Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive lymphoid neoplasm derived from mature B cells genetically characterized by the presence of the t(11;14)(q13;q32) translocation causing cyclin D1 overexpression and therefore cell cycle deregulation. However, other additional secondary genetic alterations also contribute to MCL pathogenesis. Recent studies identified a distinct subgroup of tumors with an indolent clinical behavior even without chemotherapy that tend to present with non-nodal, leukemic disease instead of extensive nodal infiltration. Moreover, recent molecular studies have identified SRY (Sex determining region-Y)-like HMG box-11 (SOX11) as one of the best characterized discriminatory genes between these two clinical subtypes of MCL, being almost exclusively overexpressed in the aggressive presentation of the disease. SOX11 is a high mobility group (HMG) transcription factor (TF) characterized by its critical involvement in embryonic development and neuronal cell differentiation. Although not apparently expressed in any normal cell subtype of the lymphoid system, it has been recently identified as playing a major role in several solid tumors and some subtypes of aggressive lymphomas. However, SOX11 oncogenic mechanisms contributing to the development and progression of these diseases are largely unknown. Although SOX11 function and potential target genes in lymphoid cells are poorly known, its high specific expression in aggressive MCL suggests that it may be an important element in the development and progression of this disease. Two publications resulted from our studies and compose this thesis. In paper I, we initiated the molecular characterization and elucidation of the SOX11-regulated transcriptional program in MCL. We performed an integrative analysis coupling data from human genome-wide promoter analysis by SOX11 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)-chip experiments and gene expression profiling (GEP) upon SOX11 silencing in MCL cell lines, and identified target genes and transcriptional programs regulated by SOX11 including the block of mature B cell differentiation, modulation of cell cycle, apoptosis, and stem cell development. Paired box protein 5 (PAX5) stood out as one of SOX11 major direct target genes. We found that SOX11 silencing downregulated PAX5, induced B lymphocyte induced maturation protein 1 (BLIMP1) expression, and promoted the shift from a mature B cell into the initial plasmacytic differentiation phenotype in both MCL primary tumor cells and an in vitro model. We also demonstrated the oncogenic implication of SOX11 expression in the aggressive behavior of MCL as SOX11-knockdown derived tumors displayed a significant reduction on tumor growth compared to SOX11-positive tumors in subcutaneous MCL xenografts. Although our results suggested that SOX11 contributed to tumor development by altering the terminal B cell differentiation program of MCL cells, the specific SOX11-regulated mechanisms promoting the oncogenic and rapid tumor growth of aggressive MCL still remained to be elucidated. Therefore, in paper II, we further characterized the potential SOX11-regulated oncogenic mechanisms by integrating our ChIP-chip data with further analyses including GEP derived from the xenograft SOX11-positive and silenced tumors. Gene ontology analysis of SOX11 target genes and gene set enrichment analyses (GSEA) of the differentially expressed genes in xenografts, human primary tumors and MCL cell lines revealed that blood vessel development and angiogenic gene signatures were significantly enriched in SOX11-positive cells. Consequently, we performed in vitro angiogenic assays and observed that conditioned media derived from SOX11-positive cells induced higher tube formation, proliferation and migration of endothelial cells, corroborated by a prominent higher density of microvessels in human primary tumors and mouse xenografts. Strikingly, gene and protein expression profiling revealed that SOX11-modulation of angiogenesis in MCL was mediated by the upregulation of the pro-angiogencic factor Platelet-derived growth factor-A (PDGFA). Inhibition of the PDGFA pathway impaired angiogenesis development both in vitro and in vivo, and also MCL tumor growth in vivo, representing a promising novel therapeutic strategy for the treatment of aggressive MCL. Overall, we have unraveled and characterized, for the first time, the oncogenic role of SOX11 and the tumorigenic pathways it orchestrates in MCL. Importantly, the elucidation of molecular oncogenic mechanisms that are deregulated by SOX11 in MCL will aid the management and stratification of MCL patients and lead to the development of new therapeutic strategies for this aggressive disease. / Les neoplàsies limfoides són un grup heterogeni de tumors caracteritzats per un event genètic inicial i l’acumulació d’alteracions moleculars secundàries que condicionen la progressió tumoral. Els mecanismes genètics que condueixen a alteracions genètiques primàries són principalment les translocacions cromosòmiques que, generalment, resulten en l’activació d’un proto-oncogen que comporta l’alteració de la proliferació, l’apoptosi o la via de diferenciació de les cèl·lules B. El limfoma de cèl·lules del mantell (LCM) és una neoplàsia limfoide caracteritzada per una proliferació alta de limfòcits B madurs, i és considerada un dels limfomes no Hodgkin (LNH) més agressius amb una supervivència mitjana de 3-4 anys. L’evolució clínica acostuma a ser molt agressiva amb poca resposta al tractament i freqüent recidiva; són pocs els pacients que es curen amb les teràpies actuals. Tot i així, observacions clíniques recents han identificat alguns LCM amb un curs clínic indolent de la malaltia i una llarga supervivència dels pacients, inclòs sense la necessitat de tractament. Estudis d’expressió gènica diferencial han identificat que SOX11, un factor de transcripció neuronal, és un dels gens més ben caracteritzats per diferenciar els subtipus de LCM agressius i indolents ja que se sobre-expressa en els LCM agressius però no en els indolents. SOX11 pertany a la família dels gens SOX que codifiquen per possibles reguladors transcripcionals que desenvolupen funcions importants en diferents processos del desenvolupament. La funció de SOX11 i molts altres membres de la superfamília de proteïnes SOX actualment no es coneix, tot i que es creu que la funció de les proteïnes SOX és, almenys, en part estructural permetent que altres factors de transcripció s’uneixin al solc format a l’ADN i/o reunint elements reguladors, el que facilita la formació de complexes proteics. SOX11 se sobre-expressa constantment en gairebé tots els tumors de LCM agressius, a nivells inferiors en un subgrup de limfomes de Burkitt i limfoblàstics, però no en altres neoplàsies limfoides, en cèl·lules limfoides normals ni en pacients de LCM que segueixen una llarga evolució clínica indolent. Per tant, SOX11 ha estat identificat com a biomarcador en els tumors de LCM i possible factor pronòstic. Tot i que la funció de SOX11 i els seus possibles gens diana en cèl·lules limfoides es desconeixen, la seva alta expressió en els LCM agressius suggereix que SOX11 pot ser un element important en el desenvolupament i progressió d’aquest tumor. Per tant, els objectius d’aquest projecte de tesi doctoral són identificar, caracteritzar i validar les possibles vies oncogèniques regulades per SOX11 per obtenir un millor i major coneixement de la patogènesi del LCM, i trobar possibles candidats per a teràpies específiques per aquest tumor. Per realitzar aquests objectius hem estudiat els gens directament regulats per SOX11 mitjançant immunoprecipitació de cromatina,així com el fenotip associat a la pèrdua de l’expressió de SOX11 en línies cel·lulars de LCM establement transduïdes (model in vitro). A més a més, també hem estudiat l’habilitat tumorigènica de SOX11 mitjançant el xenotransplantament subcutani de les línies cel·lulars generades in vitro en ratolins immunodeficients (SCID) (model in vivo). Un cop hem identificat els possibles gens diana i les vies oncogèniques regulades per SOX11 mitjançant els models in vitro i in vivo, els hem validat en tumors humans primaris del LCM. S’han obtingut dos treballs d’investigació dels estudis que composen aquesta tesi doctoral, publicats a la prestigiosa revista d’hematologia Blood els anys 2013 i 2014. En ambdós treballs hem estudiat els mecanismes moleculars regulats per SOX11 responsables de la patogènesi i el desenvolupament maligne del LCM. El primer treball es centra en la caracterització del bloqueig del desenvolupament dels limfòcits B madurs degut a la sobre-expressió de SOX11 en el LCM, suggerint un diferent desenvolupament en la formació dels subtipus de LCM agressius i indolents. A més, també demostrem que SOX11 és indispensable pel creixement del LCM ja que tumors SOX11-negatius inoculats en ratolins SCID presenten un creixement menor comparat amb els tumors SOX11-positius. En el segon treball hem identificat, per primera vegada, la funció oncogènica de SOX11 en el LCM ja que regula processos angiogènics responsables del major creixement de les cèl·lules SOX11-positives. D’altra banda també mostrem noves aproximacions terapèutiques per aquest tipus de tumor que ajudarien a una millor estratificació i classificació dels pacients de LCM. Al primer article ens hem centrat en identificar les possibles funcions biològiques de SOX11 en el LCM. Combinant anàlisis de microarray d’immunoprecipitació de cromatina i perfil d’expressió diferencial després de silenciar l’expressió de SOX11, hem identificat gens diana i programes transcripcionals regulats per SOX11, incloent el bloqueig de la diferenciació de la cèl·lula B madura, la modulació del cicle cel·lular, l’apoptosi i el desenvolupament de cèl·lules mare. PAX5 apareix com un dels gens diana directes més significatius de SOX11. El silenciament de SOX11 disminueix l’expressió de PAX5, indueix la de BLIMP1 i promou el canvi de fenotip de cèl·lula B madura a la diferenciació plasmacítica inicial, tant en cèl·lules tumorals primàries del LCM com en un model in vitro. Els nostres resultats suggereixen que SOX11 contribueix al desenvolupament tumoral mitjançant la modulació del programa de la diferenciació terminal de la cèl·lula B en el LCM. A més, hem demostrat l’habilitat tumorigènica de SOX11 in vivo mitjançant un model de xenotransplantament de LCM en ratolins SCID. La reducció significativa del creixement tumoral de les cèl·lules amb expressió de SOX11 silenciada comparada amb el creixement de les cèl·lules de LCM amb alts nivells d’expressió de SOX11 dels xenotransplantaments, demostra la implicació de l’expressió de SOX11 en el comportament agressiu d’aquest limfoma. SOX11 se sobre-expressa en diferents tumors sòlids i en la majoria de LCM agressius. En el primer article constituent d’aquesta tesi doctoral hem demostrat que el silenciament de l’expressió de SOX11 redueix el creixement tumoral en un model de xenotransplantament, consistent amb el curs clínic indolent dels pacients del LCM SOX11-negatius. Tot i així, els mecanismes oncogènics directament regulats per SOX11 encara no s’han descrit. Per tant, en el segon treball ens hem centrat en la identificació i caracterització molecular de dits mecanismes. Hem observat que els tumors dels xenotransplantaments murins així com de pacients de LCM SOX11-positius estan enriquits en vies gèniques relacionades amb l’angiogènesi, i presenten una major densitat de microvasos comparada amb els tumors derivats dels xenotransplantaments i els tumors humans primaris SOX11-negatius. A més, el medi cel·lular condicionat derivat de cèl·lules SOX11-positives indueix una major proliferació, migració, formació de tubs, i activació de vies de senyalització angiogèniques en cèl·lules endotelials in vitro. Hem identificat el factor pro-angiogènic PDGFA com un gen diana directe de SOX11 en cèl·lules de LCM, la inhibició del qual elimina els efectes angiogènics accentuats en cèl·lules endotelials in vitro. Per altra banda, PDGFA està sobre-expressat en cèl·lules SOX11-positives tant en cultius cel·lulars de LCM, xenotransplantaments com en pacients de LCM. In vivo, el tractament dels xenotransplantaments SOX11-positius amb el fàrmac imatinib, un inhibidor del receptor de PDGFA, disminueix la neo-vascularització i el creixement tumoral de dites cèl·lules, equilibrant-lo al creixement tumoral de les cèl·lules SOX11-negatives. El nostre estudi identifica, per primera vegada, que SOX11 regula senyals de supervivència angiogèniques en el LCM, demostrant la seva implicació oncogènica en el comportament i progressió agressius d’aquest tumor maligne. A més a més, recalca la via SOX11-PDGFA com una possible diana terapèutica pel subtipus agressiu del LCM, una malaltia en la que encara actualment hi ha poques opcions terapèutiques duradores i complertes. En general, les conclusions d’aquest treball de tesi doctoral han estat les següents: 1. Identificació dels gens diana i les vies transcripcionals regulades per SOX11 en el LCM mitjançant experiments in vitro i in vivo. 2. Caracterització del bloqueig de la diferenciació dels limfòcits B madurs com a mecanisme del desenvolupament dels diferents subtipus de LCM agressius i indolents. Dit bloqueig està mediat per la sobre-expressió de PAX5 mitjançant SOX11. 3. Demostració de la implicació oncogènica de SOX11 en la patogènesi del LCM. 4. Caracterització de la regulació de processos angiogènics per part de SOX11 com a mecanisme oncogènic responsable del creixement tumoral del LCM agressiu. Dita regulació està mediada per la sobre-expressió de PDGFA mitjançant SOX11. 5. Identificació de possibles noves dianes terapèutiques en el LCM.

Diversos estudios realizados en pacientes médicos y quirúrgicos demuestran que la hospitalización en si misma es un factor relacionado con el deterioro funcional de los pacientes ancianos. La Hipótesis general de esta memoria es que si un paciente de estas características ingresa en una Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) este hecho comporta un deterioro funcional más acusado que el de un ingreso convencional especialmente en los más mayores y la mortalidad tanto intra como extrahospitalaria debe ser elevada. Es esperable que la recuperación funcional post alta de la UCI sea lenta e incompleta especialmente en los más ancianos. Deben existir factores predictivos clínicos y/o biológicos que permitan predecir el grado de recuperación funcional de estos pacientes y es esperable un incremento en la incidencia de síndromes geriátricos. El objetivo general de este trabajo es conocer el impacto que causa la hospitalización en una UCI sobre la autonomía funcional y calidad de vida de pacientes mayores a lo largo de los 12 meses siguientes al alta hospitalaria. Como objetivos concretos : • Analizar la mortalidad hospitalaria y acumulada a los 3, 6 y 12 meses posterior al alta de la UCI de pacientes mayores de 65 años y valorar las diferencias con el grupo de pacientes mayores de 75 años. • Identificar factores predictivos de mortalidad en pacientes mayores de 65 años después de un ingreso por patología médica en la UCI. • Evaluar el estado funcional y la calidad de vida a los 3, 6 y 12 meses después del alta de una UCI médica. • Identificar los factores predictivos de buena o mala evolución funcional de estos pacientes tras el ingreso en una UCI médica. • Evaluar la prevalencia e incidencia de síndromes geriátricos en estos pacientes Se evaluaron de forma prospectiva los pacientes mayores de 65 años ingresados en el Área de Vigilancia Intensiva (AVI) del Hospital Clínico de Barcelona por una patología médica. El criterio de inclusión hace referencia a todos aquellos pacientes mayores de 65 años que ingresan en la AVI por patología médica con una situación funcional basal preservada (Índice de Barthel ≥ 60). Se excluyó a los pacientes que ingresaron de forma electiva (postoperatorio electivo), después de la recuperación de un paro cardiorespiratorio o aquellos con una enfermedad de base con un pronóstico de vida inferior a un año. A todos los pacientes se les realizó un estudio clínico, valoración geriátrica integral, valoración de la intensidad terapéutica y valoración de la calidad de vida. Nuestros resultados demuestran que la tasa de supervivencia tras un ingreso en la UCI a los 12 meses en ancianos sanos es baja. Sin embargo observamos que entre aquellos que sobreviven al menos un año, más de dos terceras partes preservan un nivel de autonomía funcional y calidad de vida similar en comparación a su situación de base. A su vez el nivel funcional (Índice de Barthel) y la calidad de vida (EQ- 5D) en el momento del alta hospitalaria son los mejores factores predictivos para una recuperación funcional plena a largo plazo. Por otra parte sugieren firmemente que la fragilidad preclínica antes del ingreso en UCI reflejada por una puntuación más baja en el Índice de Lawton puede ser un buen marcador para identificar una población con un alto riesgo de experimentar una mala evolución tras el alta. Los pacientes con una supervivencia inferior al año eran más mayores, habían requerido con mayor frecuencia ventilación mecánica y tenían una capacidad funcional basal peor (Índice de Lawton y EQ-5D). / Several studies carried out on medical and surgical patients show that hospitalisation is a key factor contributing to the functional deterioration of elderly patients. The general hypothesis of this paper is that elderly patients hospitalised in an intensive care unit (ICU) suffer from greater functional deterioration than those in conventional units, especially in cases of older patients, and that intra and extrahospital mortality is also higher. Patients’ recovery is expected to be slower and incomplete, particularly in the case of older patients. Clinical and biological factors should allow the level of recovery to be predicted, while an increase in geriatric symptons is envisaged. This paper aims to ascertain the impact of hospitalisation in an ICU on the functional autonomy and quality of life of elderly patients in the 12 months following discharge, and specifically: • To analyse hospital and accumulated mortality in the 3, 6 and 12 months following discharge from an ICU in patients aged over 65, and assess differences regarding the group of patients aged over 75. • To pinpoint predictive factors of mortality in patients aged over 65 after they are hospitalised in an ICU due to a medical pathology . • To assess patients’ functional state and quality of life 3, 6 and 12 months following discharge from an ICU. • To pinpoint predictive factors of satisfactory or unsatisfactory functional evolution in these patients after hospitalisation. • To assess the incidence of geriatric syndromes in these patients. A pilot analysis was carried out on patientes aged over 65 hospitalised due to a medical pathology in the ICU of the Hospital Clínic in Barcelona. The inclusion criterion was all patients aged over 65 hospitalised due to a medical pathology with a preserved baseline functional situation (Barthel Scale ≥ 60). The study excludes patients that chose to be hospitalised (post-operatory) after suffering a cardiac arrest, and those with a baseline illness whose life expectancy was less than a year. A clinical analysis, comprehensive geriatric assessment, therapeutic intensity assessment and quality of life assessment was carried out on all patients. Our results show that the survival rate of healthy elderly patients in the 12 months following hospitalisation in an ICU is low. However, the level of functional autonomy and quality of life of over two-thirds of the patients that survive at least one year is similar to those of their baseline situation. The functional level (Barthel Scale) and quality of life (EQ-5D) on discharge are the best long-term predictive factors. Moreover, they indicate that pre-clinical frailty before hospitalisation reflected by a low socre on the Lawton Scale is a reliable indicator of patients with a higher risk of progressing unsatisfactorily following discharge. Patients surviving less than one year were older, had required more frequent mechanical breathing assistance and had a lower baseline functional capacity (Lawton Scale and EQ-5D).

Tesi realitzada a l'Institut Català d'Oncologia (ICO) / Esta tesis versa sobre el desarrollo clínico del anticuerpo monoclonal Cetuximab en el tratamiento del carcinoma escamoso de cabeza y cuello, en diferentes momentos de la enfermedad. En la enfermedad recurrente y metastásica, se ha realizado un estudio fase III que comparó en 1ª línea tratamiento la asociación de quimioterapia sola (esquema con Platino y 5-FU) con el mismo esquema de quimioterapia asociado a Cetuximab (esquema EXTREME). Los resultados de eficacia favoreciereon la combinación de quimioterapia con cetuximab, sin excesiva adición de toxicidad y sin repercusión en la calidad de vida evaluada por los propios pacientes. Las conclusiones han sido: 1. En comparación con el esquema de platino/fluorouracilo, la misma combinación con cetuximab mejora de forma significativa la supervivencia global en primera línea de la enfermedad recurrente/metastásica. 2. Todos los demás parámetros de eficacia (supervivencia libre de progresión, mejor respuesta global, control de la enfermedad y tiempo al fallo terapéutico) también favorecieron a la combinación con cetuximab. 3. EXTREME añade las toxicidades propias de cetuximab: cutánea, infusionales e hipomagnesisemia. Además, existe un 5% de sepsis en los pacientes con la combinación que no se dan en el grupo de QT sola. 4. La adición de cetuximab a la QT con platino/fluorouracilo no afecta de forma adversa la calidad de vida de los pacientes con enfermedad recurrente/metastásica. Además, mejoran algunos de los síntomas asociados al CECC (como el dolor o la deglución), por lo que le dan más relevancia a la combinación en una fase de la enfermedad donde el control sintomático es fundamental. 5. El número de copias del EGFR tumoral no es un biomarcador predictivo de la eficacia de la combinación de cetuximab, platino y FU en primera línea de la enfermedad recurrente/metastásica. Por tanto, el análisis de este parámetro antes del inicio de un tratamiento no aportará ninguna información relevante al clínico. Por tanto, también podemos decir que el beneficio asociado a la combinación de quimioterapia y cetuximab es independiente del número de copias del EGFR. El segundo estudio fue en enfermedad localmente avanzada, específicamente en cáncer de orofaringe y fue un estudio fase II randomizado que evaluó la eficacia y la toxicidad de la adición de 12 semanas de tratamiento adyuvante con Cetuximab semanal una vez finalizado un tratamiento concomitante con radioterapia y cetuximab. Aunque el control loco-regional al año fue un 12% superior en la rama de cetuximab adyuvante, no existieron diferencias en ningún parámetro de eficacia a partir del segundo año. Por tanto la conclusión fue, doce semanas de tratamiento adyuvante con cetuximab tras un tratamiento radical con RT + cetuximab es posible y seguro, y mejora el control de la enfermedad al final del tratamiento, y el control loco-regional al primer año. No obstante, el bloqueo en solitario del EGFR durante 12 semanas no es suficiente para eliminar la enfermedad mínima residual tras el tratamiento radical y por tanto no es capaz de mantener ese mayor control en el tiempo, con un incremento de recidivas loco-regionales en el segundo año de seguimiento, y ningún impacto sobre la supervivencia. / This thesis deals on the clinical development of the monoclonal antibody Cetuximab for the treatment of squamous cell carcinoma of head and neck, at different stages of the disease. In metastatic/recurrent disease, there has been a phase III study that compared in 1st line treatment a combination of chemotherapy alone (schema with Platinum and 5-FU) with the same scheme of chemotherapy associated with Cetuximab (schema EXTREME). The conclusions have been: 1. In comparison with the Platinum/fluorouracil, the same combination with cetuximab significantly improves overall survival. 2. All other parameters of efficacy (progression free survival,best overall response, control of the disease) also favored the combination with cetuximab. 3. EXTREME toxicities of cetuximab added: skin, infusionales and hipomagnesisemia. 4. The addition of cetuximab to the chemotherapy with Platinum/fluorouracil form does not affect adversely the quality of life of patients with recurrent/metastatic disease. 5. EGFR copy number is not a predictive biomarker of the efficacy of the combination of cetuximab, Platinum and FU in recurrent/metastatic disease. The second study in locally advanced disease, specifically in oropharyngeal cancer and was a randomized phase II study that evaluated the efficacy and the toxicity of the addition of 12 weeks of adjuvant treatment with Cetuximab weekly once completed a concomitant treatment with radiotherapy and cetuximab. Although a year locoregional control was a 12% higher in the branch of adjuvant cetuximab, there were no differences in any parameter of efficiency from the second year. Therefore the conclusion was, twelve weeks of adjuvant treatment with cetuximab after radical treatment with RT + cetuximab is possible and secure, and improves the control of the disease at the end of the treatment, and first-year locoregional control. However, the blockade of EGFR during 12 weeks alone is not enough to eliminate minimal residual disease after radical treatment and therefore is not able to maintain greater control over time, with increased loco-regional recurrences in the second year of follow-up, and no impact on survival.

Tesis por compendio de publicaciones / OBJETIVOS: Objetivo 1: Investigar la relación entre la pérdida de peso y la ritmicidad circadiana, utilizando la temperatura de la muñeca y mediciones de actimetría, en mujeres sometidas a un programa de pérdida de peso, con el fin de evaluar si la ritmicidad circadiana pudiera ser un marcador de la eficacia de los tratamientos de pérdida de peso. Objetivo 2: Investigar los efectos de los cambios en el horario de las comidas sobre el gasto de energía, la tolerancia a la glucosa y variables circadianas. Objetivo 3: Determinar, si la presencia de CLOCK 3111T/C en mujeres con sobrepeso está relacionado con (a) trastornos circadianos, y (b) cambios en la calidad del sueño, para mejorar la comprensión de las asociaciones previamente demostradas con la obesidad y la reducción de la pérdida de peso de las portadoras C. METODOS: I. Para la consecución del objetivo 1: Participaron 85 mujeres ( IMC: 30.24 ± 4.95 kgm-2) sometidas a un programa de reducción de peso. La eficacia del tratamiento se definió mediante: la pérdida de peso total, el porcentaje de pérdida de peso respecto al peso inicial y la pérdida de peso semanal. La ritmicidad circadiana se determinó mediante: temperatura de la muñeca, actividad motora y posición del cuerpo. II. Para la consecución del objetivo 2: 32 mujeres [edad 24 ± 4 e IMC 22,9 ± 2,6 kg/m2] participaron en este estudió. Se diseñaron dos protocolos de forma aleatoria y cruzada. Para el protocolo (P1) (n = 10) se realizaron medidas de gasto energético en reposo mediante calorimetría indirecta y tolerancia a la glucosa durante el periodo postprandial, para el protocolo (P2) se incluyeron mediciones relacionadas con el sistema circadiano basados en perfiles de cortisol salivar y temperatura medida en la muñeca (n = 22). A los participantes se les proporcionó comidas estandarizadas durante las dos semanas de intervención y se estudiaron bajo dos condiciones: comiendo temprano (13:00h) y comiendo tarde (16:30h). III. Para la consecución del objetivo 3: Se reclutaron 85 mujeres con sobrepeso, [edad 43 ± 12 e IMC 28,6 ±4,3 kg/m2]. Las variables de temperatura de muñeca (T), actimetría (A), posición del cuerpo (P) y TAP se midieron como marcadores de la funcionalidad sistema circadiano. Se completó un cuestionario de actividad, un registro de comida y sueño diario, mientras que la calidad del sueño se determinó mediante polisomnografía domiciliaria. De esta muestra, 43 mujeres portaban el SNP del alelo menor (C) para CLOCK 3111 y 42 mujeres eran no portadoras de dicho alelo (TT). Ambos grupos de pacientes estaban igualados en número, edad, parámetros de obesidad e ingesta de energía. CONCLUSIONES: [I] Los ritmos circadianos en el inicio del tratamiento son buenos indicadores de la futura pérdida de peso. El tratamiento adicional debe considerar aspectos cronobiológicos para diagnosticar la obesidad y la eficacia de los tratamientos. [II] Comer tarde se asoció con una disminución del gasto energético en reposo, una disminución de la oxidación de carbohidratos en ayunas, disminución de tolerancia a la glucosa, con un perfil diario más aplanado en las concentraciones de cortisol libre y una disminución del efecto térmico de los alimentos según la temperatura periférica medida en la muñeca. Estos resultados pueden estar implicados en los efectos diferenciales de horario de las comidas en la salud metabólica. [III] Individuos portadores del alelo menor C del CLOCK 3111 presentan un ritmo circadiano menos robusto que el TT y una acrofase retrasada que caracteriza a los sujetos con cronotipo vespertino. Apoyamos la idea de que la identificación de genotipos de reloj en los pacientes puede ayudar al terapeuta en la caracterización de las raíces del problema metabólico. / OBJECTIVES: Objective 1: To investigate the potential relationship between weight loss and circadian rhythmicity, using wrist temperature and actimetry measurements, in women undergoing a weight-loss program, in order to assess whether circadian rhythmicity could be a marker of weight-loss effectiveness. Objective 2: To investigate the effects of changes in meal timing on energy-expenditure, glucose-tolerance and circadian-related variables. Objective 3: Determine, in free-living conditions, if the presence of CLOCK 3111C in overweight women could be related to (a) circadian disorders, and (b) changes in sleep quality, to improve understanding of the previously demonstrated associations with obesity and reduced weight loss of the C carriers. METHODS: I. To get the objective 1: Participants were 85 overweight and obese women (body mass index, BMI: 30.24±4.95 kg m-2) subjected to a weight reduction program. Efficacy of the treatment was defined as total weight loss, percentage of initial weight and weekly weight loss rates. Circadian rhythmicity in wrist temperature motor activity and position were analyzed using different sensors. II. To get the objective 2: Thirty-two women (aged 24 ± 4 years and body mass index 22.9 ± 2.6 kgm− 2) completed two randomized, crossover protocols: one protocol (P1) including assessment of resting-energy expenditure (indirect-calorimetry) and glucose tolerance (mixed-meal test) (n = 10), the other (P2) including circadian-related measurements based on profiles in salivary cortisol and wrist temperature (Twrist) (n = 22). In each protocol, participants were provided with standardized meals (breakfast, lunch and dinner) during the two meal intervention weeks and were studied under two lunch-eating conditions: Early Eating (EE; lunch at 13:00) and Late Eating (LE; lunch 16:30). III. To get the objective 3: Wrist temperature, actimetry and position (TAP) and TAP variables were measured as markers of circadian functionality during 8 consecutive days. A rest–activity and food diary was also completed, whereas sleep quality was determined by domiciliary polysomnography. We recruited 85 women who were overweight with body mass index (BMI) of 28.59±4.30 kg m-2 and age 43±12 years. From this sample, we found that 43 women were carrying the minor allele (C) for CLOCK 3111T/C SNP and 42 women were TT carriers (major allele carriers). Both groups of patients were matched for number, age, obesity parameters and energy intake. CONCLUSIONS: [I] Circadian rhythms at the beginning of the treatment are good predictors of future weight loss. Further treatment should consider chronobiological aspects to diagnose obesity and effectiveness of treatments. [II] Eating late is associated with decreased resting-energy expenditure, decreased fasting carbohydrate oxidation, decreased glucose tolerance, blunted daily profile in free cortisol concentrations and decreased thermal effect of food on Twrist. These results may be implicated in the differential effects of meal timing on metabolic health. [III] C genetic variants in CLOCK 3111T/C display a less robust circadian rhythm than TT and a delayed acrophase that characterizes ‘evening-type’ subjects. We support the notion that identifying CLOCK genotypes in patients may assist the therapist in characterization of the roots of the metabolic problem.

L’hèrnia incisional (HI) abdominal és una de les complicacions més freqüents secundàries a una intervenció quirúrgica abdominal. L’elevat nombre d’intervencions d’aquest tipus que es realitzen anualment als hospitals, a més de les taxes elevades d’incidència i recurrència, són responsables que aquest desordre generi una despesa econòmica important per al Sistema Nacional de Salut. Generalment, l’aparició de l’HI s’atribueix a factors tècnics durant l’operació, com el tipus d’incisió practicada o el tipus de tancament aplicat. De tota manera, hi ha prou evidències per considerar que, almenys en un subgrup de pacients, podria haver-hi una alteració del teixit connectiu subjacent que permetria parlar d’una biologia de l`hèrnia. Estudis recents han evidenciat l’associació entre malalties associades amb alteracions en el col·lagen i una major probabilitat d’aparició de l’HI. En aquest sentit, s’ha analitzat algunes molècules relacionades amb el metabolisme de la matriu extracel·lular (MEC) dels teixits abdominals però sense arribar a la profunditat molecular d’altres tipus d’hèrnies, com la inguinal. De tota manera, l’evidència de factors de risc inherents al pacient o externs, com la infecció, sembla que podrien afavorir la formació de l’HI i posen de manifest que el problema va més enllà d’un desordre en el col·lagen. El fibroblast, com a cèl·lula predominant del teixit connectiu, podria ser la cèl·lula majoritàriament implicada en el procés i en la resposta al tractament mitjançant malles quirúrgiques. La identificació del fenotip alterat dels fibroblasts procedents dels teixits abdominals podria posar al descobert una sèrie de rutes implicades en el procés de formació de l’HI. En la present tesi es pretén millorar el coneixement del procés d’iniciació i formació de l’HI a través de la identificació de les alteracions al nivell cel·lular i molecular que afecten els teixits que conformen la paret abdominal. A més, també es pretén millorar el coneixement de la resposta cel·lular al tractament amb malles quirúrgiques per identificar les rutes implicades en la biointegració. Es van analitzar biòpsies de múscul esquelètic i d’aponeurosi de la zona abdominal de pacients amb HI i es van comparar amb els de pacients sense HI. També es va comparar els perfils d’expressió gènica dels fibroblasts primaris procedents d’ambdós grups de pacients. Finalment, es va comparar el comportament dels fibroblasts procedents d’aponeurosi d’ambdós grups de pacients en contacte amb malles de polipropilè utilitzades per al tractament de l’HI. S’ha observat una desestructuració dels teixits abdominals dels pacients amb HI, en comparació amb els de pacients sense HI, a més d’unes alteracions en el metabolisme de la MEC associades a una desregulació en la senyalització molecular inflamatòria. Concretament, s’ha observat una relació MMPs/TIMPs alterada en favor d’una major activitat proteolítica i una desregulació dels nivells i la regulació d’algunes citocines pro-inflamatòries. Aquests alteracions són teixit-específiques però desemboquen en conseqüències similars. A més, s’ha identificat un perfil d’expressió gènica diferencial mitjançant l’ús de xips d’expressió gènica en els fibroblasts procedents dels teixits abdominals. S’ha observat que les rutes alterades en els fibroblasts procedents d’aponeurosi guarden relació amb el cicle cel·lular i la reparació del dany cel·lular, mentre que en el múscul esquelètic participen en la resposta immunològica. A més, s’han identificat un conjunt de gens que poden tenir una importància destacada en el procés de formació de l’HI. Finalment, s’ha establert un model d’estudi in vitro de la interacció dels fibroblasts primaris procedents d’aponeurosi amb malles quirúrgiques de polipropilè. S’ha observat que l’adhesió cel·lular és feble i que podria produir canvis en l’organització de molècules del citoesquelet que podrien desembocar en la mort cel·lular. A més, la malla de polipropilè podria modificar el cicle cel·lular alterat dels fibroblasts de pacients amb HI atenuant el seu fenotip. / Abdominal incisional hernia (HI) is one of the most common complications of abdominal surgery. The large number of this type of interventions performed annually at hospitals, in addition to high incidence and recurrence rates, are responsible for a significant economic cost to the National Health System. Usually, IH is attributed to technical-related risk factors, such as the type of incision practiced or the applied closure procedure. However, there are sufficient evidences that suggest a biological underlying connective tissue disorder, so-called the biology of hernia, at least in a subset of patients. Recent studies demonstrated the association between collagen diseases and higher IH occurrence rates. Several molecules related to the metabolism of extracellular matrix (ECM) of abdominal tissues have been analyzed, without the molecular complexity achieved in other types of hernia, including groin hernias. However, evidences for patient-related risk factors and also external factors, such as infection, which might seem to favour IH formation suggest that this complication goes beyond a disorder of collagen. The fibroblast is the mostly abundant connective tissue cell and might be mainly involved in the process of IH formation and also in the response to treatment with surgical meshes. The identification of an altered phenotype of fibroblasts from the abdominal tissues may reveal a considerable number of pathways involved in the process of IH formation. The present thesis aims to improve the knowledge of the initiation and formation of IH through identifying cellular and molecular alterations that affect abdominal wall tissues. It also aims to improve the understanding of the cellular response of fibroblast interaction with surgical meshes used for IH treatment in order to identify the routes involved in biointegration. Biopsies from abdominal skeletal muscle and aponeurosis tissues of IH patients were analyzed and compared with those of non-IH patients. The gene expression profiles of skeletal muscle and aponeurosis primary fibroblasts extracted from both patients were also compared. Finally, the behaviour of the aponeurosis fibroblasts from both patients in contact with polypropylene meshes used for IH treatment were compared. A dysfunction in abdominal tissues of IH patients, compared with non-IH patients, in addition to some alterations in the ECM metabolism associated with inflammatory molecular signalling deregulation has been observed. Specifically, an altered MMPs/TIMPs balance in favour of net proteolytic activity and a deregulated signalling and levels of certain pro-inflammatory cytokines has been found. Although these changes are tissue-specific lead to similar consequences. In addition, a differential gene expression profile using DNA microarrays has been identified in fibroblasts from IH abdominal tissues. It has been observed that the altered pathways obtained in fibroblasts from aponeurosis are related to cell cycle and cellular damage repair while in fibroblasts from skeletal muscle are involved in the immune response. In addition, a set of genes that may have a significant relevance in the process of IH formation have been identified. Finally, an in vitro model for studying the interaction between aponeurosis primary fibroblasts and polypropylene meshes has been established. It has been observed that cell adhesion to meshes is weak and could lead to changes in cytoskeletal molecules organization that could lead to cell death. In addition, the polypropylene mesh may modify the altered cell cycle of fibroblasts form IH patients mitigating their phenotype.

OBJECTIU: El nostre objectiu va ser investigar la correlació entre els patrons de creixement de perímetre cefàlic (PC) i l'evolució neurològica entre diferents presentacions etiològiques de microcefàlia en pacients pediàtrics. PACIENTS I MÈTODES: 3.269 gràfiques de PC de pacients d'una Unitat de Neuropediatria terciària van ser revisades i 136 participants microcefàlics seleccionats. Utilitzant les puntuacions Z de les mesures de PC registrades vam definir les variables: PC Mínim(HC min), Caiguda de PC (HC drop) i Recuperació de PC (HC catch-up). Els nens amb evidència de Discapacitat Intel·lectual (QI per sota de 71) van ser classificats dins del grup de Neurològicament Afectats i la resta dels participants en el de Neurològicament No Afectats. Classificàrem els pacients segons la causa de la microcefàlia dins els grups: Idiopàtica, Familiar, Sindròmica, Simptomàtica i Mixta. RESULTATS: Aplicant l'Anàlisi Discriminant es va definir una funció C com a C = PC mínim + Caiguda de PC amb un nivell de tall de C = -4.3. La variable Recuperació de PC no va afegir més informació discriminant a les altres dues. En la nostra cohort el 95% dels pacients amb resultats per sota d'aquest nivell, microcefàlia severa, van ser classificats dins del grup Afectats, mentre que la concordança global va ser del 66%. En els grups de simptomàtiques i mixtes la concordança entre la funció de PC i el resultat va arribar el 82% en contrast amb només el 54% en el grup d'idiopàtiques i sindròmiques (valor P = 0,0002). CONCLUSIONS: Hem definit una funció de creixement del PC que discrimina l'afectació neurològica de pacients microcefàlics pediàtrics millor que els valors de PC aïllats, especialment per a aquells amb etiologies simptomàtiques i mixtes. / OBJECTIVE: Our aim was to investigate the correlations between patterns of head circumference (HC) growth and neurological impairment among distinct ætiological presentations of microcephaly in paediatric patients. PATIENTS AND METHODS: 3,269 HC charts of patients from a tertiary Neuropaediatric Unit were reviewed and 136 microcephalic participants selected. Using the Z-scores of registered HC we defined the variables: HC Minimum, HC Drop and HC Catch-up. Children with evidence of intellectual (IQ below 71) were classified within the Neurologically Impaired group and the rest of participants within the Neurologically Not Impaired one. We classified patients according to the cause of microcephaly into: idiopathic, familial, syndromic, symptomatic and mixed. RESULTS: Using Discriminant Analysis a C-function was defined as C = HC min + HC drop with a cut-off level of C = –4.3. HC catch-up did not add any further discriminant information to the other two variables. In our cohort 95% of patients scoring below this level, severe microcephaly, were classified within the Impaired group while the overall concordance was 66 %. In the symptomatic-mixed group the concordance between HC function and outcome reached 82 % in contrast to only 54% in the idiopathic-syndromic group (P-value=0.0002). CONCLUSIONS: We defined a HC growth function which discriminates the neurological outcome of microcephalic patients better than isolated HC measurements, especially for those with symptomatic and mixed ætiologies.

Introducción: La obesidad es un grave problema de salud. México Ocupa el primer lugar en obesidad infantil, cerca del 40% de los niños padecen sobrepeso u obesidad, este se asocia a trastornos en los carbohidratos, diabetes tipo 2, dislipidemias, hipertensión arterial, esteatosis hepática y la posibilidad de Síndrome Metabólico. Objetivo: Identificar el posible efecto del sobrepeso u obesidad (SP u 0) sobre las alteraciones de los marcadores bioquímicos y hormonales e hígado graso en adolescentes de 12 a 15 años de edad. Material y Métodos: Estudio Transversal comparativo integrado por dos grupos 170 adolescentes con SP u O (grupo1) y 131 con peso normal (grupo 2) N=321, muestreo aleatorio estratificado de tres escuelas de secundaria de Satillo, Coahuila. Se incluyeron variables antropométricas, sociodemográficas, bioquímicas, hormonales y clínicas, así como ultrasonido hepático. Resultados: En cuanto al sexo y edad no hubo diferencias significativas entre ambos grupos. El antecedente de obesidad en alguno de los padres, presentó diferencia significativa (OR 2,67; IC: 1,54-4,63). En cuanto a las variables clínicas, resultaron con diferencia significativa el signo de acantosis nigricans (OR: 7,99; IC: 7,99- 17,46), e Hipertensión arterial diastólica 8,2% (OR: 9,50; EIC: 1,17- 76,94). Al analizar las variables bioquímicas hubo diferencia significativa en hipertrigliceridemia (OR: 7,56; IC: 2,50- 22,87) y HDL (19,28; IC: 2,50-148,17. En relación a las variables hormonales, hubo diferencia significativa en valores altos de insulina (OR: 17,87; IC: 6,73- 47,43) y el índice de HOMA/IR elevado (OR: 9,37; IC: 5,06- 17,35) y la presencia de esteatosis hepática por ultrasonido OR: 19,90 IC: 6,87- 58,07). En el 9% de los adolescentes con Sp u obesidad se integró el Síndrome Metabólico. Conclusiones: Es evidente el efecto nocivo que ejerce la obesidad sobre las alteraciones a nivel de los lípidos, carbohidratos, hipertensión arterial e hígado graso; todos ellos factores de riesgo cardiovascular. / Introduction: The obesity is a serious problem of health. Mexico Occupies the first place in infantile obesity, close to 40 % of the children they endure excess weight or obesity, this one associates with disorders in the carbohydrates, diabetes type 2, dislipidemias, arterial hypertension, esteatosis hepatic and the possibility of Metabolic Syndrome. Objective: To identify the possible effect of overweight or obesity (OW or 0) on the alterations of the biochemical and hormonal scoreboards and estatosis hepatic not alcoholic in adolescents from 12 to 15 years of age. Material and Methods: Comparative Transverse study integrated by two groups 170 adolescents with 0W or O (grupo1) and 131 with normal weight (group 2) N=321, stratified random sampling of three schools of secondary of Saltillo, Coahuila, México. There were included biochemical, hormonal scoreboards, sociodemophic, and clinics variables, and hepatic ultrasound. Results: As for the sex and age there were no significant differences between both groups. The obesity precedent in some of the parents, OR 2.67 presented significant difference (IC: 1.54-4.63). As for the clinical variables, there turned out to be with significant difference the sign of acantosis nigricans (0R: 7, 99; IC: 7.99 – 17. 46), and diastolic arterial Hypertension 8. 2 % (OR: 9.50; IC: 1.17- 76.94). On having analyzed the biochemical variables, there was significant difference in hipertrigliceridemia (OR: 7.56; IC: 2.50 – 22.87) and HDL (19.28; IC: 2.50-148.17. As regards the hormonal variables, there was significant difference in high values of insulin (OR: 17.87; IC: 6.73 – 47.43) and the index of high HOMA/IR (OR: 9,37; IC: 5,06 - 17,35) and the presence of hepatic esteatosis for ultrasound (OR: 19.90 IC: 6.87 – 58.07). In 9 % of the adolescents with overweight or obesity integrated the Metabolic Syndrome. Conclusions: There is clear the harmful effect that exercises the obesity on the alterations at level of the lipids, carbohydrates, arterial hypertension and hepatic esteatosis; all of them factors of cardiovascular risk.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / We studied the mechanisms driving the metastatic spread in colorectal cancer (CRC), focusing in the MAPK pathway. We developed in vivo a highly metastatic cell line using a KRAS-mutated cell line (SW620) in an ortothopic xenograft mouse model and used both in vivo and in vitro experiments to evaluate the mechanisms of metastasis. We also used data from two large prospective cohorts of incident CRC to evaluate the association of an intronic variant of SMAD7 (rs4939827, 18q21) with the phenotype and molecular characterisitics of CRC. In the first project, we inoculated SW620 luciferase-expressing cells into portal circulation of immunodeficient mice via intrasplenic injection followed by splenectomy, in order to isolate cell populations that target the liver. Comparative transcriptomic analysis identified 194 genes differentially expressed between the parental and the highly metastatic cell line. We found pathways of nitrogen metabolism, cell adhesion molecules and mitogen-activated protein kinases (MAPKs). Downregulation of ERK2 (but not of ERK1) in the highly metastatic cell line reverted its metastatic capacity to the liver, but not to the lung in our mice model. We thus hypothesized that the ability to metastasize the lung by the highly metastatic derivative had to be driven by other mechanism. The expression of parathyroid hormone-like hormone (PTHLH) was upregulated in our highly metastatic derivative and was inversely correlated with the expression of MKK6. Downregulation of PHTLH in the highly metastatic derivative decreased its capacity to colonize the lung without decreasing its capacity to colonize the liver after intra portal inoculation. We evidenced that PTHLH induced apoptosis of human pulmonary endothelial cells via apoptosis-inducing factor mitochondrion-associated 1. In the second project we evaluated the association of the SMAD7 intronic variant with tumor phenotype and several CRC molecular characteristics. We used 1509 CRC cases and 2307 age-matched controls nested within the Nurses Health Study (NHS) and the Health Professionals Follow-up Study (HPFS). We randomly selected between one and three matched controls. Among the 1509 cases with blood or buccal samples in this study, we were able to successfully obtain tissue suitable for molecular analyses in 658 cases. We genotyped rs4939827 (TaqMan) successfully in 98% of the samples in NHS and 99.6% of the samples in HPFS. The phenotipic features evaluated were: TNM stage, grade of differentiation, location of the primary tumor (colon vs. rectum) and age at diagnosis. The evaluated molecular characteristics were DNA methylation of RUNX3 and LINE-1 (long interspersed nucleotide element-1), CpG island methylator phenotype (CIMP), microsatellite instability, TP53 expression by immunohistochemistry and the mutational status of BRAF, KRAS and PIK3CA. We found that the minor allele (G) in rs4939827 was associated with a lower risk of developing tumor stage pT1 or pT2 CRC [multivariate odds ratio (OR), 0.73; 95% confidence interval (CI) 0.62-0.87] but not tumor stage pT3 or pT4 (multivariate OR, 1.07; 95% CI 0.93-1.23, P for heterogeneity = 1.2 x 10-4). The association between rs4939827 and CRC also significantly differed by methylation of RUNX3 (P for heterogeneity = 0.005). Among those with CRC, the minor allele (G) in rs4939827 was significantly associated with poorer overall survival (hazards ratio, 1.20; 95% CI, 1.02-1.42). In conclusion, we provide clinical and molecular evidence showing that ERK2 activation provides colon cancer cells with the ability to seed and colonize the liver and reduced p38 MAPK signalling endows cancer cells with the ability to form lung metastasis from previously established liver lesions. We also show that patients with the rs4939827 CRC-susceptibility locus diagnosed with CRC tend to develop tumors with greater invasiveness (as measured by the pT stage). / Parte de esta investigación consiste en explorar los mecanismos involucrados en el patrón metastático de CCR. Asimismo usamos datos epidemiológicos donde evaluamos la asociación entre el polimorfismo intrónico de SMAD7 (rs4939827, 18q21) con el genotipo y características tumorales. En el primer proyecto usamos un modelo murino de metástasis hepáticas para crear un derivado celular con alto tropismo metastático a hígado y pulmón. Mediante análisis de expresión de genes usando chips de transcripción identificamos 194 genes diferencialmente expresados El análisis de muestras clínicas mostró que aquellos pacientes cuyo tumor presentaba bajos niveles de p38 sufrían una mayor frecuencia de metástasis al pulmón, pero no a otros órganos. Al tratar ratones que habían desarrollado metástasis hepáticas derivadas de la línea celular parental con un inhibidor específico de p38, vimos que se incrementaba la afinidad metastática al pulmón. Evidenciamos que p38, a través del silenciamiento de PTHLH, en el derivado celular altamente metastático disminuía su capacidad de colonizar el pulmón. Demostramos que PTHLH induce la apoptosis de células humanas de endotelio pulmonar a través del factor AIFM1, facilitando que las células metastáticas puedan extravasarse al pulmón. En el segundo proyecto evaluamos la asociación de un polimorfismo intrónico del gen SMAD7 con el fenotipo y varias características moleculares del tumor. Para ello empleamos 1509 casos de cáncer de colon y recto y 2307 controles emparejados anidados en las cohortes Nurses Health Study y Health Professionals Follow-up Study. Encontramos que el alelo de menor frecuencia de rs4939827 (G) se asociaba con un menor riesgo de desarrollar un CCR con un estadio pT1 o pT2 [razón de odds (OR) ajustada, 0.73; intervalo de confianza al 95\% (CI) 0.62-0.87] pero no con tumores con estadio pT3 o pT4 (OR ajustada, 1.07; 95\% CI 0.93-1.23, valor p de heterogeneidad = 1.2 x 10-4). La asociación entre el polimorfismo de rs4939827 y CCR también difería significativamente según la metilación de RUNX3 (valor p de heterogeneidad = 0.005). Entre aquellos pacientes diagnosticados con CCR, el alelo de menor frecuencia de rs4939827 (G) estaba significativamente asociado con peor supervivencia (hazards ratio, 1.20; 95\% CI, 1.02-1.42).

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive subtype of non-Hodgkin lymphomas associated with poor prognosis and frequent relapses. Recently, the neuronal transcription factor SOX11 has been identified as a very specific biomarker for MCL. SOX11 is constantly overexpressed in virtually all aggressive MCLs, and at lower levels in a subgroup of Burkitt lymphoma and acute lymphoblastic leukemia but not in other lymphoid neoplasms. SOX11 was found exclusively overexpressed in conventional MCL and totally absent in normal lymphoid cells or in MCL patients with indolent clinical course and prolonged survival. Although SOX11 function and potential target genes in lymphoid cells are poorly known, the highly specific expression in aggressive MCL suggests that it may be an important element in the development and progression of this tumor. Two publications resulted from our studies and compose this thesis. In paper I, we have studied the molecular mechanisms leading to the aberrant expression of SOX11 in aggressive MCL. MCL is one of the lymphoid neoplasms with highest number of genetic aberrations but none involving the SOX11 genomic region at chromosome 2p25. As no chromosomal changes affecting SOX11 locus were identified in MCL, we hypothesized that epigenetic events could lead to SOX11 aberrant overexpression. We performed a comprehensive SOX11 gene expression and epigenetic studies. We observed that SOX11 expression was associated with unmehtylated DNA and presence of activating histone marks (H3K9/14Ac and H3K4me3) in embryonic stem cells and some aggressive B-cell neoplasms, including MCL. Conversely, the loss of SOX11 expression in adult stem cells, normal hematopoietic cells and other lymphoid neoplasms was associated with the presence of silencing histone marks H3K9me2 and H3K27me3 with or without simultaneous DNA methylation. We concluded that the pathogenic role of SOX11 is associated with its de novo expression in some aggressive lymphoid malignancies, which is mediated by a shift from inactivating to activating histone modifications. In paper II, we have focused on uncovering putative biological functions of SOX11 in aggressive MCL. Using chromatin immunoprecipitation microarray analysis combined with gene expression profiling upon SOX11 knockdown, we identified target genes and transcriptional programs regulated by SOX11 including the block of mature B-cell differentiation, modulation of cell cycle, apoptosis, and stem cell development. PAX5 stood out as one of the major SOX11 direct target genes. SOX11 silencing downregulates PAX5, induces BLIMP1 expression, and promotes the shift from a mature B-cell into the initial plasmacytic differentiation phenotype in both MCL primary tumor cells and an in vitro model. Our results suggested that SOX11 contributes to tumor development by altering the terminal B-cell differentiation program of MCL cells. Moreover, we have demonstrated the tumorigenic ability of SOX11 in vivo, using a xenotransplant model of MCL in CB17-SCID mice. The significant reduction on tumor growth of the SOX11-silenced cells compared to the growth of control MCL cells in the xenograft experiments highlighted the implication of SOX11 expression in the aggressive behavior of this lymphoma. Overall our results demonstrated that SOX11 can act as oncogene in MCL. / El linfoma de células del manto (LCM) es un subtipo agresivo de linfoma non Hodgkin asociado a un mal pronóstico y recaídas frecuentes. Recientemente, el factor de transcripción neuronal SOX11 se ha identificado como un marcador muy específico de LCM. SOX11 se encuentra sobreexpresado constantemente en todos los LCM agresivos y en niveles más bajos en un subgrupo de Burkitt linfoma (BL) y leucemia linfoblástica aguda (LLA) aunque no en otros neoplasmas linfoides. SOX11 se encontró exclusivamente sobreexpresado en LMC convencionales y totalmente ausente en células linfoides normales o en pacientes LMC con un curso clínico indolente y una supervivencia prolongada. Aunque la función de SOX11 y sus genes potenciales dianas aún se desconocen, su elevada expresión específica en LCM sugiere que puede ser un elemento importante en la progresión y desarrollo de este tumor. Se han obtenidos dos publicaciones de los estudios que componen esta tesis. En el primer artículo hemos estudiado los mecanismos moleculares responsables de la expresión aberrante de SOX11 en LCM agresivo. El artículo I proporciona una caracterización exhaustiva de los mecanismos epigenéticos que conducen a la desregulación de SOX11 en estas neoplasias linfoides. En general se observó una significativa correlación inversa entre la metilación del promotor de SOX11 y la expresión de dicho gen. Sin embargo, en muchas muestras (células madre embrionarias, ESC, o adultas, células B normales y algunos LCM indolentes, leucemia linfática crónica y linfoma folicular) la expresión de SOX11 se vió reprimida a pesar de su estado no metilado. Estos hallazgos nos sugieren que la expresión de SOX11 no depende exclusivamente del estado de metilación del ADN del gen y nos llevó a estudiar mecanismos epigenéticos alternativos. Hemos observado que la expresión de SOX11 se asocia con la presencia de marcas de activación de las histonas (H3K9/14Ac y H3K4me3) en las células madre embrionarias y algunas neoplasias de células B agresivas. Por el contrario, en las muestras que no expresan SOX11, incluidas las células madre adultas, las células hematopoyéticas normales y diversas neoplasias linfoides, se observó que el promotor de SOX11 mostraba un enriquecimiento en las marcas de silenciamiento H3K9me2 y H3K27me3. El silenciamiento de SOX11 en líneas celulares fue revertido por el inhibidor de la histona deacetilasa (SAHA) pero no por el inhibidor de la ADN metiltransferasa (AZA). Estos datos indican que, como SOX11 no se expresa en las células linfoides normales, no metiladas, lo más probable es que la hipermetilación del ADN en algunos tumores sin expresión de SOX11 sea funcionalmente inerte, y podría estar asociada con la reducción de la plasticidad epigenética en células tumorales. También observamos que la expresión de novo de SOX11 se asocia con las neoplasias linfoides agresivas como el LCM, algunos subtipos de B-LLA y algunos casos de BL siendo este efecto mediado por un “switch” entre inactivación y activación de las modificaciones de las histonas. Además, como SOX11 se expresa fuertemente en las ESC, los datos sugieren que la expresión de SOX11 podría estar asociada con la adquisición de características de la cromatina similares a la de las células madre. En el artículo II nos hemos centrado en identificar las posibles funciones biológicas de SOX11 en LCM. Combinando análisis de microarray de immunopecipitación de cromatina y perfil de expresión diferencial después de silenciar SOX11, hemos identificado genes dianas y programas transcriptionales regulados por SOX11, incluyendo el bloqueo de la diferenciación de la célula B madura, la modulación de ciclo celular, apoptosis y desarrollo de célula madre. PAX5 destacó como uno de los genes diana directos de SOX11 más significativo. El silenciamiento de SOX11 downregula PAX5, induce la expresión de BLIMP1 y promueve el cambio de fenotipo de célula B madura a la diferenciación inicial plasmacítica, tanto en células tumorales primarias de LCM como en un modelo en vitro. Nuestros resultados sugieren que SOX11 contribuye al desarrollo tumoral mediante la modulación del programa de diferenciación terminal de célula B en LCM. Además, hemos demostrado la habilidad tumorigénica de SOX11 en vivo mediante un modelo de xenotrasplante de LCM en ratones CB17-SCID. La reducción significativa del crecimiento tumoral de las células con expresión de SOX11 silenciada comparada con el crecimiento de células de LCM con elevados niveles de expresión de SOX11 de los xenotrasplantes, demuestra la implicación de la expresión de SOX11 en el comportamiento agresivo de este linfoma. En conclusión, nuestros resultados demuestran que SOX11 puede actuar como oncogén en LCM.

Els nucleòtids extracel·lulars, com l’ATP, i els nucleòsids que deriven de la seva hidròlisi, com l’adenosina, estan àmpliament distribuïts en tots els òrgans i sistemes animals i estan considerats com a potents molècules senyalitzadores que, a través de receptors purinèrgics o purinoceptors (de tipus P1 i P2), intervenen en diverses funcions fisiològiques i fisiopatològiques de l’aparell reproductor. La concentració extracel·lular de nucleòtids i nucleòsids ve regulada per enzims de membrana anomenats ecto-nucleotidases, els quals hidrolitzen seqüencialment l’ATP fins a adenosina, controlant així, els seus nivells extracel·lulars i en conseqüència les vies de senyalització derivades de la unió d’aquests lligands als purinoceptors. Existeixen quatre famílies d’ecto-nucleotidases: a) la família de les ecto­nucleòsid trifosfat difosfohidrolases (E-NTPDases) o família CD39 consta de vuit membres (NTPDasa 1­8) quatre dels quals s’expressen a la membrana plasmàtica (NTPDasa 1, 2, 3 i 8) i hidrolitzen amb diferents afinitats l’ATP i l’ADP fins a AMP, b) la família de les ecto-nucleòtid pirofosfatases/fosfodiesterases (-E-NPPs) conté set membres (NPP 1-7) dels quals tres (NPP 1, 2 i 3) hidrolitzen l’ATP i l’ADP fins AMP, c) les fosfatases alcalines, catalitzen la degradació de nucleòtids tri­, di-i monofosfats indistintament, i d) la família de les 5’-nucleotidases o CD73 com a únic membre de membrana que actua extracel·lularment hidrolitzant l’AMP fins adenosina. S’entén per senyalització purinèrgica el conjunt d’efectes biològics (autocrins i paracrins) produïts per les purines i les pirimidines en actuar com a lligands extracel·lulars. I, al complex molecular implicat en l’activació, la conservació i la terminació de la senyalització purinèrgica se li ha donat el nom de Purinoma, i inclou tant els lligands, com els receptors, els transportadors /canals i els enzims de degradació. Estudis previs del nostre grup demostren expressió d’algunes de les ecto-nucleotidases més importants al sistema reproductor masculí. No es coneixia encara, però, el paper de les ecto-nucleotidases al sistema reproductor femení ni en les patologies relacionades amb aquest aparell com és el càncer d’endometri, aspectes que han estat estudiats en aquesta tesi doctoral. Així, a través de tècniques histològiques, immunològiques i moleculars, hem estudiat l’expressió gènica i proteica així com l’activitat de les ecto­nucleotidases a l’aparell reproductor femení, en el endometri funcional i atròfic humà, i en el càncer d’endometri. A més, hem posat a punt dos models cel·lulars (línies cel·lulars d’adenocarcinoma endometrial humà i cultius primaris de cèl·lules de l’estroma endometrial humà) on estudiar la regulació de les ecto-nucleotidases. Els nostres resultats mostren expressió i activitat d’aquests enzims a l’endometri amb marcades diferències al llarg del cicle i després de la menopausa, indicant una possible regulació hormonal d’aquestes. També hem detectat una elevada expressió de dues de les ecto-nucleotidases que controlen directament els nivells extracel·lulars d’adenosina, CD39 i CD73, en el carcinoma endometrial Tipus I i Tipus II evidenciant així el seu potencial us com a dianes terapèutiques en oncologia. Per tot això, proposem les ecto-nucleotidases com a possibles biomarcadors de fertilitat i amb utilitat pronòstica i diagnòstica de l’adenocarcinoma endometrial. / Extracellular ATP and its hydrolysis product adenosine, acting through specific receptors collectively named purinergic receptors, modulate various reproductive functions. There are four major groups of ecto-nucleotidases that control the levels of extracellular ATP and adenosine and thus their availability at purinergic receptors: a) ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases, b) ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase, c) ecto-5’­nucleotidase, and d) alkaline phosphatase. The Purinome is the molecular complex implicated in the triggering, maintenance and termination of the purinergic signalling which is the group of biological effects (autocrine or paracrine) produced by the purines and pyrimidines acting as a extracellular ligand and it is form by the ligands, receptors, transporters/channels and degrading enzymes. Previous studies of our group demonstrate expression of some of the most important ecto-nucleotidases in the male reproductive tract, but the role of the ecto-nucleotidases in the female reproductive system in health and disease were unknown. In this thesis, we have studied both aspects. We studied the gen and protein expression and the enzyme histochemistry of the main ecto-nucleotidases in the female reproductive tract, in the human cyclic (proliferative and secretory) and atrophic endometria, and in endometrial cancer. In addition, we have set up two cellular models (human endometrial adenocarcinoma cell lines and primary cultures of endometrial stromal cells) to study the regulation of the ecto-nucleotidases. Our results show expression and activity of these enzymes in the endometrium with marked changes along the cycle and after the menopause, indicating a hormonal regulation. Also we have detected an elevated expression of two of the ecto-nucleotidases that directly control the adenosine extracellular levels (CD39 and CD73), in the endometrial cancer type I and type II. Our results support the growing body of evidence that CD39 is a potential therapeutic target for cancer immunotherapy. And also reinforce the relevance of CD73 in tumors. We suggest that the ecto­nucleotidases can be used as a biological markers of fertility with prognostic and diagnostic utility in endometrial cancer.