La diabetis tipus 1 (DM1) és una malaltia autoimmune causada per la destrucció de cèl·lules productores d'insulina β en els illots pancreàtics, aquesta destrucció és mediada per limfòcits. En aquesta tesi es pretén donar a conèixer les dianes moleculars de les cèl·lules β responsables de la mort de les cèl·lules β causada per l'atac limfocític. Es van realitzar assajos de microarrays per tal d’identificar els gens expressats diferencialment en les cèl·lules endocrines d’illots, com a conseqüència de la infiltració insulítica, mitjançant la comparació de cèl·lules endocrines d’ illots provinents de ratolins NOD (Non Obese Diabetic)- model de ratolí predisposat genèticament a la diabetis autoimmune-, amb les provinents del seu homòleg lliure de limfòcits, NOD / SCID. Curiosament, vam descobrir que la ciclina D3 (CcnD3) es regula a la baixa a conseqüència de la inflamació d'una manera dosi-dependent, mentre que l'activitat proliferativa de les cèl·lules β no es veu alterada per aquesta disminució en l’expressió de ciclina D3. A més, les cèl·lules NIT-1 que sobreexpressen Ciclina D3 resten protegides de l'apoptosi espontània i de l'apoptosi induïda per un entorn proinflamatori proporcionat per IL-β. Per demostrar la relació de causalitat entre la repressió de CcnD3 repressió i la mort de les cèl·lules β in vivo, hem estudiat l’aparició de diabetis espontània en ratolins NOD deficients en CcnD3 (NODCcnD3KO). Els ratolins NODCcnD3KO desenvolupen diabetis exacerbada en comparació amb companys de llodrigada de tipus salvatge (WT) (88% enfront de 61% respectivament), i aquest fet deu únicament a la deficiència de CcnD3 a les cèl·lules β i no a un augment de diabetogenicitat del repertori limfocític dels ratolins NODCcnD3KO. No obstant això, l'exacerbació de la diabetis requereix de la complicitat de tots dos, la deficiència CcnD3 i la inflamació, ja que els ratolins NOD/SCIDCcnD3KO, els quals no tenen limfòcits, no desenvolupen diabetis espontània. CcnD3 té també un paper essencial en la fisiologia les de cèl·lules β del pàncrees, ja que illots pancreàtics deficients en CcnD3 no experimenten canvis adients en les concentracions intracel·lulars de Ca2+ en resposta a concentracions canviants de glucosa en el medi, el qual denota una sensibilitat deficient a la glucosa en aquests illots. Aquest deteriorament d'acoblament concentració de glucosa en el medi extracel·lular i l’augment a la concentració intracel·lular de Ca2+ no és a causa dels canvis en els nivells d’expressió del transportador de glucosa GLUT-2 entre illots NODCcnD3 KO i NODWT. D'altra banda, hem desenvolupat ratolins transgènics que sobreexpressen ciclina D3 en cèl·lules β pancreàtiques (NOD/RIPCcnD3). Aquests ratolins mostren protecció contra la diabetis autoimmune i rescaten ratolins NOD CcnD3KO de desenvolupar diabetis exacerbada. / Type 1 Diabetes (T1D) is an autoimmune condition caused by the lymphocytemediated destruction of insulin-producing β cells in pancreatic islets. This thesis aims to unveil the final targets in the β cells responsible for the β cell loss caused by the lymphocytic attack. Microarray studies were performed to assess differentially expressed genes in islet endocrine cells as a consequence of insulitic infiltration by comparing the autoimmune-prone Non-Obese Diabetic (NOD) mouse model with its congenic, lymphocyte-free, NOD/SCID strain. Interestingly, we discovered that cyclin D3 (CcnD3) underwent downregulation in beta cells upon inflammatory insult in a dose-dependent manner, while the proliferative activity of beta cells downregulating CcnD3 was not altered. Moreover, NIT-1 cells stably overexpressing CcnD3 were protected from spontaneous apoptosis and from apoptosis induced by a proinflammatory environment provided by IL-1β. To demonstrate the causal link between CcnD3 repression and β cell death in vivo, we studied spontaneous diabetes onset in CcnD3 deficient NOD mice (NODCcnD3KO). NODCcnD3KO mice developed exacerbated diabetes compared to the wild type (WT) littermates (88% versus 61% respectively), and this fact was solely due to the CcnD3 deficiency in the β cells and not to an increased diabetogenicity of the NODCcnD3KO lymphocytic repertoire. However, diabetes exacerbation required the complicity of both CcnD3 deficiency and inflammation, since plain NOD/SCID CcnD3KO mice did not develop spontaneous diabetes. CcnD3 also plays an essential role in pancreatic β-cell fitness, since pancreatic islets deficient in CcnD3 do not experience proper intracellular Ca2+ influx changes in response to different concentrations of glucose. This impairment, coupling glucose concentration in the extracellular milieu and intracellular increase in Ca2+ concentration, is not due to changes in Glut-2 expression levels between the CcnD3 KO and WT islets. Moreover, we developed transgenic mice overexpressing cyclin D3 in pancreatic β cells (NOD/RIPCcnD3). These mice exhibit protection from autoimmune diabetes and NOD CcnD3KO mice are prevented from developing exacerbated diabetes. / La diabetes tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune causada por la destrucción de las células β productoras de insulina en los islotes pancreáticos por parte de los linfocitos. En esta tesis pretendemos dar a conocer dianas moleculares de las células β responsables de pérdida de la célula β causadas por el ataque linfocitico. Desarrollamos un estudio de microarreglos en el cual encontramos genes expresados diferencialmente en células endócrinas del islote como consecuencia de la infiltración insulítica mediante la comparación de un modelo de ratón autoinmune susceptible No Obeso Diabético (NOD) con una cepa congénica libre de linfocitos NOD/SCID. Interesantemente, descubrimos que, la ciclina D3 (CcnD3) experimentó una disminución como consecuencia de un asalto inflamatorio de forma dosis dependiente, mientras que la actividad de proliferación de las células β no fue alterada. Además, células NIT-1 que sobreexpresan CcnD3 fueron protegidas de apoptosis espontánea y apoptosis inducida por un entorno proinflamatorio proporcionado por la IL-1β. Para demostrar la relación causal entre la represión de la CcnD3 y la muerte de las células β in vivo, hemos estudiado la aparición de la diabetes espontánea en ratones NOD deficientes en CcnD3 (NODCcnD3KO). Los ratones NODCcnD3KO desarrollan una diabetes exacerbada en comparación con sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT) (88% contra el 61% respectivamente) y este hecho debido únicamente a la deficiencia de CcnD3 de las células β y no a un aumento de diabetogenicidad del repertorio linfocítico de los ratones NODCcnD3KO. Sin embargo, la exacerbación de la diabetes requiere la complicidad de ambos, la deficiencia de CcnD3 e inflamación, ya que los ratones NOD/SCIDCcnD3KO, los cuales carecen de linfocitos, no desarrollan diabetes espontánea. CcnD3 tiene también un papel escencial en la fisiología de las células β del páncreas, ya que los islotes deficientes de CcnD3 no experimentan cambios apropiados en las concentraciones intracelulares de Ca2+ en respuesta a diferentes concentraciones de glucosa en el medio. Este deterioro en el acoplamiento de la concentración de glucosa en el medio extracelular y aumento de la concentración intracelular de Ca2 + no es debido al cambio del nivel de expresión del transportador de GLUT-2 entre islotes NODCcnD3 KO y NODWT. Por otro lado, hemos desarrollado ratones transgénicos que sobreexpresan la ciclina D3 en células β pancreáticas (NOD/RIPCcnD3). Estos ratones muestran protección contra la diabetes autoinmune y rescatan a ratones NOD CcnD3KO de desarrollar diabetes exacerbada.

En aquesta tesi s’ha realitzat l’avaluació de l’eficàcia de la teràpia antiangiogènica i la teràpia dirigida a receptors ErbBs en tumors germinals testiculars (TGTs). Tot i que els TGTs són dels tumors amb taxes de curació més elevades, la incidència de la malaltia va augmentant en les poblacions caucàsiques i encara hi ha pacients que presenten resistència al cisplatí, amb l’agreujant de que són pacients joves entre 15 a 35 anys. En primer lloc hem observat que els receptors ErbB1, ErbB2 i ErbB3 s’expressen de manera generalitzada en els TGTs ortotòpics de diferent component histològic, mantenint a més a més el patró d’expressió del tumor primari a xenògraft. En un d’aquest models, el coriocarcinoma TGT38, es va avaluar l’eficàcia de les teràpies dirigides contra els receptors ErbBs. En estudis previs s’havia observat que aquest tumor no responia a les teràpies dirigides a ErbB1, malgrat presentava uns elevats nivells d’expressió del receptor. En aquest estudi, per contra, hem observat que el tractament dirigit de manera dual al bloqueig d’ErbB1 i d’ErbB2, tractant amb lapatinib, comprometia en un 50% el creixement tumoral, així com provocava la inhibició de les vies de senyalització efectores ERK1/2, AKT i STAT3. Demostrem doncs que l’activitat d’ErbB2 dimeritza amb ErbB3, i aquest heterodímer té un paper clau en el creixement tumoral del TGT38, així com en la proliferació de cel•lular de tumor testicular in vitro, i que confereix la resistència de novo a les teràpies dirigides a ErbB1. L’altra teràpia estudiada en aquesta tesi és l’antiangiogènica, que hem avaluat utilitzant pazopanib, inhibidor dels receptors de VEGF, dels receptors de PDGFalfai -beta,i c-KIT. Hem observat com aquest fàrmac bloqueja significativament el creixement tumoral del tumor sensible a cisplatí TGT38, així com una activitat antitumoral sinèrgica amb lapatinib. Per altra banda també hem observat un bloqueig significatiu en el TGT44, un model tumoral que presenta resistència a cisplatí, característica mantinguda del tumor primari on ja va presentar refractorietat al quimioterapèutic. En ambdós models tumorals hem observat que pazopanib tenia una activitat antiangiogènica i antitumoral, així com també hem observat com bloquejava la proliferació de cèl•lules tumorals de TGTs in vitro presentant més efecte en les cèl•lules amb resistència a cisplatí que en les sensibles. En aquesta línia d’investigació hem observat com PDGFRbeta, un dels receptors diana de pazopanib, es sobre expressa en els fenotips resistents de parelles sensibles-resistents a cisplatí, tant de línies cel•lulars de TGTs com de tumors ortotòpics testiculars. Hem demostrat també que el principal efector d’aquest receptor és AKT, observant també una sobre activació d’aquest en les cèl•lules resistents a cisplatí comparat amb les sensibles; així com una activació en presència de PDGF-BB i una disminució en presència de shRNAs pel receptor o del tractament amb pazopanib. En aquest estudi hem descrit doncs l’activació de la via de PDGF-BB/ PDGFRbeta/AKT com a nou mecanisme de resistència adquirida a cisplatí. A més a més hem observat una elevada expressió de PDGFRbetaen la majoria de TGTs humans analitzats. El conjunt dels resultats presenten a pazopanib com a possible agent per una teràpia alternativa al tractament dels pacients de TGT sensibles o resistents a cisplatí, sol o en combinació amb teràpies dirigides a receptors ErbBs. / Cisplatin resistance in testicular germ cell tumor (TGT) patients is still a clinical challenge, and the aim of this study has been the study of different therapies for TGT. On one hand we’ve detected high expression of ErbB1, ErbB2 and ErbB3 receptors in different human TGTs and that the expression pattern was maintained to the orthotopic animal models generated. We’ve described that the heterodimer ErbB2/ErbB3 has an important role in tumor growth of a TGT model in vivo and in in vitro tumor testicular cells and its activity might explain the de novo resistance to pure ErbB1 receptor inhibitors. We’ve shown that treatment with lapatinib caused a 50% inhibition in TGT38 tumor growth, a coriocarcinoma ortotopic tumor sensitive to cisplatin. Moreover, in this model we observed that lapatinib treatment in combination to pazopanib had an additive effect blocking tumor growth. Furthermore, pazopanib had an important antitumoral effect in a new orthotopic model generated from a metastatic TGT refractory to first-line cisplatin chemotherapy (TGT44). Pazopanib main targets are the VEGFRs, PDGFRs and c-KIT receptor, and in this work we’ve observed that not only had antiangiogenic effect in vivo, besides it had antitumoral activity also in in vitro TGT cells. Moreover the antiproliferative effect was stronger in cisplatin-resistant cells than in the sensitive counterparts. Our results indicated that there was an overexpression of PDGFRbetaand an AKT overactivation in cisplatin-resistant cells, compared with sensitive cells. When PDGFRbetalevels were decreased CDDP-resistant cells behaved like sensitive cells, and PDGF-BB stimuli was the only that activated AKT phosphorilation. These results suggested that PDGFRbetaoverexpression was responsible for AKT overactivation, presenting the PDGFRbeta-AKT pathway as a pathway involved in the development of cisplatin resistance in TGT cells. Furthermore we also found overexpression of PDGFRβ in CDDP-resistant choriocarcinoma orthotopic tumor versus their CDDP-sensitive counterpart, and we found high PDGFRbetalevels in human testicular tumors. All together, these results present pazopanib as possible agent for an alternative treatment of cisplatin-sensitive and cisplatin-refractory TGT patients, alone or in combination with anti-ErbB therapies.

La Leucèmia Limfàtica Crònica (LLC) és una neoplàsia maligna caracteritzada per l’acumulació monoclonal i progressiva de limfòcits B madurs a la sang, moll de l’os i òrgans limfoides. És la leucèmia més comú al món occidental, afecta als adults i la seva incidència és major en edats avançades, essent més freqüent en homes. Malgrat els avenços en el coneixement de la patogenicitat, la LLC continua essent una malaltia incurable. La LLC és una malaltia clínicament molt heterogènia. Els pacients poden presentar una evolució molt ràpida de la malaltia o, per contra, tenir una esperança de vida normal. Un dels factors pronòstic independents que ajuda a determinar la probabilitat de progressió i la supervivència és la proteïna ZAP-70. Aquesta proteïna ha estat associada amb una major senyalització del BCR i a una major resposta a estímuls de supervivència i migració. Aquests estímuls provindrien d’ambients favorables com el present als ganglis limfàtics i al moll de l’os, localització preferent de les cèl•lules de LLC. Amb aquest coneixement, la present tesi va ésser plantejada amb l’objectiu d’estudiar els efectes de la proteïna ZAP-70 en la regulació de la interacció de les cèl•lules de LLC amb el microambient. El primer estudi es va iniciar amb la generació de dues línies cel•lulars que expressen la proteïna ZAP-70 de manera estable. La proteïna ZAP-70 va augmentar la senyalització de l’IgM-BCR, i no de l’IgD-BCR, mitjançant l'activació d’Akt i ERK1/2. L’activació constitutiva de ZAP-70, a la segona línia estable, va permetre observar que, per si sola, ZAP-70 és capaç de potenciar l’activació de la via de les MAPK. També es va observar que ZAP-70 pot retardar la internalització d’elements del BCR posterior a l’activació d’aquest, explicant la perllongada activitat senyalitzadora. L’estimulació del BCR en cèl•lules amb expressió de ZAP-70 va ésser capaç de modular diferencialment l'expressió de diferents receptors de quimioquines, destacant l’augment d’expressió de CCR7, el qual va resultar ésser depenent de l’activació d’ERK1/2. Nivells elevats d’aquest receptor van implicar major senyalització d’aquest, posterior a la lligació de la quimioquina CCL21, i major migració in vitro. Estudis amb mostres primàries de pacients amb LLC varen mostrar elevada expressió de CCR7 en cèl•lules amb alta expressió de ZAP-70, així com elevada capacitat de migració. El segon estudi es va plantejar amb l’objectiu d’observar, in vivo, la capacitat d'infiltració dels limfòcits B malignes amb expressió de ZAP-70 com a únic factor diferencial. Els ratolins inoculats amb limfòcits amb expressió de ZAP-70 no varen presentar diferències en supervivència respecte als ratolins controls però sí es va observar una major infiltració del moll de l’os. La principal quimioquina que regula el tràfic de limfòcits al moll de l’os és la CXCL12 i els nostres estudis varen confirmar in vitro que ZAP-70 provoca una major migració cel•lular a aquesta quimioquina. Aquest augment de migració no es dóna per un increment en els nivells del receptor CXCR4, sinó per una major senyalització d’aquest amb la lligació de la quimioquina. En conclusió, segons les nostres observacions, la proteïna ZAP-70 augmenta la senyalització del BCR i modula l'expressió d'alguns receptors de quimioquines com el CCR7. ZAP-70 augmenta la infiltració del moll de l’os per la cèl•lula B maligna, principalment per una major senyalització del receptor CXCR4 posteriorment a la seva estimulació. En pacients amb LLC, aquest mecanisme facilitaria l’accés de les cèl•lules malignes a rebre estímuls anti-apoptòtics i senyals de proliferació en un ambient favorable, com és el moll de l’os. En conseqüència, possibles teràpies inhibidores d’aquest tàndem CXCR4/CXCL12 podrien contribuir a la millora en el tractament d’aquesta malaltia. / Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is a malignant neoplasm characterized by the monoclonal and progressive accumulation of mature B lymphocytes in blood, bone marrow and lymph nodes. CLL is the most common leukemia found in adults in Western countries being slightly more common in men. Despite significant advances in understanding the pathogenesis, it is still an incurable disease. CLL is a very heterogeneous disease and patients can have a very fast progression or conversely, have a normal life span. One of the independent prognostic factors that help to determine the progression and survival is ZAP-70 protein. This protein has been related to enhanced signaling through the BCR, and to increased response to diverse migrative and survival stimuli. These stimuli come from favorables microenvironments, mainly from the lymph node and bone marrow, where these cells accumulate. Against this background, this thesis aimed to ascertain the specific influence of ZAP-70 protein in the crosstalk between CLL cells and the microenvironment. The first study was initiated with the generation of two cell lines stably expressing ZAP-70 protein. The protein ZAP-70 increased the signaling from IgM-BCR, but not from IgD-BCR, by enhancing Akt and ERK1/2 activation. Constitutively active ZAP-70 found in the second cell line was sufficient to potentiate MAPK signaling. A delayed internalization of components from the BCR was observed after receptor activation in ZAP-70 expressing cells, probably explaining the increased activation observed. Stimulation of the BCR in ZAP-70-expressing cell line lead to a differential modulation of chemokine receptors expression. The most significant change was the up-regulation of CCR7 expression, which was depenent on the activation of ERK1/2. Moreover, stimulation of CCR7 with CCL21 in ZAP-70-expressing cells caused an increased signaling and migration in vitro. Subsequent analysis of primary samples from patients with CLL confirmed the increased expression of CCR7 and migrative capacity in ZAP-70 positive cells. The aim of the second study was to observe in vivo the migratory pattern of cells with ZAP-70 expression as the only variable. Mice inoculated with a ZAP-70 expressing cell line did not have a different survival from that of control mice, however, a remarkable greater infiltration of the bone marrow was observed in these mice. The main chemokine regulating the trafficking of B-lymphocytes into the bone marrow is CXCL12. In vitro experiments showed that ZAP-70 causes an increased migration toward this chemokine. This enhanced migration was not related to an increased expression of the CXCR4 receptor but to an enhanced signaling upon chemokine ligation. Collectively, our findings suggest that ZAP-70 enhances BCR signaling and modulates chemokie receptors on cell surface such as CCR7. ZAP-70 enhances the migration of malignant B-cells into the bone marrow mainly by enhancing signaling and migration after CXCR4 stimulation. In patients with CLL, this mechanism would facilitate the access of malignant cells to receive additional survival, anti-apoptotic and proliferative signals that can be found in the supportive microenvironment of the bone marrow. Consequently, the development of new treatments blocking the tandem CXCR4/CXCL12 may contribute to the improvement of the CLL treatment strategy.

Esta tesis consta de un prefacio más ocho capítulos que se interconectan entre sí con el fin de realizar una evaluación global del estado de salud o enfermedad del niño y el adolescente obeso mediante el análisis de la patología subclínica y clínica asociadas. Objetivos. 1) Analizar gráficas de crecimiento idóneas para la correcta detección de obesidad infanto-juvenil. 2) Determinar la prevalencia de comorbilidad asociada a la obesidad infanto-juvenil. 3) Analizar la presencia de factores de riesgo cardiovascular (RCV), identificando el estado metabólico de riesgo cardiovascular en los pacientes obesos. 4) Analizar la relación entre la obesidad infanto-juvenil y marcadores proinflamatorios. 6) Determinar el grosor de la intima-media carotidea (GIM) y cambios subclínicos estructurales del ventrículo izquierdo (VI) en los pacientes obesos. Sujetos y método. Diseño transversal: análisis descriptivo de la prevalencia de obesidad según la metodología diagnóstica utilizada y de la comorbilidad asociada a la obesidad. Diseño casos–control: análisis comparativo de alteraciones clínico-metabólicas, proinflamatorias y cardiovasculares entre individuos obesos y no obesos. Participaron 183 niños y adolescentes obesos (IMC>Pc97 y/o SDS-IMC≥2), se formaron subgrupos al azar para cada fase de estudio. El grupo control lo integraron 40 niños y adolescentes no obesos (IMC<Pc85 y/o SDS-IMC<2). A todos se les realizó anamnesis, examen físico y determinación de parámetros glucídicos y lipídicos [n=170], bioquímicos [n=170], endocrinológicos [n=140] y proinflamatorios [n=117]; y ecografía hepática [n=127], ecografía vascular [n=102] y ecografía cardíaca [n=99]). Protocolo aprobado por el Comité de Ética del Hospital. Se firmó consentimiento informado. Programa estadístico SPSS v17. Se consideró significativa a p<0,05. Resultados. 1) Las gráficas de Hernández, el Estudio Transversal Español de Crecimiento 2010 de Carrascosa aplicando criterios de la OMS 2007 y la Absorciometría dual de rayos X de doble energía coincidieron en el diagnóstico de obesidad en el 100% de individuos estudiados. 2) Existió elevada prevalencia de alteraciones asociadas a la obesidad (82% metabólicas, 48% cardíacas, 38% hipertensión arterial (HTA), 29% esteatosis hepática, 22% endocrinológicas). 3) A) Los obesos presentaron mayores niveles de parámetros e índices glucídicos con una prevalencia de estas alteraciones del 45%. El SDS-IMC se correlacionó de forma positiva con la insulina basal (r:0,220;p<0,01) e índices glucídicos (HOMA-IR [r:0,221;p<0,01], QUICKI [r:0,212;p<0,01]). B) Los obesos presentaron una prevalencia de alteraciones lipídicas del 75%, siendo las más destacadas la disminución de HDL colesterol (HDL) y el aumento de triglicéridos (TG). La regresión lineal múltiple (RL) mostró asociación significativa entre HDL con TG y HOMA-IR, y de TG con HDL y HOMA-IR. C) El 38% de los obesos presentó HTA. La tensión arterial sistólica se correlacionó negativamente con HDL (r:-0,173;p<0,05) y adiponectina (r:-0,239;p<0,05). D) El 29% de los obesos presentó un estado metabólico de alto RCV (90% disminución del HDL y 72% HTA), que se asoció con el mayor grado de obesidad. 4) El 24% de los obesos presentó esteatosis hepática (40% con aminotransferasas normales). El análisis de regresión logística mostró asociación significativa entre esteatosis hepática y HOMA-IR y estado metabólico de alto riesgo cardiovascular. 5) A) La adiponectina fue inferior en obesos (p<0,001). Se detectó asociación significativa entre adiponectina y edad y SDS-IMC. B) La PCR fue mayor en obesos (p<0,001), y se detectó asociación significativa entre PCR y SDS-IMC. La papp-a no fue diferente entre obesos y no obesos. 6) A) El GIM carotídeo fue mayor en obesos (p<0,001), sin observarse asociaciones con otros factores de riesgo. B) Los parámetros ecocardiográficos estructurales del VI (pared posterior, tabique interventricular y el índice de masa del ventrículo (IMVI) fueron superiores en obesos. La RL mostró asociación significativa entre el tabique interventricular y la pared posterior del VI con la edad y el SDS-IMC. El 48% de los obesos presentaron hipertrofia del VI según el IMVI, que se asoció a mayor grado de obesidad, disminución de adiponectina y al estado metabólico de alto RCV. Según los resultados obtenidos se concluye que la prevalencia del estado de enfermedad clínico-metabólica subyacente en niños y adolescentes obesos ha sido elevada, detectándose diferentes grados de alteraciones incluso en individuos con exceso de peso leve. Se destaca la existencia de cambios cardiovasculares estructurales que sumados a factores de riesgo cardiovascular existentes en esta población, señalan la importancia de realizar un diagnóstico precoz con el fin de instaurar el tratamiento oportuno para mejorar la morbi-mortalidad. / This thesis consists of a preface and eight interconnected chapters with the aim of performing a global evaluation of the health or disease condition in obese children and young people by means of the analysis of the associated subclinical and clinical pathology. Aims. 1) To analyze suitable growth graphs for the correct detection of childhood and adolescent obesity. 2) To determine the prevalence of comorbid conditions associated with childhood and adolescent obesity. 3) To analyze the presence of cardiovascular risk factors, identifying the metabolic condition of cardiovascular risk in the obese patients. 4) To analyze the relation between childhood and adolescent obesity and pro-inflammatory markers. 5) To determine the carotid intima-media thickness (IMT) and subclinical structural changes of the left ventricle (LV) in the obese patients. Subjects and method. Transversal design: descriptive analysis of the prevalence of obesity according to the diagnostic methodology used, and of the comorbid conditions associated with childhood and adolescent obesity. Cases-controls design: analysis of clinical-metabolic, pro-inflammatory and cardiovascular disorders, comparing between obese and not obese individuals. 183 obese children and adolescents took part (BMI>Pc97 and/or BMI-SDS≥2); subgroups were formed at random for every phase of study. 40 non-obese children and adolescents integrated the control group (IMC<Pc85 and/or BMI-SDS<2). All of them underwent anamnesis, physical examination and determination of glucidic and lipidic [n=170], biochemical [n=170], endocrine [n=140] and pro-inflammatory parameters [n=117]; and hepatic [n=127], vascular [n=102] and cardiac ultrasound scan [n=99]). Protocol was approved by the Ethics Committee of the Hospital. Informed assent was signed. Statistical program SPSS v17. It was considered to be significant to p<0,05. Results. 1) Hernandez’s graphs, Carrascosa´s Transverse Spanish Study of Growth 2010 applying criteria of the WHO 2007 and the Dual-energy X-ray absorptiometry coincided with the diagnosis of obesity in 100% of individuals studied. 2) There was a raised prevalence of disorders associated with the obesity (82% metabolic disorders, 48% cardiac disorders, 38% arterial hypertension (HTA), 29% fatty liver, 22% endocrine disorders). 3) A) Obese patients presented higher levels of glucidic parameters and insulin resistance (IR) indices, with a prevalence of carbohydrate disorders of 45%. BMI-SDS correlated positively with basal insulin (r:0,220;p<0,01) and IR indices (HOMA-IR [r:0,221;p<0,01], QUICKI [r:0,212;p<0,01]). B) The prevalence of lipid disorders in obese patient was 75%, the most outstanding being the decrease of HDL-cholesterol (HDL) and the increase of triglycerides (TG). The linear multiple regressions (RL) showed significant association between HDL with TG and HOMA-IR, and TG with HDL and HOMA-IR. C) 38% of the obese patients presented HTA. Systolic arterial pressure was correlated negatively with HDL (r:-0,173;p<0,05) and adiponectin (r:-0,239;p<0,05). D) 29% of the obese patients presented a metabolic condition of high cardiovascular risk (90% decrease of HDL and 72% HTA) that was associated with the higher degree of obesity. 4) 24% of the obese patients presented non-alcoholic fatty liver disease (40% with normal liver transaminase levels). The analysis of logistic regression showed significant association between fatty liver with HOMA-IR and metabolic condition of high cardiovascular risk. 5) A) The adiponectin was lower in obese patients (p<0,001). Significant association was detected between adiponectin and age and BMI-SDS. B) The PCR was higher in obese (p<0,001), and significant association was detected between PCR and BMI-SDS. The papp-a was not different between the obese and not obese. 6) A) Carotid IMT was superior in obese (p<0,001), without associations being observed with other risk factors. B) The structural echocardiographic parameters of the LV (lateral wall of the LV [LW], interventricular septum and left ventricular mass index [LVIM]) were superior in obese patients. The RL showed significant association between interventricular septum and LW with age and BMI-SDS. 48% of the obese presented left ventricular hypertrophy according to the LVIM, which was associated with a higher degree of obesity, decrease of adiponectin and metabolic condition of high cardiovascular risk. According to the results, it is concluded that the prevalence of underlying clinical-metabolic disorders in obese children and adolescents has been high, different degrees of alterations being detected even in individuals with slight overweight. The outlined existence of cardiovascular structural changes, added to existing cardiovascular risk factors in this population, indicates the importance of establishing a precocious diagnosis in order to administer the opportune treatment to improve the morbi-mortality.

Durant la resposta al.lèrgica s’alliberen una gran quantitat de mediadors que participen en la reacció inflamatòria característica, i el factor d’activació de plaquetes (PAF) sembla jugar un paper important en moltes d’aquestes malalties al·lèrgiques. El paper del PAF s’ha demostrat a malalties com la rinitis, l’asma o les reaccions anafilàctiques, i es planteja la hipòtesi que pugui ser una nova diana terapèutica. En el cas de l’asma els resultats dels estudis realitzats són discordants, a l’anafilaxi són molt recents i escassos, però no hi ha treballs en el camp de la rinitis. La tesi es divideix en dos projectes relacionats amb models d’exposició a PAF. El primer projecte es va realitzar en pacients amb rinitis al.lèrgica i voluntaris sans, que es van exposar nasalment al PAF. Amb aquest plantejament es va avaluar l’efecte del PAF (símptomes i reducció del volum nasal) sobre la mucosa nasal, i si aquest efecte és diferent en individus amb rinitis al.lèrgica i en aquells que no en pateixen. Així mateix es va comparar l’efecte del PAF en individus prèviament tractats amb dos antihistamínics diferents, un d’ells amb un suposat efecte antagonista del PAF. Els resultats de l’estudi demostren que l’administració nasal de PAF indueix símptomes de rinitis, principalment obstrucció nasal que resulta ser un dels símptomes de més difícil control. Així mateix, el suposat efecte antagonista del PAF d’un dels antihistamínics testats no sembla confirmarse en totes les variables mesurades. El segon projecte és un model de provocació in vitro en mastòcits humans, tant derivats d’una línia cel·lular com cultius primaris pulmonars. Seguint el mateix plantejament que al l’estudi in vivo, es van estimular els mastòcits amb PAF per valorar-ne l’efecte. Així mateix es va comparar el poder inhibitori d’un antagonista de PAF, així com de diferents antihistamínics amb i sense efecte anti-PAF. Els resultats de l’estudi demostren que el PAF indueix la desgranulació dels mastòcits humans, i que els antihistamínics testats tenen certa capacitat per inhibir aquest efecte. Tot i que només l’antihistamínic amb efecte anti-PAF és capaç d’inhibir la desgranulació mastocitaria en totes les condicions i experiments realitzats. En canvi, l’antagonista del PAF inhibeix de forma efectiva la desgranulació mastocitària. De manera que podem concloure que el PAF és un mediador rellevant a la resposta al.lèrgica, responsable d’un dels símptomes més difícils de tractar de la rinitis, com és la congestió. Per una altra banda, també hem demostrat que els símptomes són al menys parcialment dependents de mastòcits. Finalment, la inhibició de PAF resulta en una inhibició parcial de la resposta al.lèrgica. / Several mediators are release during the allergic reactions and participate in the characteristic inflammation, platelet-activating factor (PAF) among them. PAF seems to have an important role in several allergic diseases and it has been demonstrated in asthma, rhinitis and anaphylaxis. Studies performed in asthma are inconclusive, studies in anaphylaxis are recent and limited, but no studies exist in rhinitis. The thesis is divided into two projects related to PAF challenge models. The first project has been performed in allergic rhinitis patients and healthy volunteers. We evaluated PAF effect after nasal challenge, on nasal symptoms and nasal volume reduction, and the differences between allergic rhinitis patients and healthy volunteers. Moreover, the antagonistic effect of two antihistamines, one of them with anti-PAF activity, was evaluated. PAF reproduces allergic rhinitis symptoms, mostly nasal congestion that is the most difficult to treat symptom. Antihistamines, even the one with anti-PAF effect, don’t inhibit PAF-induced nasal response. The second project is based in a PAF challenge model in human mast cells, both cell line and lung primary cultures. Mast cells were stimulated with PAF in order to evaluate PAFinduced degranulation. Furthermore, PAF antagonist and antihistamines inhibitory effect was evaluated, both for regular antihistamines and anti-PAF one. PAF induces mast cell degranulation, and antihistamines inhibit this effect. However, the antihistamine with anti-PAF effect is the only one that inhibits mast cell degranulation in all conditions and experiments. PAF antagonist inhibits PAF-induced mast cell degranulation. We conclude that PAF is an important mediator in the allergic response, and play an important role in nasal congestion. On the other hand, we have demonstrated that PAFinduced symptoms are mast cell dependent. Finally, PAF inhibition is related to a partial decrease of allergic reaction intensity.

Introducción. Los corticoides constituyen la primera línea de tratamiento de la poliposis nasosinusal (PN). Objetivo. Demostrar la existencia de diferentes grados de inflamación en la PN cuando asocia o no asma, y su diferente respuesta al tratamiento corticoideo.Material y métodos. En 59 pacientes con PN, 10 como grupo control y 49 como grupo experimental, 17 sin asma (PNS), 18 con asma tolerante (PN+ATA) y 14 con asma intolerante al ácido acetil salicílico (PN+AIA) realizamos una evaluación clínica (obstrucción nasal subjetiva, endoscopia nasal, rinomanometría, olfatometría y tomografía computerizada) y experimental (expresión del gen de Cox-1 y 2) tras 4 semanas sin tratamiento corticoideo, tras dos semanas de tratamiento con corticoides orales (CCO) y doce de corticoides intranasales (CCI).Resultados. Basalmente los pacientes con PN+AIA tienen una mayor inflamación y una menor olfacción. Después del tratamiento con CCO los pacientes con PN mejoran clínicamente y aumentan la expresión del gen de Cox-2 de manera significativa (p<0,01). Los CCI mantienen la mejoría clínica (p<0,01), excepto para el sentido del olfato, aunque muestra una tendencia decreciente para la PNS, PN+ATA y PN+AIA. La expresión de Cox-1 no presenta variaciones ni después del tratamiento con CCO ni CCI. La evaluación endoscópica y del olfato se correlaciona con la puntuación tomográfica antes (r= 0,51; r= - 0,56; p<0,01) y después del tratamiento (r= 0,6; r= - 0,67; p<0,01).Conclusión. (a) Los CCO y CCI son efectivos en todos los pacientes, en menor medida cuando asocian asma tolerante o intolerante al AAS. (b) La endoscopia nasal y la olfatometría son instrumentos tan útiles como la tomografía para el seguimiento de la PN.

Els inhibidors de l'aromatasa (IA) han esdevingut el tractament hormonal adjuvant estàndard pel càncer de mama hormonosensible en estadis inicials. Un dels principals efectes secundaris dels IA, i que en alguns casos pot condicionar incompliment terapèutic, és la pèrdua de massa òssia i les artràlgies amb el conseqüent detriment en qualitat de vida. Les guies clíniques internacionals no contemplen un protocol global d’avaluació de salut òssia per les dones postmenopàusiques que reben tractament adjuvant amb IA, que s’exposen a un risc de pèrdua de massa òssia addicional al inherent a la menopausia. S’ha elaborat un protocol prospectiu d’avaluació global de la salut òssia que engloba: nivells de vitamina D (vit D), marcadors de remodelat ossi, densitometria òssia (DMO), avaluació de fractures mitjançant radiologia simple de col·lumna dorso-lumbar i qüestionaris de qualitat de vida. Aquestes avaluacions es realitzen abans d’iniciar el tractament amb IA, als 3 mesos, als 12 mesos i cada any fins un any després de finalitzar el tractament hormonal. S’han avaluat prospectivament 323 dones postmenopàusiques que inicien tractament adjuvant amb IA. Les principal troballes de l’estudi són: - El tractament adjuvant amb IA produeix un empitjorament dels valors de la DMO entre un 0.6 i 2.36% als 12 mesos, encara que s’administri tractament amb calci i vit D segons les guies de pràctica clínica. - En el moment d’iniciar els IA la prevalença de fractures per fragilitat asimptomàtiques és de l’11.8%. - Els nivells basals de vit D són més baixos que els recomanats. Per les dones amb nivells basals insuficients de vit D, es requereix un programa de suplementació addicional de vit D per normalitzar els nivells als 3 mesos. Mantenir nivells alts de vit D als 3 mesos té un efecte protector en la pèrdua de massa òssia associada als IA en dones que no reben tractament amb bisfosfonats. Qualsevol increment de vit D es correspon amb menor taxa de pèrdua de massa òssia. El valor de 40 ng/ml es podria considerar el nivell òptim de vit D per tal d’obtenir el major benefici en protecció de pèrdua de massa òssia. - Els IA augmenten dels marcadors de reabsorció òssia. - Les artràlgies representen l’efecte advers dels IA amb major impacte en la qualitat de vida. El detriment en qualitat de vida, s’experimenta tant als 3 com als 12 mesos, i és independent del tipus d’IA utilitzat en el tractament adjuvant. L’aparició d’artràlgies induïdes per IA està associada als nivells basals de vit D. Per tal de prevenir les artràlgies associades al tractament adjuvant amb IA cal assolir nivells de vit D >40 ng/ml. - Les dones que reben bisfosfonats orals durant el tractament amb IA no presenten pèrdua de massa òssia als 12 mesos. / Aromatase inhibitors are the gold standard treatment for postmenopausal women with early breast cancer (EBC). The major side effects are bone loss and arthralgias, that can induce treatment discontinuations. Baseline bone health in postmenopausal women is poorly characterised in prospective series of EBC patients candidates to AI therapy. Our objective is to comprehensively evaluate bone health in a prospective clinical cohort of patients recruited prior to adjuvant AI therapy, with the aim of establishing potential AI impact on bone loss and fractures. We consecutively included 343 women with EBC who were about to start adjuvant AI therapy. Participants were assessed before AI initiation and at 3 months, with annual assessments thereafter. Bone mineral density (BMD), spine X-ray, bone metabolism (vitamin D, bone turnover markers), arthralgia and quality of life are measured. The results of our study demonstrates: - Treatment with adjuvant AI decreases BMD 0.6 at 2.36% at 12 months, even thought calcium and vit D treatment were administered following the guidelines. - When patients starts AI the asymptomatic fragility fractures rate was 11.8%. - Baseline vit D levels are suboptimal. Vitamin D insufficiency (<30 ng/ml) is reversible and advisable in this high-risk population and, in the context of AI treatment, high doses of cholecalcifediol supplements should be given with the aim of restore vit D levels at 3 months. To maintain optimal vit D levels at 3 months protects to the AI associated bone loss in women without bisphosphonates treatment. Vit D concentration of 40 ng/ml is the optimal level to obtain the major benefit in bone loss protection. - AI increases bone turnover markers. - Arthralgias are the major adverse event with great impact on quality of life. Quality of life was worse at 3 and 12 months of treatment and it’s independent of the AI treatment used. AI induced arthralgias were related with vitamin D levels. The optimal levels of vitamin D to prevent AI associated arthralgias were > 40 ng/ml. - Bone loss at 12 months is not observed in women on oral bisphosphonates treatment.

INTRODUCCIÓ:La miocardiopatia alcohòlica (MCPA) és una malaltia específica del muscle cardíac de causa coneguda i que està classificada dins dels grup de les cardiomiopaties dilatades, tot i que en ocasions es fa referència a aquesta entitat com a malaltia del muscle cardíac en relació a l'alcohol. La primera referència documentada de la relació entre el consum d'alcohol i l'afectació cardíaca la va fer Bollinger el 1884 en el que es va anomenar "Munich beer heart" perquè l'estudi es va realitzar a Munich i en autòpsies practicades en consumidors de cervesa, en el que va detectar dilatació cardíaca i signes d'hipertròfia .-La MCPA, al igual que altres cardiopaties, com podria ser la idiopàtica, està caracteritzada per una dilatació del ventricle esquerre, una reducció del gruix de la seva paret i un increment la massa total del ventricle. Degut a que no hi ha troballes immunològiques o immunohistoquímiques específiques el diagnòstic sempre és per exclusió d'altres causes en presència de consum patològic d'alcohol.La MCPA representa el 3.8% de tots els casos de cardiomiopaties, sent la segona causa de cardiopatia dilatada. Alguns estudis de cardiopatia dilatada han reportat que entre el 23%-40% dels pacients presentaven un consum patològic d'alcohol.Hi ha certa discussió respecte si hi ha una relació lineal entre la duració i la dosi acumulada d'alcohol consumit i l'aparició d'alteracions estructurals i funcionals a nivell del miocardi; hi ha publicacions que no han trobat una correlació entre aquestes dues dades, tot i que algun grup a publicat la relació directa entre dosi total d'alcohol consumida al llarg de la vida (kg ethanol/kg pes) amb l'increment de massa del ventricle esquerre i la depressió de la fracció d'ejecció. En general els pacients que presenten alteracions cardíaques a nivell funcional i estructural presenten un consum >90 grams/dia durant més de 5 anys, tot i que la majoria d'estudis reporten una duració en el consum superior a 15 anys. Sembla que una clau determinant en el desenvolupament de la MCPA seria el temps d'exposició a l'alcohol; en aquest sentit Mathews et al. determinen en un estudi que la diferència entre el grup d'alcoholics amb MCPA i els asimptomàtics no rau en la dosi diària d'alcohol sinó en el temps de consum (10 anys versus 6 anys, respectivament) Urbano-Márquez et al. apunten en la mateixa direcció, amb una diferencia entre els grups de 24.8 anys versus 16.2 anys. Es considera que la mínima dosi que es requereix per a desenvolupar una MCPA seria de 7 kg d'etanol per kg de pes corporal en homes i 5 kg d'etanol per kg de pes corporal en dones. El consum crònic d'alcohol produeix una disfunció del ventricle esquerre dosi-depenent amb afectació tant sistòlica com diastòlica que es tradueix en una disminució de la fracció d'ejecció i una alteració en la relaxació respectivament. El primer canvi que es detecta a nivell cardíac és la dilatació del VE i l'increment de la massa del VE. Posteriorment hi ha l'aparició de disfunció diastòlica i posteriorment de la sistòlica (58, 59, 62). Alguns pacients també mostren un aprimament de la paret del VE que sempre acompanya a una dilatació del mateix i que s'ha interpretat com un canvi compensatori del mateix. A nivell histològic destaca la presència de miocitolisi, hipertròfia del miòcit i fibrosi intersticial. Hi ha una relació inversament proporcional entre la fracció de volum de miòcits i el consum d'alcohol de manera que aquells que tenen un consum d'alcohol més elevat presentat un grau més important de fibrosi . La miocitolisi s'evidencia en forma de vacualització cel·lular i desestructuració de les miofibrilles.Els possibles mecanismes fisiopatològics de la MCPA es coneixen parcialment gràcies a models animals. El problema d'aquests rau en la dificultat de desenvolupar models de consum crònic, ja que el temps necessari és massa perllongat i la dosi tòxica acumulada requerida no és tolerable a curt termini, en termes de supervivència, pels subjectes d'estudi. Els estudi estan centrats, per una banda, en els efectes de l'alcohol sobre el miocardi tan a nivell histològic com cel·lular: miocits, disfunció d'organel·les intracel·lulars, alteració de proteïnes contràctils, alteracions en l'homeostasi del calci, canvis en la cadena oxidativa i alteracions metabòliques.. Per l'altra hi ha estudis centrats en l'alteració dels mecanismes relacionats amb el sistema cardiovascular: sistema renina-angiotensina-aldosterona, el sistema autònom simpàtic (norepinefrina), les citoquines i el factor natriurètic atrial.JUSTIFICACIÓ DE LA TESI I HIPÒTESI DE TREBALL:La fisiopatologia de la miocardiopatia alcohòlica és indiscutiblement multifactorial. Hi ha publicacions prèvies que han aprofundit en aquests possibles mecanismes entre els que caldria destacar: alteració a nivell del miòcit, disfunció mitocondrial, alteració de les proteïnes contràctils, alteracions del metabolisme del calci, trastorns de la cadena oxidativa, alteracions metabòliques i participació del sistema neurohormonal.Les limitacions de la majoria d'estudis, però, rauen en que es basen en models animals i per tant les dades són difícilment extrapolables al ser humà; no només per les diferències òbvies interespècies sinó també per la gran dificultat a desenvolupar models de consum crònic d'alcohol en els animals d'experimentació; efectivament és molt difícil assolir un temps d'exposició i/o una dosi acumulada total (kg alcohol consumit/kg pes individu) equiparable al de l'ésser humà.El nostre grup de recerca, inclòs en el Grup de Recerca de Malalties Relacionades amb l'Alcohol i Patologia Muscular, Servei de Medicina Interna, dins del grup Neurociències IDIBAPS (Grup de treball 7.04) ha pretès avançar una passa més en la direcció assenyalada per treballs previs. La diferència fonamental amb qualsevol publicació prèvia sobre els efectes del l'alcohol sobre el miocardi és que s'ha aconseguit evitar les dues limitacions que hem esmentat prèviament; això ha estat això gràcies a l'ampli banc de miocardi humà que el grup ha anat construint al llarg dels darrers 10 anys, amb la inestimable col·laboració del Transplant Service Foundation (TSF), i que ens ha permès assajar estudis centrats en models d'exposició crònica i sempre en miocardi humà de cors no aptes per a trasplantament (observant les normes establertes de caire ètic i de confidencialitat).La present tesi ha aprofundit en tres mecanismes que participen en el desenvolupament de la miocardiopatia alcohòlica i que estudis previs animals han assenyalat com a destacats en la seva gènesis. Un primer treball focalitza l'atenció en la participació dels canals de calci; sent el calci un element clau en la fisiologia cardíaca la present tesi pretén demostrar que l'exposició crònica a alcohol es relaciona amb la sobre-expressió dels canals de calci-L (que són els responsables d'iniciar el complex exitació-contracció) i que aquesta sobre-expressió varia segons si el pacient presenta o no miocardiopatia. El segon treball es centra en el fenomen de l'apoptosi i la hipòtesi plantejada és que l'exposició a l'alcohol es relaciona amb un augment dels fenòmens d'apoptosi a nivell del miocardi, és a dir, que l'alcohol actuar com un inductor de l'apoptosi i per tant de la pèrdua de miòcits. Finalment, un tercer treball, estudia l'estat de l'estrès oxidatiu en relació al consum crònic d'alcohol i en relació a la presència o no de miocardiopatia. La hipòtesi proposada és que l'alcohol és capaç d'alterar l'estat oxidatiu facilitant la lesió miocàrdica per part dels radicals lliures.OBJECTIUS GENERALS DE LA TESI:1. Estudiar en pacients amb consum crònica patològic d'alcohol els receptors de calci-L, la presència d'apoptosi i l'estat oxidatius com a possibles mecansimes de la miocardioaptia alcohòlica.2. Comparar els tres grups d'estudi (control, consumidors crònics patològics d'alcohol sense miocardiopatia i consumidors crònics patològics d'alcohol amb miocardiopatia) en cada un dels mecanismes proposats.

La síndrome de Lynch és la síndrome hereditària de predisposició al càncer colorectal més freqüent, i està causada per mutacions germinals en els gens reparadors MLH1, MSH2, MSH6 o PMS2. L'anàlisi mutacional dels gens reparadors és moltes vegades no informatiu, degut a la detecció de variants de significat desconegut (VSD). Aquestes variants representen fins a un 30% de les alteracions detectades i és especialment complicat predir el seu efecte funcional, ja que podran interferir en el correcte processament del mRNA o en la funció de la proteïna. La identificació de VSD suposa una limitació important per a la correcta avaluació del risc de predisposició al càncer. L'objectiu d'aquesta tesi és avaluar l'impacte funcional de les VSD detectades en els gens MLH1 i PMS2 en pacients amb sospita de síndrome de Lynch. Per això hem fet estudis a nivell de splicing del mRNA, d'expressió de mRNA i proteïna, així com assaigs funcionals de reparació i estudis de localització subcel•lular. Els resultats aquí recollits permeten classificar un 81,2% de totes les VSD analitzades, el 56% s'han classificat com patogèniques i el 25% com probablement neutrals. Cal destacar, que dues de les VSD analitzades i que es van detectar amb una elevada prevalença en la nostra població, han estat caracteritzades com les primeres mutacions fundadors en el gen MLH1 identificades a Espanya, presentant una penetrància moderada. També proposem un algoritme d'estudi de variants que permeti integrar i prioritzar les diferents tècniques fins a la caracterització funcional. La classificació d'aquestes VSD ens ha permès millorar l'assessorament genètic d'aquestes famílies, permetent l'estudi predictiu de familiars de risc, així com la personalització de mesures de prevenció i seguiment apropiats. / Lynch syndrome (LS) is the most common hereditary colorectal cancer syndrome and is secondary to the presence of germline mutations in one of the DNA mismatch repair (MMR) genes (MLH1, MSH2, MSH6, and PMS2). Many mutations are short insertions, deletions, or nucleotide substitutions that will encode a truncated protein. These mutations are classified as pathogenic offering a good clinical tool for diagnosis and genetic counseling. However, clinical implications of missense or silent variants or mutations close to splice site are often not clear. Therefore, those variants are classified as variants of unknown significance (VUS) and represent up to 30% of the identified DNA changes in MMR genes. The scientific problem is to classify as either “pathogenic” or “not pathogenic” all MMR gene VUS identified by genetic testing for LS. The overarching goal of our studies was to assess the pathogenicity of MLH1 and PMS2 VUS detected in patients suspected to have LS. For their classification, we followed a strategy that integrates family history, pathology in tumors, and frequency in control/general population with an integrative approach including in silico and in vitro analyses at the RNA and protein level. This comprehensive analysis allowed classifying 81.2% of all VUS detected in the genes MLH1 and PMS2 in our series, this characterization has allowed classifying 56% of the variants analyzed as pathogenic and 25% as probably neutral. Furthermore, we have identified and characterized two frequent MLH1 variants among Spanish Lynch syndrome families. They represent the first founder MLH1 mutations identified in the Spanish population with moderate penetrance. Also, based on our observations we proposed an algorithm for the evaluation of VUS. We posit that this strategy provides a useful framework that emphasizes the importance of clinical information; suggest that in silico predictions can be of help in prioritizing RNA or protein assays in a mutually exclusive manner; and provides a useful framework for including all information when assessing a VUS. These findings have important implications for genetic counseling and molecular diagnosis of LS.

ANTECEDENTS: La síndrome de Turner (ST) és una de malalties cromosòmiques més freqüents, i és deguda a la pèrdua total o parcial d’un cromosoma X. Els signes cardinals són la insuficiència gonadal i la talla baixa, però altres comorbiditats s’associen a la síndrome, com les malalties cardiovasculars, immunològiques, malformacions renals o l’osteoporosi. Alteracions neurosensorials han estat relacionades amb la ST, com diferents patrons d’hipoacúsia i disfuncions olfactòries i gustatives. L’hipoestrogenisme i la manca d’alguns gens localitzats als cromosomes sexuals es postulen com a causa d’aquestes comorbiditats. HIPÒTESI: Les alteracions neurosensorials vinculades a la ST són degudes a les alteracions cromosòmiques que presenten aquestes pacients, i varien segons el grau d’afectació cariotípica. Els efectes produïts per l’hipoestrogenisme congènit són reversibles amb teràpia hormonal substitutiva. OBJECTIUS: Definir el tipus i la causa de la hipoacúsia descrita en dones amb ST a l’edat adulta, així com esbrinar si existeixen alteracions olfactòries i gustatives associades a aquesta síndrome. Demostrar que pacients amb altres hipogonadismes congènits sense alteració cariotípica no presenten aquestes comorbiditats. METODOLOGIA: es va dissenyar un estudi analític observacional de tres cohorts independents, amb dones entre 20 i 50 anys: dones amb ST; dones amb altres hipogonadismes congènits i cariotip normal; i un grup control amb dones sanes que prenien contracepció hormonal. Les dones amb hipogonadismes es tractaven amb teràpia hormonal substitutiva. Es van recollir dades clíniques, presència d’estigmes físics de la ST i antecedents de comorbiditats associades. Les pacients van omplir dos qüestionaris, un de qualitat de vida (SF-36) i l’altre de sexualitat (FSFI). Per a estudiar l’audició, es va realitzar una microotoscòpia, una audiometria estàndard, i uns potencials evocats auditius als hipogonadismes. Amb el test validat BAST-24 es va avaluar la sensibilitat i sensorialitat olfactòria i la gustometria. RESULTATS: Una pèrdua auditiva progressiva precoç s’associa a la ST, essent l’hipoacúsia neurosensorial el patró més freqüent en les dones adultes. L’etiologia d’aquesta hipoacúsia és heterogènia, i l’edat, la genètica i l’antecedent d’otitis mitjana crònica recurrent durant la infància són factors influents. Existeixen alteracions de sensorialitat olfactòria associades a la ST, de fisiopatologia desconeguda. Malgrat que la sensibilitat olfactòria no sembla afectada en aquestes pacients, les hormones sexuals tenen un paper en la percepció de la intensitat i la irritabilitat de les olors. No semblen existir alteracions en el sentit del gust en les pacients amb ST i altres hipogonadismes congènits. Les pacients amb ST i altres hipogonadismes congènits presenten pitjors puntuacions ens els dominis físics dels qüestionaris de qualitat de vida, comparades amb controls sans. Només la meitat de les dones amb ST refereixen mantenir qualsevol tipus d’activitat sexual i, les sexualment actives, només puntuen baix en el domini d’excitació. La funció sexual no es correlaciona amb les característiques físiques o les comorbiditats associades a la ST, tot i que les dones sexualment actives presenten alçades superiors. Les dones amb altres hipogonadismes congènits presenten puntuacions baixes en gairebé tots els dominis de la funció sexual, malgrat el tractament hormonal. El cultiu de cèl•lules urotelials a partir de mostres d’orina presenta dificultats i limitacions tècniques, a més d’una pèrdua d’informació cromosòmica que empitjora la seva correlació amb el fenotip. Existeix una correlació parcial entre el cariotip en sang i el fenotip. IMPLICACIONS CLÍNIQUES: - Cal comptar fins a 50 metafases en els estudis citogenètics en sospita de fallida ovàrica. - Cal fer audiometries periòdiques a la ST durant l’edat adulta. - Cal investigar la qualitat de vida i la funció sexual de les pacients amb hipogonadismes. - Es recomana que les pacients amb hipogonadismes congènits es visitin en unitats especialitzades. / HYPOTHESIS: Neurosensorial impairment related to Turner’s syndrome (TS) are due to chromosomic disorders characteristic of these patients and the degree of impariment is related with the degree of the karyotypic disorder. The consequences of hypoestrogenism are reversible with substitutive hormonal therapy. AIM: To define the origin of the hearing loss observed in TS women in adulthood; to assess whether there are olfactory and gustatory impairments related to this syndrome; and to demonstrate that patients with other congenital hypogonadism without karyotypic disorder do not show such comorbities. METHODS: Three cohort of women were studied; TS women; women with other congenital hypogonadisms, healthy women taking hormonal contraception, since hypogonadism were under substitutive hormonal therapy. Quality of life data was recorded using two questionnaires (SF-36 and FSFI). Clinical data was also gathered for each patient. Hearing impairment was assessed though a microotoscopy, standard audiometry and auditory evoked potentials. Using the BAST-24 test the test and smell sensitivity and sensibility was evaluated. RESULTS: Hearing impairment was observed among TS women, being the neurisensorial pattern the most frequent among them. The cause of this kind of impairment is diverse, being possible the age, genotype or even history of recurrent otitis during childhood. Impairment in smell was also observed in TS patients. Although sensitivity was not found impaired, it was observed that sexual hormones have a role in intensity and irritability of odours. It was not found any alteration in taste sense in any congenital hypogonadism. When it comes to quality of life, all patients with congenital hypogonadism show lower score in the physical domain than healthy controls. Only half of the TS patients mentioned to mantain sexual relationships. Sexual activity was not related to TS comorbidities but sexual active TS were taller than sexually inactive. Women with other congenital hypogonadism show low scores in sexual function, despite hormonal therapy. It was atempted to use urotelial cells to perform karyotype analysis, but its culture is tough and correlation with phenotype is worse than blood karyotyping. Therefore its use is discouraged.