 apresentaram subexpressão (53 Ty1/Copia, 172 Ty3/Gypsy e 77 não classificados), e 4.342 apresentaram superexpressão (466 Ty1/Copia, 2276 Ty3/Gypsy e 1600 não classificados). Foi constatada grande atividade transcricional dos LTR retrotransposons em resposta à toxidez por ferro, sendo que a transcrição dos LTR retrotransposons pode se estender às suas regiões flanqueadoras 5 e 3 , além disso foram encontradas 16 ocorrencias em que o LTR retrotransposon e o gene superexpresso estão localizados a uma distância menor do que 1000 pares de bases no mesmo cromossomo, sugerindo co-transcrição entre ambos. Entre as 16 ocorrências, oito em que o LTR retrotransposon e o gene apresentam o mesmo sentido de transcrição (plus); cinco ocorrências com mesmo sentido de transcrição (minus) e uma ocorrência onde LTR retrotrotransposon e gene apresentam sentidos de transcrição opostos. Foram observadas ainda, duas ocorrências em que as sequencias de DNA do LTR retrotransposon e do gene superexpressos estão sobrepostas, e apresentam o mesmo sentido de transcrição.

Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, não flagelada, agente causal de doenças de importância econômica como a doença de Pierce nas videiras e a clorose variegada dos citros (CVC) nas laranjeiras. O objetivo do presente trabalho foi realizar análises in silico das sequências promotoras dos genes deste fitopatógeno em uma tentativa de arrecadar novas evidências para o melhor entendimento da dinâmica de regulação transcricional de seus genes, incluindo aqueles envolvidos em mecanismos de patogenicidade e virulência. Para tanto, duas estratégias foram utilizadas para predição de elementos cis-regulatórios em regiões promotoras do genoma da cepa referência 9a5c, comprovadamente associada à CVC. A primeira, conhecida como phylogenetic footprinting, foi empregada para identificação de elementos regulatórios conservados em promotores de unidades transcricionais ortólogas, levando em consideração o conjunto de genes de X. fastidiosa e 7 espécies comparativas. O critério para identificação de unidades transcricionais ortólogas, isto é, unidades trancricionais oriundas de espécies distintas e cujos promotores compartilham elementos cis-regulatórios, foi paralelamente estudado utilizando-se informações regulatórias das bactérias modelos: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e Escherichia coli. Os resultados obtidos com análise de phylogenetic footprinting nos permitiu acessar a rede regulatória transcricional da espécie de forma compreensiva (global). Foram estabelecidas 2990 interações regulatórias, compreendendo 80 motivos distribuídos nos promotores de 56.8% das unidades transcricionais do genoma de X. fastidiosa. Na segunda estratégia recuperamos informações regulatórias experimentalmente validadas em E. coli e complementamos o conhecimento de dez regulons de X. fastidiosa, através de uma metodologia de scanning (varredura), dos quais algumas interações regulatórias já haviam sido previamente descritas por outros trabalhos. Destacamos os regulons de Fur e CRP, reguladores transcricionais globais, que se mostraram responsáveis pela modulação de genes relacionados a mecanismos de invasão e colonização do hospedeiro vegetal entre outros. Por fim, análises comparativas em regiões regulatórias correspondentes entre cepas foram realizadas e diferenças possivelmente associadas a particularidades fenotípicas foram identificadas entre 9a5c e J1a12, um isolado de citros não virulento, e 9a5c e Temecula1, um isolado de videira causador da doença de Pierce. / Xylella fastidiosa is a gram-negative, non-flagellated bacterium responsible for causing economically important diseases such as Pierce\'s disease in grapevines and Citrus Variegated Clorosis (CVC) in sweet orange trees. In the present work we performed in silico analysis on promoter sequences of protein-coding genes from this phytopathogen, including those involved in virulence and pathogenic mechanisms, in an attempt to better understand the underlying transcriptional regulatory dynamics. Two strategies for cis-regulatory elements prediction were applied on promoter sequences from 9a5c strain genome, a proven causal agent of CVC. The first one, known as phylogenetic footprinting, involved the prediction of regulatory motifs conserved on promoter sequences of orthologous transcription units from X. fastidiosa and a set of 7 comparatives species. The criteria to identify orthologous transcription units, i. e., those from different species and whose promoter sequences share at least one common regulatory motif, was studied based on regulatory information available for model organisms: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis and Escherichia coli. The results obtained with the phylogenetic footprinting analysis permitted us to access the underlying transcriptional regulatory network from the species in a comprehensive manner (genome-wide), with a total of 2990 regulatory interactions corresponding to 80 predicted motifs distributed on promoter sequences of 56.8% of all transcription units. In the second strategy regulatory information from E. coli was recovered and used to expand the knowledge of ten regulons in X. fastidiosa, through a scanning process, of which some regulatory interactions were previously described by independent studies. We emphasize some genes related to host invasion and colonization present in the Fur and CRP regulons, two global transcription regulators. Lastly, comparative analysis on corresponding regulatory regions among strains were performed and differences possibly associated to phenotypic variation were identified between 9a5c and J1a12, a non-virulent strain isolated from orange trees, and between 9a5c and Temecula1, a strain associated to Pierce\'s disease on grapevines.