Universidade Federal do Cearà / O presente trabalho relata o estudo quÃmico dos constituintes volÃteis das folhas e frutos de Myrcia sp., coletados no municÃpio de Amontada-CE em marÃo de 2005 e a obtenÃÃo de fraÃÃes e substÃncias provenientes do decocto das folhas frescas e do extrato etanÃlico das folhas secas de Cissus verticillata, bem como o estudo concomitante do seu potencial farmacolÃgico como hipoglicemiante atravÃs de testes realizados com a fraÃÃo solÃvel em metanol, fraÃÃo rica em tiramina e com a tiramina, obtidos de C. verticillata. Os Ãleos essenciais de Myrcea sp. foram analisados por cromatografia gÃs-lÃquido acoplada à espectrometria de massa (CGL/EM) e, quantitativamente, atravÃs do uso de CGL acoplada a detector do tipo FID. A anÃlise do Ãleo essencial das folhas de Myrcia sp. (GAOFOLHAS), permitiu a identificaÃÃo de treze componentes: d-elemeno, b-elemeno, trans-cariofileno, a-humuleno, b-chamigreno, germacreno D, b-selineno, a-guaieno, a-selineno, a-Z-bisaboleno, d-cadineno, epi-a-murolol e a-cadinol. O Ãleo essencial dos frutos de Myrcia sp. (GAOFRUTOS) permitiu a identificaÃÃo de onze componentes: d-elemeno, b-elemeno, trans-cariofileno, a-guaieno, a-humuleno, germacreno D, b-selineno, a-selineno, germacreno A, d-cadineno e germacreno B. O estudo fitoquÃmico do decocto de C. verticillata resultou na fraÃÃo rica em tiramina (CVFDSM-F19-24) que apÃs fracionamento cromatogrÃfico permitiu o isolamento da substÃncia tiramina, inÃdita no gÃnero Cissus. Os testes realizados com esta fraÃÃo e com a tiramina, em ratos com diabetes aloxan-induzida, mostraram reduÃÃo na glicemia, colesterol total, triglicÃrides e nÃveis de VLDL e aumento nos nÃveis de HDL. O fracionamento cromatogrÃfico da fraÃÃo hexÃnica, proveniente do extrato etanÃlico das folhas secas de C. verticillata, permitiu o isolamento dos esterÃides, b-sitosterol e b-sitosterol-glicosilado. A caracterizaÃÃo estrutural das substÃncias isoladas de C. verticillata foi realizada atravÃs do uso de tÃcnicas espectroscÃpicas, tais como, infravermelho e RMN de 1H e 13C, incluindo tÃcnicas uni e bidimensionais (HMBC e HMQC), bem como a comparaÃÃo com dados descritos na literatura. / The present work reports on the volatile constituents from leaves and fruits of Myrcia sp. collected in Amontada County-Cearà State, in march/2006. It also reports on the phytochemical analysis of the decoction solution from fresh leaves, and the ethanol extract of dried leaves of Cissus verticillata in a concomitant study of its pharmacological potential as hipoglycemiant. GLC/MS and GLC/FID analysis of the essential oil from leaves (GAOFOLHAS) allowed the identification of 13 components: d-elemene, b-elemene, trans-caryophyllene, a-humulene, b-chamigrene, germacrene D, b-selinene, a-guaiene, a-selinene, a-Z-bisabolene, d-cadinene, epi-a-murolol and a-cadinol, while the essential oil from fruits (GAOFRUTOS) allowed the identification of 11 components: d-elemene, b-elemene, trans-cariophylene, a-guaiene, a-humulene, germacrene D, b-selinene, a-selinene, germacrene A, d-cadinene and germacrene B. The silica-gel chromatography analysis of the decoction solution of fresh leaves of C. verticillata allowed the separation of a fraction rich in tyramine, and from it, pure tyramine. Pharmacological tests on rats with aloxan-induced glycemia with both the tyramine rich fraction and pure tyramine allowed reduction on the glycemia levels, as well as for total cholesterol, triglycerids and VLDL, but HDL increasing. Silica-gel chromatography analyses of the ethanol extract from dried leaves of C. verticillata allowed the isolation of b-sitosterol and its glucoside derivative. Structure determination of all substances of C. verticillata was accomplished by means of spectroscopic techniques such as IR, 1H and 13C NMR, including uni and bi-dimensional pulse sequences (HMBC and HMQC) ad comparison with data from the literature.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / IntroduÃÃo: A Cissus verticillata à uma planta, utilizada popularmente como antidiabÃtica e antiinflamatÃria, Objetivos: Investigar as atividades antidiabÃtica, analgÃsica, antiinflamatÃria e antioxidante da FraÃÃo SolÃvel em Metanol (FSM), FraÃÃo Rica em Tiramina (FRT) e tiramina (TIR) isolados de Cissus verticillata. Material e MÃtodos: Ratos Wistar, machos, foram tratados por via oral com a FSM (50 e 100 mg/kg), glibenclamida(GLI, 5 mg/kg), Ãgua destilada ou glicose), e o sangue coletado antes e 30, 60, 90 e 120 min apÃs à glicose (3g/kg) para medir a hipoglicemia. Na avaliaÃÃo da glicemia em ratos normais, os animais foram tratados com a FSM (100 mg/kg), GLI (5 mg/kg) ou Ãgua destilada e a glicemia medida antes e 5 dias depois do tratamento. O diabetes foi induzidos com aloxano (40 mg/kg, i.v) e apÃs 48 h, os animais foram tratados por via oral com a FSM (100 mg/kg), GLI (5 mg/kg) e TIR (2 e 4 mg/kg) e a glicemia determinada antes e 30, 60, 90 e 120 min apÃs à glicose. Outros grupos de animais diabÃticos foram tratados com a FSM (50 e 100 mg/kg), FRT (100 mg/kg), TIR (1- 4 mg/kg), GLI (2,5 e 5 mg/kg), MET (50 e 100 mg/kg) e 5 dias depois, o sangue foi coletado para avaliaÃÃo da glicemia, triglicerÃdios, VLDL, colesterol total, HDL, AST, ALT, urÃia e creatinina. Os animais que sobreviveram foram sacrificados, dissecados o pÃncreas e o fÃgado, e os ÃrgÃos foram usados para a avaliaÃÃo histopatolÃgica, sendo este Ãltimo tambÃm utilizado para avaliaÃÃo da atividade antioxidante (TBARS, GSH, catalase e nitritos/nitratos). Para determinaÃÃo da hemoglobina glicada in vitro foi utilizado sangue de ratos nÃo-diabÃticos incubados com D-glicose (50mM) e FSM ou TIR (50 g/ml). Na dosagem do glicogÃnio hepÃtico, ratos diabÃticos foram tratados por 10 dias com a FSM. A avaliaÃÃo da atividade analgÃsica foi realizada em camundongos Swiss, machos, tratados com a FSM (50 e 100 mg/kg, v.o.), TIR (1,2 e 4 mg/kg), GLI ( 5 mg/kg) e MOR (10 mg/kg,.) no teste da formalina. A atividade antiinflamatÃria foi analisada com os modelos do edema de pata induzido por carragenina ou dextrano, em ratos e camundongos tratados com FSM (50 e 100 e 200 mg/kg), TIR (1- 4 mg/kg), GLI ( 5 mg/kg), INDO (5 mg/kg) e CIPRO (5 e 10 mg/kg,v.o.). Resultados: A FSM demonstrou pequena atividade hipoglicemiante no teste de tolerÃncia a glicose em ratos normais e foi ineficaz em diabÃticos. A FSM reduziu a glicemia em ratos normais, enquanto a TIR nÃo teve efeito. O tratamento de ratos diabÃticos durante 5 dias com a FSM, FRT, TIR, GLI e MET reduziu a glicemia, triglicerÃdios, VLDL, urÃia e creatinina. Nenhuma potencializaÃÃo do efeito hipoglicÃmico foi observado com a associaÃÃo de FSM + TIR ou GLI + TIR. Os estudos histopatolÃgicos mostraram regeneraÃÃo das lesÃes e aumento do nÃmero de cÃlulas  apÃs tratamento dos animais diabÃticos com a FSM, TIR e GLI. A FSM e TIR mostraram atividade antioxiodante, como aumento no nÃvel de GSH e reduÃÃo nos nÃveis de catalase e nitritos. A FRT aumentou somente o GSH. A FSM e TIR reduziram a hemoglobina glicada, demonstraram potente atividade analgÃsica, mas foram ineficazes como antiinflamatÃrias. A FSM e TIR nÃo reverteram a hiperglicemia induzida pelo diazÃxido, um bloqueador dos canais de potÃssio. MET e TIR reduziram a glicemia, triglicerÃdios, VLDL, urÃia e creatinina, e os efeitos hipoglicemiantes foram potencializados quando essas duas drogas foram associadas. ConclusÃo: Estes resultados confirmam a atividade hipoglicemiante da FSM. O mecanismo de aÃÃo nÃo parece ser similar aquele apresentado pelas sulfonilurÃias. A potencializaÃÃo do efeito hipoglicemiante da TIR foi observada apÃs sua associaÃÃo com MET, sugerindo que o mecanismo de aÃÃo dos constituintes hipoglicÃmicos de C. verticillata à similar ao das biguanidas. Posteriormente, a FSM e TIR apresentaram atividade antioxidante, reduzidos nÃveis de hemoglobina glicada, aumento do glicogÃnio hepÃtico, e no nÃmero de cÃlulas  pancreÃticas, sugerindo que essas drogas diminuem a toxicidade hepÃtica e pancreÃtica. Embora a atividade antiinflamatÃria tenha sido marginal, seu efeito foi potencializado pela associaÃÃo com TIR, indicando que a TIR à um dos principais constituintes bioativos de Cissus verticillata. / IntroduÃÃo: A Cissus verticillata à uma planta, utilizada popularmente como antidiabÃtica e antiinflamatÃria, Objetivos: Investigar as atividades antidiabÃtica, analgÃsica, antiinflamatÃria e antioxidante da FraÃÃo SolÃvel em Metanol (FSM), FraÃÃo Rica em Tiramina (FRT) e tiramina (TIR) isolados de Cissus verticillata. Material e MÃtodos: Ratos Wistar, machos, foram tratados por via oral com a FSM (50 e 100 mg/kg), glibenclamida(GLI, 5 mg/kg), Ãgua destilada ou glicose), e o sangue coletado antes e 30, 60, 90 e 120 min apÃs à glicose (3g/kg) para medir a hipoglicemia. Na avaliaÃÃo da glicemia em ratos normais, os animais foram tratados com a FSM (100 mg/kg), GLI (5 mg/kg) ou Ãgua destilada e a glicemia medida antes e 5 dias depois do tratamento. O diabetes foi induzidos com aloxano (40 mg/kg, i.v) e apÃs 48 h, os animais foram tratados por via oral com a FSM (100 mg/kg), GLI (5 mg/kg) e TIR (2 e 4 mg/kg) e a glicemia determinada antes e 30, 60, 90 e 120 min apÃs à glicose. Outros grupos de animais diabÃticos foram tratados com a FSM (50 e 100 mg/kg), FRT (100 mg/kg), TIR (1- 4 mg/kg), GLI (2,5 e 5 mg/kg), MET (50 e 100 mg/kg) e 5 dias depois, o sangue foi coletado para avaliaÃÃo da glicemia, triglicerÃdios, VLDL, colesterol total, HDL, AST, ALT, urÃia e creatinina. Os animais que sobreviveram foram sacrificados, dissecados o pÃncreas e o fÃgado, e os ÃrgÃos foram usados para a avaliaÃÃo histopatolÃgica, sendo este Ãltimo tambÃm utilizado para avaliaÃÃo da atividade antioxidante (TBARS, GSH, catalase e nitritos/nitratos). Para determinaÃÃo da hemoglobina glicada in vitro foi utilizado sangue de ratos nÃo-diabÃticos incubados com D-glicose (50mM) e FSM ou TIR (50 g/ml). Na dosagem do glicogÃnio hepÃtico, ratos diabÃticos foram tratados por 10 dias com a FSM. A avaliaÃÃo da atividade analgÃsica foi realizada em camundongos Swiss, machos, tratados com a FSM (50 e 100 mg/kg, v.o.), TIR (1,2 e 4 mg/kg), GLI ( 5 mg/kg) e MOR (10 mg/kg,.) no teste da formalina. A atividade antiinflamatÃria foi analisada com os modelos do edema de pata induzido por carragenina ou dextrano, em ratos e camundongos tratados com FSM (50 e 100 e 200 mg/kg), TIR (1- 4 mg/kg), GLI ( 5 mg/kg), INDO (5 mg/kg) e CIPRO (5 e 10 mg/kg,v.o.). Resultados: A FSM demonstrou pequena atividade hipoglicemiante no teste de tolerÃncia a glicose em ratos normais e foi ineficaz em diabÃticos. A FSM reduziu a glicemia em ratos normais, enquanto a TIR nÃo teve efeito. O tratamento de ratos diabÃticos durante 5 dias com a FSM, FRT, TIR, GLI e MET reduziu a glicemia, triglicerÃdios, VLDL, urÃia e creatinina. Nenhuma potencializaÃÃo do efeito hipoglicÃmico foi observado com a associaÃÃo de FSM + TIR ou GLI + TIR. Os estudos histopatolÃgicos mostraram regeneraÃÃo das lesÃes e aumento do nÃmero de cÃlulas  apÃs tratamento dos animais diabÃticos com a FSM, TIR e GLI. A FSM e TIR mostraram atividade antioxiodante, como aumento no nÃvel de GSH e reduÃÃo nos nÃveis de catalase e nitritos. A FRT aumentou somente o GSH. A FSM e TIR reduziram a hemoglobina glicada, demonstraram potente atividade analgÃsica, mas foram ineficazes como antiinflamatÃrias. A FSM e TIR nÃo reverteram a hiperglicemia induzida pelo diazÃxido, um bloqueador dos canais de potÃssio. MET e TIR reduziram a glicemia, triglicerÃdios, VLDL, urÃia e creatinina, e os efeitos hipoglicemiantes foram potencializados quando essas duas drogas foram associadas. ConclusÃo: Estes resultados confirmam a atividade hipoglicemiante da FSM. O mecanismo de aÃÃo nÃo parece ser similar aquele apresentado pelas sulfonilurÃias. A potencializaÃÃo do efeito hipoglicemiante da TIR foi observada apÃs sua associaÃÃo com MET, sugerindo que o mecanismo de aÃÃo dos constituintes hipoglicÃmicos de C. verticillata à similar ao das biguanidas. Posteriormente, a FSM e TIR apresentaram atividade antioxidante, reduzidos nÃveis de hemoglobina glicada, aumento do glicogÃnio hepÃtico, e no nÃmero de cÃlulas  pancreÃticas, sugerindo que essas drogas diminuem a toxicidade hepÃtica e pancreÃtica. Embora a atividade antiinflamatÃria tenha sido marginal, seu efeito foi potencializado pela associaÃÃo com TIR, indicando que a TIR à um dos principais constituintes bioativos de Cissus verticillata.

In many developing countries, farmers and pastoralists still rely on their indigenous knowledge, practices and locally available plants to control nematode parasitic infections, both in livestock and humans. The overall aim of my thesis was to undertake bioassay-guided phyto-chemical study of extracts and their constituents from Ethiopian anti-parasitic plants used by healers to control gastrointestinal nematode parasites in livestock to validate their ethno-medicinal use and to characterise and identify their active ingredients. As a first experiment (Chapter Three), four types of crude extracts (water, 70% methyl-alcohol, absolute methanol and acetone) of four indigenous Ethiopian medicinal plants (Adenia species, Cissus ruspolii, Ipomoea eriocarpa and Euphorbia thymifolia) were screened against Teladorsagia circumcincta egg hatching in vitro, not only as a first step to validate the traditional healers claim but also to choose the most promising plant extract(s) for further phyto-chemical studies. The egg hatching inhibition (EHI) test results revealed that the anti-parasitic properties of these plants depended on plant species, dose, and solvent polarity. The water extracts of both C. ruspolii and Adenia sp. exhibited largest, up to 100% EHI but also larval migration inhibition activities, and were selected for further studies. The second experiment (Chapter Four) assessed the nature of active constituents in these extracts by physico-chemical methods. It was observed that the major constituents of both plant extracts responsible for the EHI activities are likely highly polar, water-soluble, small and moderately heat-labile molecules. The third and fourth experiments (Chapters Five and Six) consisted of separating Cissus ruspolii and Adenia sp. water extracts into discrete fractions by gel-permeation chromatography, EHI tests of Bio-Gel P-2 fractions followed by thin layer chromatography (TLC) profiling of these fractions to detect separated spots (in day light, under UV-light or after staining with various staining reagents) and also to see how elution patterns of separated spots affected by column parameters. The EHI tests on the fractions obtained revealed that the active constituents of C. ruspolii and Adenia sp. water crude extracts were eluted into few fractions based on their molecular sizes. The TLC profilings of these fractions identified spot patterns of active and inactive fractions, which allowed pooling of active constituents based on their EHI and TLC profiling into three pools for each plant. The fifth experiment (Chapter Seven) was to isolate and purify compounds from these pools using various preparative planar and column chromatographic methods. Sequential applications of column chromatography followed by preparative thin layer chromatography isolated and purified five active compounds from C. ruspolii and two active compounds from Adenia sp. The sixth experiment (Chapter Eight) was to characterize and propose/elucidate structures of compounds from the active fractions using chromatographic, analytical and spectroscopic methods. In this regard, the structures of two oleanane type triterpenoid saponins isolated from one of active fractions of Adenia sp. were proposed based on their mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) data with support of compounds property, TLC and literature. Similar outcomes for C. ruspolii were not achieved due to lack of sufficient sample to run 13C-nuclear magnetic resonance spectroscopy and distortionless enhancement by polarization transfer (DEPT), contamination of some purified compounds with ill-characterised substance from the preparative TLC matrix and in some cases mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) data did not support each other. The last experiment (Chapter Nine) was to assess anthelmintic efficacy and safety of C. ruspolii and Adenia sp. crude water extracts in Heligmosomoides bakeri infected mice. This in vivo test revealed that both plant extracts exhibited significant reduction in worm burdens and worm egg excretion, with moderate effects on haematology and organ weights at tolerated dosages. In conclusion, both in vitro and in vivo data revealed that Adenia sp. and C. ruspolii have anthelmintic properties, thus validating traditional healer claims and supporting ethno-medicinal use. The bioassay-guided phytochemical study resulted in the isolation of a number of active compounds from these plants, for some of which a structure has been proposed.